微生物制藥課件

第二章微生物制藥第二章微生物制藥1一、微生物藥物的幾個(gè)相關(guān)基本概念二、微生物藥物的分類三、微生物藥物的應(yīng)用四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)五、微生物藥物的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)六、微生物藥物的分離、精制和鑒別七、廢棄物的綜合利用和環(huán)境保護(hù)一、微生物藥物的幾個(gè)相關(guān)基本概念2四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌（二）新藥產(chǎn)生菌的分離（三）新微生物藥物的篩選（四）微生物藥物產(chǎn)生菌的菌種改良（五）微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌3（三）新微生物藥物的篩選1、初篩發(fā)酵初篩發(fā)酵是能否產(chǎn)生抗生素的關(guān)鍵，需要選擇適合的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以利于抗生素的合成。（三）新微生物藥物的篩選1、初篩發(fā)酵初篩發(fā)酵是能否產(chǎn)生抗生素4培養(yǎng)基主要是供給微生物生長(zhǎng)和合成抗生素的材料。培養(yǎng)基成分碳源糖類、脂肪、某些有機(jī)酸、醇或碳?xì)浠衔锕┙o微生物生命活動(dòng)所需要的能量以及構(gòu)成菌體細(xì)胞成分和代謝產(chǎn)物。氮源蛋白胨、黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、肉膏、酒泥硫酸銨、氨水、硝酸鹽等供給微生物生長(zhǎng)所需的氮素，構(gòu)成菌體原生質(zhì)無(wú)機(jī)鹽、微量元素磷、鎂、鉀、鈉等鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬等可以作為生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物培養(yǎng)基主要是供給微生物生長(zhǎng)和合成抗生素的材料。培養(yǎng)基成分碳源5初篩方式：固體平板發(fā)酵——液體振蕩培養(yǎng)——便于大量篩選抗菌物質(zhì)時(shí)采用。放線菌大都為好氧菌，增加溶解氧有利于放線菌生長(zhǎng)和抗生素的合成。初篩方式：便于大量篩選抗菌物質(zhì)時(shí)采用。放線菌大都為好氧菌，增62、篩選模型的研究與應(yīng)用10000株新分離的放線菌30株（可能是新抗生素）10種新化合物1種有希望的化合物，低毒性，體內(nèi)有效新抗生素/分離的菌株數(shù)：1/1000新抗生素/已知抗生素：1/50有希望的抗生素/分離的菌株數(shù)：1/100002500株對(duì)細(xì)菌有抗菌活性500株250株鏈絲菌素類125株鏈霉素類40株四環(huán)素類55株其他已知抗生素交叉耐藥試驗(yàn)和紙層鑒別Woodruff等的經(jīng)典篩選毒性試驗(yàn)2、篩選模型的研究與應(yīng)用10000株新分離的放線菌30株（可7（1）常規(guī)的篩選方法瓊脂擴(kuò)散法——利用多種微生物作為檢定菌，篩選有抗菌活性的物質(zhì)。非致病菌抗生素耐藥突變株和超敏菌株厭氧菌協(xié)同活性檢測(cè)（1）常規(guī)的篩選方法瓊脂擴(kuò)散法——利用多種微生物作為檢定菌，8（2）定靶篩選從臨床有效的抗生素的作用機(jī)理和細(xì)菌的耐藥機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)篩選模型，有目的地篩選具有某種作用機(jī)理的抗生素，試圖獲得抗菌作用強(qiáng)、對(duì)耐藥菌有效、毒性小的新抗生素。以作用機(jī)理為依據(jù)的篩選方法以耐藥機(jī)制為依據(jù)的篩選方法（2）定靶篩選從臨床有效的抗生素的作用機(jī)理和細(xì)菌的耐藥機(jī)理來(lái)9細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制劑的篩選土壤分離的微生物（10200株）（細(xì)菌、真菌和放線菌）第二步：測(cè)定抑制同位素滲入meso-[3H]二氨基庚二酸L-[14C]亮氨酸用DiafloUM-2膜測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（1000以下）小分子量：azureomycinA和B（新）AM-1034AM-5289Amphomycin，青霉素G大分子量：ristocetinA和B其他（11種）+-+-++（487）（238）（1530）+-+-++第一步：抗微生物活性：細(xì)菌支原體細(xì)胞壁合成抑制劑（141）asukamycinSetomimycinvineomycinsnanaomycinA、B、C、D、EfreonolicinBcervinomycins其他細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制劑的篩選土壤分離的微生物（10200株）（10以耐藥機(jī)制為依據(jù)的篩選方法抗生素的廣泛使用和一些不合理的濫用，引起細(xì)菌耐藥性的增加，而細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展又使耐藥性的解決成為可能。以耐藥機(jī)制為依據(jù)的篩選方法抗生素的廣泛使用和一些不合理的濫用11微生物制藥課件12細(xì)菌的耐藥機(jī)制主要有4種：細(xì)菌產(chǎn)生一種或多種水解酶或鈍化酶來(lái)水解或修飾進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的抗生素，使之失去生物活性；抗生素的作用靶點(diǎn)由于發(fā)生突變或被細(xì)菌的某種酶修飾而使抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮作用，以及抗生素作用的靶酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變使之與抗生素的親和力下降；由于細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的改變或其他有關(guān)特性的改變；細(xì)菌具有一種依賴于能量的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，它能夠把進(jìn)入胞內(nèi)的藥物泵至胞外。細(xì)菌的耐藥機(jī)制主要有4種：13β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的篩選β-內(nèi)酰胺酶是一類能夠破壞具有β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)抗生素的鈍化酶的總稱。許多致病菌由于產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶而對(duì)青霉素和頭孢菌素具有抗性。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的篩選主要依據(jù)抑制劑抑制β-內(nèi)酰胺酶，使酶失去活性，不能水解β-內(nèi)酰胺類抗生素，使抗生素保持生物活性，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。耐藥菌株平板法液體測(cè)定法聯(lián)合使用β-內(nèi)酰胺酶以及敏感和耐藥突變株通過(guò)顏色變化來(lái)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶方法的應(yīng)用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的篩選β-內(nèi)酰胺酶是一類能夠破壞具有β-內(nèi)143、高通量篩選高通量篩選（highthroughputscreening）技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期形成的尋找新藥的高新技術(shù)。