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文檔簡介
瓊脂糖凝膠電泳
Agarosegelelectrophoresis
天然瓊脂(agar):又名瓊膠、菜燕、凍粉是從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。
瓊脂糖(agarose)半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì),不帶電荷D-半乳糖
核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一,用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段1.因不含硫酸根和羧基,幾乎消除了瓊脂的電滲2.對(duì)蛋白質(zhì)吸附極微,故無拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻,孔徑較大,可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。4.透明度較好,可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。5.不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量測定6.樣品易回收,常用于制備。瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳分離DNA的原理和方法DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷,在外加電場作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí),有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同,電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同,從而分出不同的區(qū)帶。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子,可以形成具有剛性的濾孔,凝膠孔徑的大小決定。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA,主要是利用分子篩效應(yīng),遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測。溴化乙錠(EthidiumBromide,
EB)為扁平狀分子,在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物,其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品質(zhì)粒DNA樣品。電泳儀,電泳槽,電子天平,移液器,槍頭,微波爐,紫外透射檢測儀等。瓊脂糖,1XTBE電泳緩沖液,溴化乙錠(EB),6X載樣緩沖液四、實(shí)驗(yàn)步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中,搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。(冷卻到60℃,加入100μl的0.5mg/mlEB,并搖勻。)⑵用膠帶將制膠板兩端封好,插入適當(dāng)梳子,將溶解的瓊脂糖(約50℃)倒入,室溫冷卻凝固。⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布,將凝膠置入電泳槽中,加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm,小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于封口膜上,再加入2μl的6X載樣緩沖液,混勻后,小心加入點(diǎn)樣孔。⑸打開電源開關(guān),調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm,可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng),電泳約30min-60min。123M4、凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠
溴化乙錠(EB)插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。5、所用的電壓
低電壓時(shí)DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。6、瓊脂糖種類
常見的有兩種:標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖;
不同類型瓊脂糖的性質(zhì)
瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/℃
標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35~3890~95不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40~4285~90
高強(qiáng)度瓊脂糖34~4385~95
修飾的低熔點(diǎn)/凝點(diǎn)瓊脂糖25~3563~653565
超低熔點(diǎn)8~1540~45
低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖25~307038853075常用的電泳緩沖液4℃保存?zhèn)溆?7、電泳緩沖液TAE和TBE電泳緩沖液比較都是常用電泳緩沖液,二者相比:1)TAE的緩沖容量較低,如長時(shí)間電泳會(huì)被消耗,此時(shí)凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化;2)TBE比TAE花費(fèi)稍貴,但有高得多的緩沖容量;3)雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE中遷移快10%;4)對(duì)于高分子質(zhì)量的DNA,TAE的分辨率略高于TBE,對(duì)于低分子質(zhì)量的DNA,TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。6×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯氰15%聚蔗糖(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)4℃40%(m/V)蔗糖水溶液瓊脂糖凝膠中DNA的檢測
通過染色,紫外燈下檢測。主要采用溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)染色法。凝膠中DNA的成像
可以用透射或入射紫外光對(duì)EB染色的凝膠成像,圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)技巧和方法\幾點(diǎn)注意事項(xiàng)1)加樣時(shí)槍頭不要碰壞凝膠壁,否則DNA的帶型將不會(huì)整齊,加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液,以趕走樣品空中的氣泡。2)每孔最大DNA上樣量決定于DNA樣品片段的大小、數(shù)目及樣品孔形狀與容量。3)應(yīng)注意每孔最大上樣容量及樣品孔體積,以免加樣時(shí)樣品流入附近樣品孔造成交叉污染,影響結(jié)果分析。4)在實(shí)驗(yàn)加樣中不一定每一個(gè)樣品都換一個(gè)槍頭,可在陽極槽中反復(fù)吸打電泳緩沖液以清洗。(對(duì)于Southern印跡轉(zhuǎn)移和需要回收DNA片段的電泳,則應(yīng)該每一個(gè)樣品用一個(gè)槍頭加樣,避免樣品交叉污染。)5)凝膠中加入EB進(jìn)行電泳,便于紫外線下觀察電泳狀態(tài),但EB會(huì)導(dǎo)致線形DNA遷移率下降,這在酶切質(zhì)粒與空白對(duì)照質(zhì)粒一起電泳時(shí)應(yīng)值得注意。6)電泳過程中,溴化乙錠向負(fù)極移動(dòng),與DNA泳動(dòng)的方向相反
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