(完整版)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)原理簡(jiǎn)介(精)

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)原理簡(jiǎn)介20世紀(jì)60年代即有人利用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定水樣中細(xì)菌含量和菌尿癥患者尿液檢查.1977年Halman等將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)相結(jié)合，創(chuàng)建了化學(xué)發(fā)光免疫分析法，保留了化學(xué)發(fā)光的高度靈敏性，又克服了它特異性不足的缺陷。近年來對(duì)技術(shù)與儀器的不斷改進(jìn)，使此技術(shù)已成為一種特異，靈敏，準(zhǔn)確的自動(dòng)化的免疫學(xué)檢測(cè)方法。1996年推出的電化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù),在反應(yīng)原理上又具有一些新的特點(diǎn)。這兩種技術(shù)目前已在國(guó)內(nèi)一些大型醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室用于常規(guī)免疫學(xué)檢驗(yàn)。一、化學(xué)發(fā)光免疫分析法化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescenceimmunoassay,CLIA）是把免疫反應(yīng)與發(fā)光反應(yīng)結(jié)合起來的一種定量分析技術(shù)，既具有發(fā)光檢測(cè)的高度靈敏性，又具有免疫分析法的高度特異性。在CLIA中，主要有兩個(gè)部分,即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)與放射免疫測(cè)定中的抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)相同化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)則是利用某些化合物如魯米諾（luminol）、異魯米諾（isolu—^inol）、金剛烷（AMPPD）及吖啶酯（AE）等經(jīng)氧化劑氧化或催化劑催化后成為激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)就會(huì)將剩余能量轉(zhuǎn)變?yōu)楣庾?，隨后利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子的產(chǎn)額。將發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記于抗原（稱為化學(xué)發(fā)光免疫分析）或抗體上（稱為免疫化學(xué)發(fā)光分析），經(jīng)氧化劑或催化劑的激發(fā)后，即可快速穩(wěn)定的發(fā)光，其產(chǎn)生的光量子的強(qiáng)度與所測(cè)抗原的濃度可成比例。亦可將氧化劑（如堿性磷酸酶等）或催化劑標(biāo)記于抗原或抗體上，當(dāng)抗原抗體反應(yīng)結(jié)束后分離多余的標(biāo)記物，再與發(fā)光底物反應(yīng),其產(chǎn)生的光量子的強(qiáng)度也與待測(cè)抗原的濃度成比例。發(fā)光免疫分析的靈敏度高于包括RIA在內(nèi)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，檢測(cè)范圍寬，測(cè)試時(shí)間短,僅需30—60min即可。試劑貨架壽命長(zhǎng)，穩(wěn)定性好，具有大規(guī)模自動(dòng)化測(cè)試的功能。這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展很快，已有許多廠商生產(chǎn)各具特色的測(cè)定儀器與配套試劑。目前我國(guó)儀器與試劑均需進(jìn)口，測(cè)定成本較高。其反應(yīng)過程分為以下兩個(gè)階段。(完整版)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)原理簡(jiǎn)介(精)(1)待測(cè)抗原(Ag)和一定量的堿性磷酸酶標(biāo)記抗原(ALP-Ag)同時(shí)與一定量的特異性抗體(Ab)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合.ALP-Ag—Ab的量與Ag的量之間存有競(jìng)爭(zhēng)抑制的關(guān)系，即Ag的量越多，形成的Ag-Ab的量就越多，ALP-Ag-Ab的量越少。反之亦然。(2)加入(羊)抗鼠IgG包被的磁性顆粒，捕獲ALP—Ag—Ab(其中的Ab為鼠單克隆抗體)，在磁場(chǎng)作用下將ALP-Ag—Ab與ALP—Ag分開，經(jīng)洗滌并吸棄廢液后，加入化學(xué)發(fā)光底物(dioxetane-phosphate,AMPPD)，后者為帶有二氧四聯(lián)環(huán)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的化合物，在ALP的作用下去掉磷酸根，生成不穩(wěn)定的中間體。中間體迅速分解并同時(shí)釋放出光子。光子的生成量與ALP-Ag—Ab的量成正比，由此可計(jì)算出待測(cè)抗原(Ag)的量。將一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液與待測(cè)標(biāo)本同樣處理，即可繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線并據(jù)此查出標(biāo)本中待測(cè)抗原的濃度。二、電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemi1uminescenceimmunoassay，ECLlA)克服了CLlA技術(shù)中每一發(fā)光分子只能利用一次的缺點(diǎn)，其基本原理是利用三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+。和三丙胺(TPA)在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng),分析過程可通過電場(chǎng)精確控制，因此具有特異性好、靈敏度高、線性測(cè)定范圍寬、操作的自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn).但目前這項(xiàng)技術(shù)所需的儀器以及配套試劑均需進(jìn)口，測(cè)定成本較高°ECLIA的體系中主要有兩個(gè)部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng).免疫反應(yīng)系統(tǒng)與放射免疫測(cè)定中的抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)相同，因此具有較高的特異性；電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程.在電極表面的電場(chǎng)作用下，二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+失去一個(gè)電子，成為三價(jià)的三聯(lián)吡啶釕]Ru(bpy)3]3+,三丙胺(TPA)也失去一個(gè)電子被氧化隨即脫氫成三丙胺自由基自由基傳遞一個(gè)電子給三價(jià)的三聯(lián)吡啶釕使還原成激發(fā)態(tài)的二價(jià)三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+,后者很不穩(wěn)定，以發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)為620nm的光子的形式釋放能量而回到基態(tài)。這個(gè)過程可反復(fù)進(jìn)行，直到電場(chǎng)中的三丙胺耗盡。（完整版）化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)原理簡(jiǎn)介（精）因此測(cè)定過程中的一個(gè)抗原抗體復(fù)合物可產(chǎn)生許多光子信號(hào)，從而產(chǎn)生生物放大效應(yīng)，極大地提高了方法的靈敏度.此外測(cè)定方法還應(yīng)用了鏈霉親合素，生物素技術(shù)、磁性分離技術(shù)等，使其準(zhǔn)確性、靈敏度以及自動(dòng)化程度都很高。實(shí)測(cè)技術(shù)有雙抗體夾心法與競(jìng)爭(zhēng)法，下面以雙抗體夾心法為例,簡(jiǎn)述反應(yīng)過程如下。（1）待測(cè)抗原（Ag）、一定量的生物素化抗第一位點(diǎn)單克隆抗體（Ab）和三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+.標(biāo)記的抗第二位點(diǎn)單克隆抗體于反應(yīng)體系中相互結(jié)合，形成相對(duì)分子質(zhì)量大的抗原抗體”夾心”復(fù)合物。Ag+Ab+[Ru（bpy）]2+Ab[Ru（bpy）3]2+Ab—Ag—Ab由于上述的兩種單克隆抗體在試劑中都是定量的，因此待測(cè)抗原的量與抗原抗體復(fù)合物的量成正的線性關(guān)系。（2）加入鏈霉親合素包被的磁性微粒,通過生物素與鏈霉親合素的反應(yīng)使上述大分子復(fù)合物與磁性微粒緊密結(jié)合。（3）將上述反應(yīng)體系通過蠕動(dòng)泵吸入測(cè)量室中,磁性微粒被工作電極下的磁鐵吸附于電極表面，未結(jié)合的游離物均被洗棄。再通