將許多模型固定在各自不同的載體上，用機(jī)器人加樣，培養(yǎng)后用計(jì)算機(jī)記錄結(jié)果，并進(jìn)行分析，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的篩選。3、高通量篩選高通量篩選（highthroughputs15高通量篩選的模型：細(xì)胞模型——觀察待測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞的作用，反映藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程的綜合作用。包括各種正常細(xì)胞和病理細(xì)胞。分子模型——包括受體、酶等，藥物作用的靶點(diǎn)明確。其他模型高通量篩選的模型：16現(xiàn)階段的微生物藥物篩選主要研究方面：產(chǎn)生菌的來(lái)源微生物的初篩發(fā)酵新的篩選模型和方法現(xiàn)階段的微生物藥物篩選主要研究方面：17四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌（二）新藥產(chǎn)生菌的分離（三）新微生物藥物的篩選（四）微生物藥物產(chǎn)生菌的菌種改良（五）微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌18目的——將產(chǎn)生菌的一些有益變異，通過(guò)不斷的篩選和培育，為研究和生產(chǎn)提供更多合乎需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種。（四）微生物藥物產(chǎn)生菌的菌種改良自然選育誘變育種雜交育種基因工程技術(shù)改良菌種目的——將產(chǎn)生菌的一些有益變異，通過(guò)不斷的篩選和培育，為研究191、自然選育在生產(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過(guò)程，叫做自然選育或自然分離。自然選育包括從自然界分離獲得菌株根據(jù)菌種的自發(fā)突變進(jìn)行篩選而獲得菌種。1、自然選育在生產(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)201）從自然界分離獲得菌株一般包括以下幾個(gè)步驟：采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離和性能測(cè)定等。調(diào)查研究（包括資料查閱）↓試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)↓采樣↓第一次增殖培養(yǎng)↓第一次平板分離↓第二次增殖培養(yǎng)↓第二次平板分離↓第二次原種斜面↓初篩（1株1瓶）增殖條件摸索→第一次原種斜面→←定性或半定量測(cè)定1）從自然界分離獲得菌株一般包括以下幾個(gè)步驟：采樣、增殖培養(yǎng)21第三次平板分離↓第三次原種斜面↓復(fù)篩（1株3-5瓶）↓第四次平板分離↓第四次原種斜面↓再?gòu)?fù)篩↓較優(yōu)化菌株1-3株初步工藝條件摸索→→第三次原種保藏←種子培養(yǎng)不純保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)性能試驗(yàn)或作為育種的出發(fā)菌株某些必要試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)等第三次平板分離初步工藝條件摸索→→第三次原種保藏←種子培養(yǎng)不222）從自發(fā)突變體中獲得菌株變異是育種的基礎(chǔ)。自然突變是指自然條件下出現(xiàn)的基因變化。自發(fā)突變的頻率較低，因此自然選育篩選出來(lái)的菌種，不能滿足育種工作的需要。因而不能僅停留在“選”種，還要進(jìn)行“育”種。如通過(guò)誘變劑處理菌株，就可以大大提高菌種的突變頻率，擴(kuò)大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株——誘變育種。2）從自發(fā)突變體中獲得菌株變異是育種的基礎(chǔ)。232、誘變選育人工誘變能提高突變頻率和擴(kuò)大變異譜，具有速度快、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前菌種選育的一種主要方法，使用普遍。誘發(fā)突變隨機(jī)性大，必須與大規(guī)模的篩選工作相配合才能受到良好的效果。2、誘變選育人工誘變能提高突變頻率和擴(kuò)大變異譜，具有速度快、24誘變育種的主要環(huán)節(jié)：以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞或孢子）以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中DNA堿基變異頻率大幅度提高；用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，選出極少數(shù)性能優(yōu)良的正變異株，以達(dá)到培育優(yōu)良菌株的目的。誘變育種的主要環(huán)節(jié)：以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物25出發(fā)菌株的選擇菌懸液的制備前培養(yǎng)誘變變異菌株的分離和篩選出發(fā)菌株的選擇菌懸液的制備前培養(yǎng)誘變變異菌株的分離和篩選261）誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑生物誘變劑各種射線，如紫外線、X射線、β射線、γ射線、α射線和超聲波等乙基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥等。噬菌體、轉(zhuǎn)座因子1）誘變劑物理誘變劑各種射線，如紫外線、X射線、β射線、γ射27防護(hù)面罩防護(hù)衣防護(hù)罩防護(hù)面罩防護(hù)衣防護(hù)罩28各種化學(xué)誘變劑常用的劑量和處理時(shí)間誘變劑誘變劑的劑量處理時(shí)間緩沖劑中止反應(yīng)方法亞硝酸（HNO2）0.01～0.1mol/L5～10minpH值4.5，1mol/L醋酸緩沖液pH8.6，0.07磷酸二氫鈉硫酸二乙酯（DES）0.5～1％10～30min，孢子18～24hpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋甲基磺酸乙酯（EMS）0.05～0.5mol/L10～60min，孢子3～6hpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋亞硝基胍（NTG）0.1～1.0mol/mL，孢子3mg/mL15～60min，90～120minpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液或Tris緩沖液大量稀釋亞硝基甲基胍（NMU）0.1～1.0mol/mL15～90minpH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸緩沖劑或Tris緩沖液大量稀釋氮芥0.1～1.0mol/mL5～10minNaHCO3甘氨酸或大量稀釋乙烯亞胺1:1000～1:1000030～60min硫代硫酸鈉或大量稀釋羥胺（NH2OH?HCl）0.1～0.5％數(shù)小時(shí)或生長(zhǎng)過(guò)程中誘變大量稀釋氯化鋰（LiCl）0.3～0.5％加入培養(yǎng)基中，在生長(zhǎng)過(guò)程中誘變大量稀釋秋水仙堿（C22H25NO6）0.01～0.2％加入培養(yǎng)基中，在生長(zhǎng)過(guò)程中誘變大量稀釋各種化學(xué)誘變劑常用的劑量和處理時(shí)間誘變劑誘變劑的劑量處理時(shí)間292）影響誘變效果的因素出發(fā)菌株的遺傳特性；誘變劑；菌種的生理狀態(tài)；被處理菌株的預(yù)培養(yǎng)和后培養(yǎng)條件；誘變處理時(shí)的外界條件等。選擇合適的出發(fā)菌株采用分散狀態(tài)的孢子懸浮液處理采用單核細(xì)胞（或核質(zhì)體）處理注意微生物的生理狀態(tài)適宜的誘變劑量2）影響誘變效果的因素出發(fā)菌株的遺傳特性；選擇合適的出發(fā)菌株303）篩選的方法制定篩選方案方案設(shè)計(jì)的中心內(nèi)容是確定誘變篩選流程。出發(fā)菌種（砂土管或冷凍管）↓斜面→或肉湯培養(yǎng)24h↓單孢子懸液↓誘變處理↓稀釋涂布平板↓挑取單菌落傳種斜面↓菌懸液誘變處理——處理前后的孢子液或細(xì)菌懸液作活菌計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)其存活率——觀察單菌落形態(tài)并統(tǒng)計(jì)其形態(tài)變異率3）篩選的方法制定篩選方案方案設(shè)計(jì)的中心內(nèi)容是確定誘變篩選流31搖瓶初篩↓挑出高產(chǎn)斜面↓菌種保藏（砂土管、凍干管或制備固體孢子）↓搖瓶復(fù)篩（復(fù)篩次數(shù)及搖瓶數(shù)以及培養(yǎng)基種類根據(jù)情況決定）↓挑出高產(chǎn)菌株作穩(wěn)定性試驗(yàn)和菌種特性考察↓放大試驗(yàn)罐、中試考察↓大型投產(chǎn)試驗(yàn)傳種斜面（或直接用固體孢子）——對(duì)照組——對(duì)照組搖瓶初篩傳種斜面（或直接用固體孢子）——對(duì)照組——對(duì)照組32突變株的篩選方法一般經(jīng)誘變后，再經(jīng)中間培養(yǎng)、淘汰野生型、檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型、確定生長(zhǎng)譜等。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌絲過(guò)濾法、差別殺菌法和饑餓法等。營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出方法有：逐個(gè)測(cè)定法、夾層平板法、限量營(yíng)養(yǎng)法和影印接種法等。突變株的篩選方法一般經(jīng)誘變后，再經(jīng)中間培養(yǎng)、淘汰野生型、檢出33影印平板（Replicaplating）法是Lederberg夫婦在1952年建立影印平板（Replicaplating）法是Lederbe34用梯度平板法定向培育若干代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌抗代謝物肌苷Bacilluspumilus（短小芽胞桿菌）8-氮鳥(niǎo)嘌呤肌苷Corynebacteriumsp（一種棒狀桿菌）6-硫鳥(niǎo)嘌呤腺嘌呤Salmonellatyphimarium（鼠傷寒沙門氏菌）2，6-二氨基嘌呤煙堿酸Chlamydomonaseugametos（一種衣藻）3-乙酰吡啶色氨酸Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）6-甲基色氨酸甲硫氨酸Escherichiacoli（大腸桿菌）乙硫氨酸酪氨酸E.coli對(duì)氟苯丙氨酸吡咯疊氮（pyrrolnitrin）Pseudomonasaureofaciens（金色假單胞菌）6-氟色氨酸亮氨酸S.typhi三氟-DL-亮氨酸用梯度平板法定向培育若干代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌抗代35微生物制藥課件36根據(jù)形態(tài)變異淘汰低產(chǎn)菌株，根據(jù)平皿反應(yīng)挑取高產(chǎn)菌株。搖瓶篩選法瓊脂塊篩選法篩選自動(dòng)化和篩選工具微型化隨機(jī)篩選理性化篩選運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株。根據(jù)形態(tài)變異淘汰低產(chǎn)菌株，根據(jù)平皿反應(yīng)挑取高產(chǎn)菌株。搖瓶篩選37微生物制藥課件38理性化篩選初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選：降低終產(chǎn)物濃度篩選抗反饋突變菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物（主要是抗生素）高產(chǎn)菌株的篩選：利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選篩選負(fù)變株的回復(fù)突變株篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株理性化篩選初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選：次級(jí)代謝產(chǎn)物（主要是抗39降低終產(chǎn)物濃度降低終產(chǎn)物濃度40雜交育種——一般指兩個(gè)不同基因型的菌株通過(guò)接合或原生質(zhì)體融合，使遺傳物質(zhì)重新組合，再?gòu)闹蟹蛛x和篩選出具有新性狀的菌株。真菌、放線菌和細(xì)菌均可進(jìn)行雜交育種。3、雜交育種雜交育種——一般指兩個(gè)不同基因型的菌株通過(guò)接合或原生質(zhì)體融合411）常規(guī)的雜交育種遺傳標(biāo)記異核體形成雜合二倍體的形成染色體交換和單倍體1）常規(guī)的雜交育種遺傳標(biāo)記422）原生質(zhì)體融合2）原生質(zhì)體融合43A.標(biāo)記菌株的篩選供融合用的兩個(gè)親株要求性能穩(wěn)定并帶有遺傳標(biāo)記，以利于融合子的選擇。采用的遺傳標(biāo)記一般以營(yíng)養(yǎng)缺陷型和抗藥性等遺傳性狀為標(biāo)記。通過(guò)采用多種抗生素及其他藥物，以梯度平板法進(jìn)行粗選，再用具有抗性的抗性生物制備不同濃度的平板，進(jìn)行較細(xì)的篩選。A.標(biāo)記菌株的篩選供融合用的兩個(gè)親株要求性能穩(wěn)定并帶有遺傳標(biāo)44B.原生質(zhì)體的制備在高滲透壓溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿溉コ?xì)胞壁，剩下的是由細(xì)胞膜包裹的原生質(zhì)體。（細(xì)菌或放線菌可用溶菌酶或青霉素處理，酵母菌和霉菌可用蝸牛酶或其他相應(yīng)的脫壁酶）溶菌酶蝸牛酶B.原生質(zhì)體的制備在高滲透壓溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿溉コ?xì)胞壁45影響原生質(zhì)體制備的因素：菌體的預(yù)處理菌體的培養(yǎng)時(shí)間酶濃度酶解溫度酶解時(shí)間滲透壓穩(wěn)定劑用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-環(huán)絲氨酸等處理細(xì)菌，使菌體細(xì)胞壁對(duì)酶的敏感性增強(qiáng)。一般選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌體，這時(shí)細(xì)胞正在生長(zhǎng)、代謝旺盛，細(xì)胞壁對(duì)酶解最為敏感。一般控制在20～40℃。充足的酶解時(shí)間對(duì)于細(xì)菌或放線菌一般采用蔗糖、丁二酸鈉；對(duì)于酵母菌則采用山梨醇、甘露醇等；對(duì)于霉菌則采用KCl和NaCl等。一定濃度的Ca2+、Mg2+等二價(jià)陽(yáng)離子可增加原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性。影響原生質(zhì)體制備的因素：菌體的預(yù)處理用EDTA、甘氨酸、青霉46C.原生質(zhì)體的融合和再生融合是把兩個(gè)親株的原生質(zhì)體混合在一起，在融合劑PEG和Ca2+作用下，發(fā)生原生質(zhì)體的融合。原生質(zhì)體融合后的重組子要成為一個(gè)無(wú)性繁殖系，首先必須再生，即能重建細(xì)胞壁，恢復(fù)完整細(xì)胞并生長(zhǎng)、分裂。影響原生質(zhì)體融合的因素：菌體的前處理；菌體的培養(yǎng)時(shí)間；融合劑的濃度；融合劑作用的時(shí)間；陽(yáng)離子的濃度；融合的溫度；融合體系的pH值等。影響原生質(zhì)體再生的因素：菌種自身的再生性能；原生質(zhì)體制備的條件；再生培養(yǎng)基成分；再生培養(yǎng)條件等。C.原生質(zhì)體的融合和再生融合是把兩個(gè)親株的原生質(zhì)體混合在一起47檢查原生質(zhì)體形成和再生的指標(biāo)：原生質(zhì)體的形成率原生質(zhì)體的再生率將用酶處理前的菌體經(jīng)無(wú)菌水系列稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基平板上，計(jì)出原菌數(shù)A；將用酶處理后得到的原生質(zhì)體分別經(jīng)如下兩個(gè)過(guò)程的處理：用無(wú)菌水適當(dāng)稀釋，在完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計(jì)數(shù)，由于原生質(zhì)體在低滲透壓條件下會(huì)破裂失活，所以生長(zhǎng)出的菌落數(shù)為未形成原生質(zhì)體的原菌數(shù)B；用高滲液適當(dāng)稀釋，在再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計(jì)數(shù)，生長(zhǎng)出的菌落數(shù)為原生質(zhì)體再生的菌數(shù)和未形成原生質(zhì)體的原菌數(shù)之和C。原生質(zhì)體形成率＝A–BA×100％原生質(zhì)體再生率＝C–BA－B×100％檢查原生質(zhì)體形成和再生的指標(biāo)：原生質(zhì)體的形成率將用酶處理前的48D.融合子的選擇融合子的選擇主要依靠?jī)蓚€(gè)親株的選擇性遺傳標(biāo)記。在選擇性培養(yǎng)基上，通過(guò)兩個(gè)親株的遺傳標(biāo)記互補(bǔ)而挑選出融合子。在融合體再生后，進(jìn)行幾代自然分離、選擇，才能確定真正融合子。D.融合子的選擇融合子的選擇主要依靠?jī)蓚€(gè)親株的選擇性遺傳標(biāo)記49原生質(zhì)體融合與傳統(tǒng)雜交方法相比有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1、重組頻率高并可能有幾個(gè)親株同時(shí)進(jìn)行雜交；2、可以進(jìn)行種間甚至屬間雜交并形成穩(wěn)定的重組體，但重組的頻率比較低；3、被滅活的原生質(zhì)體進(jìn)行融合后，仍可能活的重組體；4、原生質(zhì)體的形成與再生本身就可作為鏈霉菌的一種育種方法。原生質(zhì)體融合與傳統(tǒng)雜交方法相比有以下幾個(gè)特點(diǎn)：504、基因工程技術(shù)改良菌種體外重組DNA技術(shù)或稱基因工程、遺傳工程，是以分子遺傳學(xué)的理論為基礎(chǔ)，綜合分子生物學(xué)和微生物遺傳學(xué)的最新技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一門新興技術(shù)。它是現(xiàn)代生物技術(shù)的一個(gè)重要組成方面，在工業(yè)微生物學(xué)上提供了巨大的創(chuàng)造具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的生產(chǎn)菌株的潛力。4、基因工程技術(shù)改良菌種體外重組DNA技術(shù)或稱基因工程、遺傳51（1）DNA重組過(guò)程基因的分離DNA分子的切割與連接載體引入宿主細(xì)胞重組體的選擇和鑒定外源基因的表達(dá)（1）DNA重組過(guò)程基因的分離52（2）重組DNA技術(shù)在微生物藥物菌種改良研究中的應(yīng)用提高微生物藥物的單位產(chǎn)量1.增加限速酶基因拷貝數(shù),提高菌種的生產(chǎn)能力2.引入抗性基因和調(diào)節(jié)基因,增加微生物藥物單位產(chǎn)量3.克隆抗生素的全部結(jié)構(gòu)基因,改變表達(dá)體系提高產(chǎn)量（2）重組DNA技術(shù)在微生物藥物菌種改良研究中的應(yīng)用提高微生53C.構(gòu)建能產(chǎn)生半合成抗生素中間體的基因工程菌

許多半合成抗生素的中間體是由一些天然產(chǎn)物經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾獲得的，但是制備工藝較為復(fù)雜。例如半合成頭孢菌素的中間體是頭孢菌素C的衍生物7-ACA，或青霉素G和V的衍生物7-ADOCA。B.阻斷支路代謝，增加有效組分的含量抗蟲(chóng)抗生素阿弗米丁基因工程菌的構(gòu)建——阿弗米丁是十六元大環(huán)內(nèi)酯的齊墩果二糖衍生物，由除蟲(chóng)鏈霉菌產(chǎn)生，在發(fā)酵過(guò)程中還產(chǎn)生一種結(jié)構(gòu)差別大的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素寡霉素。C.構(gòu)建能產(chǎn)生半合成抗生素中間體的基因工程菌B.阻斷支路代54D.構(gòu)建產(chǎn)生新化合物的基因工程菌由于許多微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物酶系的底物特異性不強(qiáng)，當(dāng)某種抗生素的生物合成基因克隆至另一結(jié)構(gòu)相似、生物合成途徑有關(guān)的抗生素產(chǎn)生菌中，可使其產(chǎn)生不同于二親株產(chǎn)物的具有生物活性的新化合物，即“雜合抗生素”。例如，將放線紫紅素的生物合成基因?qū)胱霞t鏈霉菌，產(chǎn)生了新化合物二氫榴菌紫紅素；聚酮類化合物（PK）。E.引入血紅蛋白基因，改善微生物的工業(yè)性狀充足的氧氣供給是穩(wěn)定和提高發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)水平、降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵，傳統(tǒng)方法是改良生物反應(yīng)器及增大通氣量。專性好氧菌透明顫菌中發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白（VHb），能促進(jìn)氧氣擴(kuò)散到細(xì)胞末端氧化酶上，使細(xì)胞在貧氧狀態(tài)下也能很好生長(zhǎng)。D.構(gòu)建產(chǎn)生新化合物的基因工程菌55四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌（二）新藥產(chǎn)生菌的分離（三）新微生物藥物的篩選（四）微生物藥物產(chǎn)生菌的菌種改良（五）微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌561、菌種保藏的目的按人們的不同要求，把從自然界分離到的野生型，或經(jīng)過(guò)人工選育得到的變異型微生物純種，使其存活，不丟失、不混亂、不污染、不發(fā)生或少發(fā)生變異，保持其優(yōu)良性狀或生理特性，使其處于休眠狀態(tài)（一般使用多種方法保存）。（五）微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏1、菌種保藏的目的按人們的不同要求，把從自然界分離到的野生型572、菌種保藏的基本原理微生物菌種保藏的基本原理使微生物的生命活動(dòng)處于半永久性的休眠狀態(tài)，也就是使微生物的新陳代謝作用限制在最低的范圍內(nèi)。干燥、低溫、隔絕空氣是保證獲得這種狀態(tài)的主要措施。菌種的保藏2、菌種保藏的基本原理微生物菌種保藏的基本原理使微生物的生命58有針對(duì)性的創(chuàng)造干燥、低溫、缺氧的外界條件，是微生物菌種保藏的基本技術(shù)。保藏時(shí)，一般利用菌種的休眠體（孢子、芽胞等），創(chuàng)造最有利于休眠狀態(tài)的環(huán)境條件，如低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，使菌體的代謝活性處于最低狀態(tài)，同時(shí)也應(yīng)考慮到經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便方法。由于微生物種類繁多，代謝特點(diǎn)各異，對(duì)各種外界環(huán)境因素的適應(yīng)能力不一致，一個(gè)菌種選用何種方法保藏較好，要根據(jù)具體情況而定。3、菌種保藏的技術(shù)有針對(duì)性的創(chuàng)造干燥、低溫、缺氧的外界條件，是微生物菌種保藏的594、菌種保藏方法4、菌種保藏方法60A.暫時(shí)保存（斜面?zhèn)鞔２胤ǎ┌丫N接種到所需要的斜面培養(yǎng)基上，置最適溫度下培養(yǎng)到出現(xiàn)豐滿的菌體細(xì)胞或孢子后，放置于冰箱4—5℃保存，2—3個(gè)月轉(zhuǎn)接一次，傳代保藏。4、菌種保藏方法最常用的微生物菌種保藏方法，作為菌種的暫時(shí)保藏之用。葡萄球菌屬、鏈球菌屬等間隔2周；一般無(wú)芽胞細(xì)菌間隔3－6個(gè)月；放線菌間隔3個(gè)月；酵母菌和霉菌間隔4－6個(gè)月。傳代頻率A.暫時(shí)保存（斜面?zhèn)鞔２胤ǎ┌丫N接種到所需要的斜面61B.長(zhǎng)久保存運(yùn)用干燥、低溫和隔絕空氣等手段，降低微生物菌種的新陳代謝速率使菌種的生命活動(dòng)處于半永久性的休眠狀態(tài)，以達(dá)到長(zhǎng)久保藏的目的。礦油保藏法載體保藏法懸液保藏法冷凍真空干燥保藏法干燥保藏法液氮超低溫保藏法B.長(zhǎng)久保存運(yùn)用干燥、低溫和隔絕空氣等手段，降低微生物菌62礦油保藏法礦油保藏法63冷凍干燥保藏冷凍干燥保藏64液氮超低溫保藏法菌種保藏在液氮超低溫（-196℃）中，是目前比較理想的一種菌種保藏方法。適用于各種菌種的保藏，特別適于難以冷凍真空干燥等方法保藏的菌種。保藏期較長(zhǎng)，菌種的變異較小。投資費(fèi)用較大，并要一個(gè)可靠的氮源。液氮超低溫保藏法菌種保藏在液氮超低溫（-196℃）中，是目前657種常用菌種保藏方法的比較方法主要措施適宜菌種保藏期評(píng)價(jià)冰箱保藏法（斜面）低溫（4℃）各大類約1～6月簡(jiǎn)便冰箱保藏法（半固體）低溫（4℃），避氧細(xì)菌，酵母菌約6～12月簡(jiǎn)便石蠟油封藏法*低溫（4℃），阻氧各大類**約1～2年簡(jiǎn)便甘油懸液保藏法低溫（－70℃），保護(hù)劑（15～50％甘油）細(xì)菌，酵母菌約10年較簡(jiǎn)便砂土保藏法干燥，無(wú)營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)孢子的微生物約1～10年簡(jiǎn)便有效冷凍干燥保藏法干燥、低溫、無(wú)氧，有保護(hù)劑各大類>5~15年繁而高效液氮保藏法超低溫（－196℃），有保護(hù)劑各大類>15年繁而高效*用斜面或半固體穿刺培養(yǎng)物均可，一般置于4℃下。**對(duì)石油發(fā)酵微生物不適宜。7種常用菌種保藏方法的比較方法主要措施適宜菌種保藏期評(píng)價(jià)冰箱665、菌種保藏的注意事項(xiàng)菌種在保藏前所處的狀態(tài)菌種保藏所用的基質(zhì)操作過(guò)程對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害5、菌種保藏的注意事項(xiàng)菌種在保藏前所處的狀態(tài)67第二章微生物制藥第二章微生物制藥68一、微生物藥物的幾個(gè)相關(guān)基本概念二、微生物藥物的分類三、微生物藥物的應(yīng)用四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)五、微生物藥物的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)六、微生物藥物的分離、精制和鑒別七、廢棄物的綜合利用和環(huán)境保護(hù)一、微生物藥物的幾個(gè)相關(guān)基本概念69四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌（二）新藥產(chǎn)生菌的分離（三）新微生物藥物的篩選（四）微生物藥物產(chǎn)生菌的菌種改良（五）微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌70（三）新微生物藥物的篩選1、初篩發(fā)酵初篩發(fā)酵是能否產(chǎn)生抗生素的關(guān)鍵，需要選擇適合的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以利于抗生素的合成。（三）新微生物藥物的篩選1、初篩發(fā)酵初篩發(fā)酵是能否產(chǎn)生抗生素71培養(yǎng)基主要是供給微生物生長(zhǎng)和合成抗生素的材料。培養(yǎng)基成分碳源糖類、脂肪、某些有機(jī)酸、醇或碳?xì)浠衔锕┙o微生物生命活動(dòng)所需要的能量以及構(gòu)成菌體細(xì)胞成分和代謝產(chǎn)物。氮源蛋白胨、黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、肉膏、酒泥硫酸銨、氨水、硝酸鹽等供給微生物生長(zhǎng)所需的氮素，構(gòu)成菌體原生質(zhì)無(wú)機(jī)鹽、微量元素磷、鎂、鉀、鈉等鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬等可以作為生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物培養(yǎng)基主要是供給微生物生長(zhǎng)和合成抗生素的材料。培養(yǎng)基成分碳源72初篩方式：固體平板發(fā)酵——液體振蕩培養(yǎng)——便于大量篩選抗菌物質(zhì)時(shí)采用。放線菌大都為好氧菌，增加溶解氧有利于放線菌生長(zhǎng)和抗生素的合成。初篩方式：便于大量篩選抗菌物質(zhì)時(shí)采用。放線菌大都為好氧菌，增732、篩選模型的研究與應(yīng)用10000株新分離的放線菌30株（可能是新抗生素）10種新化合物1種有希望的化合物，低毒性，體內(nèi)有效新抗生素/分離的菌株數(shù)：1/1000新抗生素/已知抗生素：1/50有希望的抗生素/分離的菌株數(shù)：1/100002500株對(duì)細(xì)菌有抗菌活性500株250株鏈絲菌素類125株鏈霉素類40株四環(huán)素類55株其他已知抗生素交叉耐藥試驗(yàn)和紙層鑒別Woodruff等的經(jīng)典篩選毒性試驗(yàn)2、篩選模型的研究與應(yīng)用10000株新分離的放線菌30株（可74（1）常規(guī)的篩選方法瓊脂擴(kuò)散法——利用多種微生物作為檢定菌，篩選有抗菌活性的物質(zhì)。非致病菌抗生素耐藥突變株和超敏菌株厭氧菌協(xié)同活性檢測(cè)（1）常規(guī)的篩選方法瓊脂擴(kuò)散法——利用多種微生物作為檢定菌，75（2）定靶篩選從臨床有效的抗生素的作用機(jī)理和細(xì)菌的耐藥機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)篩選模型，有目的地篩選具有某種作用機(jī)理的抗生素，試圖獲得抗菌作用強(qiáng)、對(duì)耐藥菌有效、毒性小的新抗生素。以作用機(jī)理為依據(jù)的篩選方法以耐藥機(jī)制為依據(jù)的篩選方法（2）定靶篩選從臨床有效的抗生素的作用機(jī)理和細(xì)菌的耐藥機(jī)理來(lái)76細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制劑的篩選土壤分離的微生物（10200株）（細(xì)菌、真菌和放線菌）第二步：測(cè)定抑制同位素滲入meso-[3H]二氨基庚二酸L-[14C]亮氨酸用DiafloUM-2膜測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（1000以下）小分子量：azureomycinA和B（新）AM-1034AM-5289Amphomycin，青霉素G大分子量：ristocetinA和B其他（11種）+-+-++（487）（238）（1530）+-+-++第一步：抗微生物活性：細(xì)菌支原體細(xì)胞壁合成抑制劑（141）asukamycinSetomimycinvineomycinsnanaomycinA、B、C、D、EfreonolicinBcervinomycins其他細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制劑的篩選土壤分離的微生物（10200株）（77以耐藥機(jī)制為依據(jù)的篩選方法抗生素的廣泛使用和一些不合理的濫用，引起細(xì)菌耐藥性的增加，而細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展又使耐藥性的解決成為可能。以耐藥機(jī)制為依據(jù)的篩選方法抗生素的廣泛使用和一些不合理的濫用78微生物制藥課件79細(xì)菌的耐藥機(jī)制主要有4種：細(xì)菌產(chǎn)生一種或多種水解酶或鈍化酶來(lái)水解或修飾進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的抗生素，使之失去生物活性；抗生素的作用靶點(diǎn)由于發(fā)生突變或被細(xì)菌的某種酶修飾而使抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮作用，以及抗生素作用的靶酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變使之與抗生素的親和力下降；由于細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的改變或其他有關(guān)特性的改變；細(xì)菌具有一種依賴于能量的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，它能夠把進(jìn)入胞內(nèi)的藥物泵至胞外。細(xì)菌的耐藥機(jī)制主要有4種：80β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的篩選β-內(nèi)酰胺酶是一類能夠破壞具有β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)抗生素的鈍化酶的總稱。許多致病菌由于產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶而對(duì)青霉素和頭孢菌素具有抗性。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的篩選主要依據(jù)抑制劑抑制β-內(nèi)酰胺酶，使酶失去活性，不能水解β-內(nèi)酰胺類抗生素，使抗生素保持生物活性，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。耐藥菌株平板法液體測(cè)定法聯(lián)合使用β-內(nèi)酰胺酶以及敏感和耐藥突變株通過(guò)顏色變化來(lái)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶方法的應(yīng)用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的篩選β-內(nèi)酰胺酶是一類能夠破壞具有β-內(nèi)813、高通量篩選高通量篩選（highthroughputscreening）技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期形成的尋找新藥的高新技術(shù)。將許多模型固定在各自不同的載體上，用機(jī)器人加樣，培養(yǎng)后用計(jì)算機(jī)記錄結(jié)果，并進(jìn)行分析，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的篩選。3、高通量篩選高通量篩選（highthroughputs82高通量篩選的模型：細(xì)胞模型——觀察待測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞的作用，反映藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程的綜合作用。包括各種正常細(xì)胞和病理細(xì)胞。分子模型——包括受體、酶等，藥物作用的靶點(diǎn)明確。其他模型高通量篩選的模型：83現(xiàn)階段的微生物藥物篩選主要研究方面：產(chǎn)生菌的來(lái)源微生物的初篩發(fā)酵新的篩選模型和方法現(xiàn)階段的微生物藥物篩選主要研究方面：84四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌（二）新藥產(chǎn)生菌的分離（三）新微生物藥物的篩選（四）微生物藥物產(chǎn)生菌的菌種改良（五）微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)（一）藥物的產(chǎn)生菌85目的——將產(chǎn)生菌的一些有益變異，通過(guò)不斷的篩選和培育，為研究和生產(chǎn)提供更多合乎需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種。（四）微生物藥物產(chǎn)生菌的菌種改良自然選育誘變育種雜交育種基因工程技術(shù)改良菌種目的——將產(chǎn)生菌的一些有益變異，通過(guò)不斷的篩選和培育，為研究861、自然選育在生產(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過(guò)程，叫做自然選育或自然分離。自然選育包括從自然界分離獲得菌株根據(jù)菌種的自發(fā)突變進(jìn)行篩選而獲得菌種。1、自然選育在生產(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)871）從自然界分離獲得菌株一般包括以下幾個(gè)步驟：采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離和性能測(cè)定等。調(diào)查研究（包括資料查閱）↓試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)↓采樣↓第一次增殖培養(yǎng)↓第一次平板分離↓第二次增殖培養(yǎng)↓第二次平板分離↓第二次原種斜面↓初篩（1株1瓶）增殖條件摸索→第一次原種斜面→←定性或半定量測(cè)定1）從自然界分離獲得菌株一般包括以下幾個(gè)步驟：采樣、增殖培養(yǎng)88第三次平板分離↓第三次原種斜面↓復(fù)篩（1株3-5瓶）↓第四次平板分離↓第四次原種斜面↓再?gòu)?fù)篩↓較優(yōu)化菌株1-3株初步工藝條件摸索→→第三次原種保藏←種子培養(yǎng)不純保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)性能試驗(yàn)或作為育種的出發(fā)菌株某些必要試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)等第三次平板分離初步工藝條件摸索→→第三次原種保藏←種子培養(yǎng)不892）從自發(fā)突變體中獲得菌株變異是育種的基礎(chǔ)。自然突變是指自然條件下出現(xiàn)的基因變化。自發(fā)突變的頻率較低，因此自然選育篩選出來(lái)的菌種，不能滿足育種工作的需要。因而不能僅停留在“選”種，還要進(jìn)行“育”種。如通過(guò)誘變劑處理菌株，就可以大大提高菌種的突變頻率，擴(kuò)大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株——誘變育種。2）從自發(fā)突變體中獲得菌株變異是育種的基礎(chǔ)。902、誘變選育人工誘變能提高突變頻率和擴(kuò)大變異譜，具有速度快、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前菌種選育的一種主要方法，使用普遍。誘發(fā)突變隨機(jī)性大，必須與大規(guī)模的篩選工作相配合才能受到良好的效果。2、誘變選育人工誘變能提高突變頻率和擴(kuò)大變異譜，具有速度快、91誘變育種的主要環(huán)節(jié)：以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞或孢子）以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中DNA堿基變異頻率大幅度提高；用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，選出極少數(shù)性能優(yōu)良的正變異株，以達(dá)到培育優(yōu)良菌株的目的。誘變育種的主要環(huán)節(jié)：以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物92出發(fā)菌株的選擇菌懸液的制備前培養(yǎng)誘變變異菌株的分離和篩選出發(fā)菌株的選擇菌懸液的制備前培養(yǎng)誘變變異菌株的分離和篩選931）誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑生物誘變劑各種射線，如紫外線、X射線、β射線、γ射線、α射線和超聲波等乙基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥等。噬菌體、轉(zhuǎn)座因子1）誘變劑物理誘變劑各種射線，如紫外線、X射線、β射線、γ射94防護(hù)面罩防護(hù)衣防護(hù)罩防護(hù)面罩防護(hù)衣防護(hù)罩95各種化學(xué)誘變劑常用的劑量和處理時(shí)間誘變劑誘變劑的劑量處理時(shí)間緩沖劑中止反應(yīng)方法亞硝酸（HNO2）0.01～0.1mol/L5～10minpH值4.5，1mol/L醋酸緩沖液pH8.6，0.07磷酸二氫鈉硫酸二乙酯（DES）0.5～1％10～30min，孢子18～24hpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋甲基磺酸乙酯（EMS）0.05～0.5mol/L10～60min，孢子3～6hpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋亞硝基胍（NTG）0.1～1.0mol/mL，孢子3mg/mL15～60min，90～120minpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液或Tris緩沖液大量稀釋亞硝基甲基胍（NMU）0.1～1.0mol/mL15～90minpH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸緩沖劑或Tris緩沖液大量稀釋氮芥0.1～1.0mol/mL5～10minNaHCO3甘氨酸或大量稀釋乙烯亞胺1:1000～1:1000030～60min硫代硫酸鈉或大量稀釋羥胺（NH2OH?HCl）0.1～0.5％數(shù)小時(shí)或生長(zhǎng)過(guò)程中誘變大量稀釋氯化鋰（LiCl）0.3～0.5％加入培養(yǎng)基中，在生長(zhǎng)過(guò)程中誘變大量稀釋秋水仙堿（C22H25NO6）0.01～0.2％加入培養(yǎng)基中，在生長(zhǎng)過(guò)程中誘變大量稀釋各種化學(xué)誘變劑常用的劑量和處理時(shí)間誘變劑誘變劑的劑量處理時(shí)間962）影響誘變效果的因素出發(fā)菌株的遺傳特性；誘變劑；菌種的生理狀態(tài)；被處理菌株的預(yù)培養(yǎng)和后培養(yǎng)條件；誘變處理時(shí)的外界條件等。選擇合適的出發(fā)菌株采用分散狀態(tài)的孢子懸浮液處理采用單核細(xì)胞（或核質(zhì)體）處理注意微生物的生理狀態(tài)適宜的誘變劑量2）影響誘變效果的因素出發(fā)菌株的遺傳特性；選擇合適的出發(fā)菌株973）篩選的方法制定篩選方案方案設(shè)計(jì)的中心內(nèi)容是確定誘變篩選流程。出發(fā)菌種（砂土管或冷凍管）↓斜面→或肉湯培養(yǎng)24h↓單孢子懸液↓誘變處理↓稀釋涂布平板↓挑取單菌落傳種斜面↓菌懸液誘變處理——處理前后的孢子液或細(xì)菌懸液作活菌計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)其存活率——觀察單菌落形態(tài)并統(tǒng)計(jì)其形態(tài)變異率3）篩選的方法制定篩選方案方案設(shè)計(jì)的中心內(nèi)容是確定誘變篩選流98搖瓶初篩↓挑出高產(chǎn)斜面↓菌種保藏（砂土管、凍干管或制備固體孢子）↓搖瓶復(fù)篩（復(fù)篩次數(shù)及搖瓶數(shù)以及培養(yǎng)基種類根據(jù)情況決定）↓挑出高產(chǎn)菌株作穩(wěn)定性試驗(yàn)和菌種特性考察↓放大試驗(yàn)罐、中試考察↓大型投產(chǎn)試驗(yàn)傳種斜面（或直接用固體孢子）——對(duì)照組——對(duì)照組搖瓶初篩傳種斜面（或直接用固體孢子）——對(duì)照組——對(duì)照組99突變株的篩選方法一般經(jīng)誘變后，再經(jīng)中間培養(yǎng)、淘汰野生型、檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型、確定生長(zhǎng)譜等。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌絲過(guò)濾法、差別殺菌法和饑餓法等。營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出方法有：逐個(gè)測(cè)定法、夾層平板法、限量營(yíng)養(yǎng)法和影印接種法等。突變株的篩選方法一般經(jīng)誘變后，再經(jīng)中間培養(yǎng)、淘汰野生型、檢出100影印平板（Replicaplating）法是Lederberg夫婦在1952年建立影印平板（Replicaplating）法是Lederbe101用梯度平板法定向培育若干代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌抗代謝物肌苷Bacilluspumilus（短小芽胞桿菌）8-氮鳥(niǎo)嘌呤肌苷Corynebacteriumsp（一種棒狀桿菌）6-硫鳥(niǎo)嘌呤腺嘌呤Salmonellatyphimarium（鼠傷寒沙門氏菌）2，6-二氨基嘌呤煙堿酸Chlamydomonaseugametos（一種衣藻）3-乙酰吡啶色氨酸Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）6-甲基色氨酸甲硫氨酸Escherichiacoli（大腸桿菌）乙硫氨酸酪氨酸E.coli對(duì)氟苯丙氨酸吡咯疊氮（pyrrolnitrin）Pseudomonasaureofaciens（金色假單胞菌）6-氟色氨酸亮氨酸S.typhi三氟-DL-亮氨酸用梯度平板法定向培育若干代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌抗代102微生物制藥課件103根據(jù)形態(tài)變異淘汰低產(chǎn)菌株，根據(jù)平皿反應(yīng)挑取高產(chǎn)菌株。搖瓶篩選法瓊脂塊篩選法篩選自動(dòng)化和篩選工具微型化隨機(jī)篩選理性化篩選運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株。根據(jù)形態(tài)變異淘汰低產(chǎn)菌株，根據(jù)平皿反應(yīng)挑取高產(chǎn)菌株。搖瓶篩選104微生物制藥課件105理性化篩選初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選：降低終產(chǎn)物濃度篩選抗反饋突變菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物（主要是抗生素）高產(chǎn)菌株的篩選：利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選篩選負(fù)變株的回復(fù)突變株篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株理性化篩選初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選：次級(jí)代謝產(chǎn)物（主要是抗106降低終產(chǎn)物濃度降低終產(chǎn)物濃度107雜交育種——一般指兩個(gè)不同基因型的菌株通過(guò)接合或原生質(zhì)體融合，使遺傳物質(zhì)重新組合，再?gòu)闹蟹蛛x和篩選出具有新性狀的菌株。真菌、放線菌和細(xì)菌均可進(jìn)行雜交育種。3、雜交育種雜交育種——一般指兩個(gè)不同基因型的菌株通過(guò)接合或原生質(zhì)體融合1081）常規(guī)的雜交育種遺傳標(biāo)記異核體形成雜合二倍體的形成染色體交換和單倍體1）常規(guī)的雜交育種遺傳標(biāo)記1092）原生質(zhì)體融合2）原生質(zhì)體融合110A.標(biāo)記菌株的篩選供融合用的兩個(gè)親株要求性能穩(wěn)定并帶有遺傳標(biāo)記，以利于融合子的選擇。采用的遺傳標(biāo)記一般以營(yíng)養(yǎng)缺陷型和抗藥性等遺傳性狀為標(biāo)記。通過(guò)采用多種抗生素及其他藥物，以梯度平板法進(jìn)行粗選，再用具有抗性的抗性生物制備不同濃度的平板，進(jìn)行較細(xì)的篩選。A.標(biāo)記菌株的篩選供融合用的兩個(gè)親株要求性能穩(wěn)定并帶有遺傳標(biāo)111B.原生質(zhì)體的制備在高滲透壓溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿溉コ?xì)胞壁，剩下的是由細(xì)胞膜包裹的原生質(zhì)體。（細(xì)菌或放線菌可用溶菌酶或青霉素處理，酵母菌和霉菌可用蝸牛酶或其他相應(yīng)的脫壁酶）溶菌酶蝸牛酶B.原生質(zhì)體的制備在高滲透壓溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿溉コ?xì)胞壁112影響原生質(zhì)體制備的因素：菌體的預(yù)處理菌體的培養(yǎng)時(shí)間酶濃度酶解溫度酶解時(shí)間滲透壓穩(wěn)定劑用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-環(huán)絲氨酸等處理細(xì)菌，使菌體細(xì)胞壁對(duì)酶的敏感性增強(qiáng)。一般選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌體，這時(shí)細(xì)胞正在生長(zhǎng)、代謝旺盛，細(xì)胞壁對(duì)酶解最為敏感。一般控制在20～40℃。充足的酶解時(shí)間對(duì)于細(xì)菌或放線菌一般采用蔗糖、丁二酸鈉；對(duì)于酵母菌則采用山梨醇、甘露醇等；對(duì)于霉菌則采用KCl和NaCl等。一定濃度的Ca2+、Mg2+等二價(jià)陽(yáng)離子可增加原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性。影響原生質(zhì)體制備的因素：菌體的預(yù)處理用EDTA、甘氨酸、青霉113C.原生質(zhì)體的融合和再生融合是把兩個(gè)親株的原生質(zhì)體混合在一起，在融合劑PEG和Ca2+作用下，發(fā)生原生質(zhì)體的融合。原生質(zhì)體融合后的重組子要成為一個(gè)無(wú)性繁殖系，首先必須再生，即能重建細(xì)胞壁，恢復(fù)完整細(xì)胞并生長(zhǎng)、分裂。影響原生質(zhì)體融合的因素：菌體的前處理；菌體的培養(yǎng)時(shí)間；融合劑的濃度；融合劑作用的時(shí)間；陽(yáng)離子的濃度；融合的溫度；融合體系的pH值等。影響原生質(zhì)體再生的因素：菌種自身的再生性能；原生質(zhì)體制備的條件；再生培養(yǎng)基成分；再生培養(yǎng)條件等。C.原生質(zhì)體的融合和再生融合是把兩個(gè)親株的原生質(zhì)體混合在一起114檢查原生質(zhì)體形成和再生的指標(biāo)：原生質(zhì)體的形成率原生質(zhì)體的再生率將用酶處理前的菌體經(jīng)無(wú)菌水系列稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基平板上，計(jì)出原菌數(shù)A；將用酶處理后得到的原生質(zhì)體分別經(jīng)如下兩個(gè)過(guò)程的處理：用無(wú)菌水適當(dāng)稀釋，在完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計(jì)數(shù)，由于原生質(zhì)體在低滲透壓條件下會(huì)破裂失活，所以生長(zhǎng)出的菌落數(shù)為未形成原生質(zhì)體的原菌數(shù)B；用高滲液適當(dāng)稀釋，在再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計(jì)數(shù)，生長(zhǎng)出的菌落數(shù)為原生質(zhì)體再生的菌數(shù)和未形成原生質(zhì)體的原菌數(shù)之和C。原生質(zhì)體形成率＝A–BA×100％原生質(zhì)體再生率＝C–BA－B×100％檢查原生質(zhì)體形成和再生的指標(biāo)：原生質(zhì)體的形成率將用酶處理前的115D.融合子的選擇融合子的選擇主要依靠?jī)蓚€(gè)親株的選擇性遺傳標(biāo)記。在選擇性培養(yǎng)基上，通過(guò)兩個(gè)親株的遺傳標(biāo)記互補(bǔ)而挑選出融合子。在融合體再生后，進(jìn)行幾代自然分離、選擇，才能確定真正融合子。D.融合子的選擇融合子的選擇主要依靠?jī)蓚€(gè)親株的選擇性遺傳標(biāo)記116原生質(zhì)體融合與傳統(tǒng)雜交方法相比有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1、重組頻率高并可能有幾個(gè)親株同時(shí)進(jìn)行雜交；2、可以進(jìn)行種間甚至屬間雜交并形成穩(wěn)定的重組體，但重組的頻率比較低；3、被滅活的原生質(zhì)體進(jìn)行融合后，仍可能活的重組體；4、原生質(zhì)體的形成與再生本身就可作為鏈霉菌的一種育種方法。原生質(zhì)體融合與傳統(tǒng)雜交方法相比有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1174、基因工程技術(shù)改良菌種體外重組DNA技術(shù)或稱基因工程、遺傳工程，是以分子遺傳學(xué)的理論為基礎(chǔ)，綜合分子生物學(xué)和微生物遺傳學(xué)的最新技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一門新興技術(shù)。它是現(xiàn)代生物技術(shù)的一個(gè)重要組成方面，在工業(yè)微生物學(xué)上提供了巨大的創(chuàng)造具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的生產(chǎn)菌株的潛力。4、基因工程技術(shù)改良菌種體外重組DNA技術(shù)或稱基因工程、遺傳118（1）DNA重組過(guò)程基因的分離DNA分子的切割與連接載體引入宿主細(xì)胞重組體的選擇和鑒定外源基因的表達(dá)（1）DNA重組過(guò)程基因的分離119（2）重組DNA技術(shù)在微生物藥物菌種改良研究中的應(yīng)用提高微生物藥物的單位產(chǎn)量1.增加限速酶基因拷貝數(shù),提高菌種的生產(chǎn)能力2.引入抗性基因和調(diào)節(jié)基因,增加微生物藥物單位產(chǎn)量3.克隆抗生素的全部結(jié)構(gòu)基因,改變表達(dá)體系提高產(chǎn)量（2）重組DNA技術(shù)在微生物藥物菌種改良研究中的應(yīng)用提高微生120C.構(gòu)建能產(chǎn)生半合成抗生素中間體的基因工程菌

許多半合成抗生素的中間體是由一些天然產(chǎn)物經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾獲得的，但是制備工藝較為復(fù)雜。例如半合成頭孢菌素的中間體是頭孢菌素C的衍生物7-ACA，或青霉素G和V的衍生物7-ADOCA。B.阻斷支路代謝，增加有效組分的含量抗蟲(chóng)抗生素阿弗米丁基因工程菌的構(gòu)建——阿