細(xì)胞免疫熒光技術(shù)課件

細(xì)胞免疫熒光技術(shù)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)1實驗?zāi)康恼莆彰庖邿晒饧夹g(shù)的基本原理熟悉細(xì)胞免疫熒光技術(shù)的方法了解在免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中如何獲得好的實驗結(jié)果實驗?zāi)康恼莆彰庖邿晒饧夹g(shù)的基本原理2實驗原理原位檢測抗原抗體特異反應(yīng)間接法間接熒光抗體染色法示意圖抗原抗體熒光素標(biāo)記的抗抗體激發(fā)光顯示熒光Hela細(xì)胞Vinculin實驗原理原位檢測間接熒光抗體染色法示意圖抗原抗體熒光素標(biāo)記3實驗用品試劑:固定液:4%PFA細(xì)胞通透:0、2%TritonX封閉試劑:10%正常山羊血清一抗:小鼠源抗Vinculin單克隆抗體二抗:AlexaFluor555標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGDAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)PBS洗滌緩沖液:PH7、4材料:Hela細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)皿儀器:熒光顯微鏡實驗用品試劑:材料:4實驗步驟一,細(xì)胞制備與細(xì)胞固定將細(xì)胞鋪在24孔板中將細(xì)胞培養(yǎng)至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗滌PBS洗滌實驗步驟一,細(xì)胞制備與細(xì)胞固定將細(xì)胞鋪在將細(xì)胞培養(yǎng)加5實驗步驟二,細(xì)胞免疫熒光ICC染色0、2%TritonX處理5min封閉室溫30min4℃過夜37℃1-2小時37℃5-10min熒光顯微鏡觀察加入一抗加入二抗加入DAPI復(fù)染PBS洗滌PBS洗滌PBS洗滌實驗步驟二,細(xì)胞免疫熒光ICC染色0、2%封6實驗結(jié)果三,觀察

humanHeLacells實驗結(jié)果三,觀察

humanHeLacells7實驗中應(yīng)注意的問題

細(xì)胞不要鋪的過密:60-70%防止細(xì)胞污染

固定時間不要太長,一般10-30min

TrionX處理時間不宜過長,膜蛋白可不必處理選擇合適的封閉液二抗孵育后,一定要洗干凈必要時用恒溫?fù)u床搖洗實驗中應(yīng)注意的問題細(xì)胞不要鋪的過密:60-70%8

1、免疫熒光技術(shù)

2、免疫酶技術(shù)

3、免疫親與技術(shù)

4、膠體金技術(shù)

標(biāo)記物

使抗體或抗原抗體復(fù)合物在各種顯微鏡下可見的物質(zhì)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)1、免疫熒光技術(shù)標(biāo)記物免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)9免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)注意事項選擇合適的方法材料要留好選擇抗體選擇標(biāo)記酶封閉液的選擇設(shè)定對比實驗免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)注意事項選擇合適的方法10考慮題檢測Hela細(xì)胞中蛋白A定位情況,考慮應(yīng)選擇什么方法,用什么儀器觀察？A考慮題檢測Hela細(xì)胞中蛋白A定位情況,考慮應(yīng)選擇什么方法,11疑難解答一,缺乏染色

可能的原因無抗原抗體失效固定不充分過度固定抗原修復(fù)無效不兼容的二抗和一抗漏用試劑或未按正確的順序加入試劑相應(yīng)的措施用原位雜交方法檢測蛋白表達(dá)按說明書儲存抗體;分裝抗體;避免反復(fù)凍融增加固定時間或改用不同的固定劑減少固定時間;抗原修復(fù)增加修復(fù)時間或更換修復(fù)液使用可以與一抗結(jié)合的二抗重復(fù)染色并確定使用的試劑和加入的順序疑難解答一,缺乏染色可能的原因相應(yīng)的措施12二,高背景二,高背景13

可能的原因一抗或二抗的濃度過高一抗和/或二抗與組織的非特異性結(jié)合組織過于干燥試劑粘附在舊的或未制備好的玻片上相應(yīng)的措施預(yù)實驗摸索最佳濃度一抗孵育前封閉(最好是二抗來源的血清)在染色過程中避免組織干燥用新鮮制備或購買的玻片進(jìn)行實驗可能的原因相應(yīng)的措施14三,細(xì)胞/組織的形態(tài)被破壞三,細(xì)胞/組織的形態(tài)被破壞15

可能的原因抗原修復(fù)方法過于劇烈組織切片從玻片上脫落組織切片撕裂或褶皺,切片下有氣泡組織形態(tài)難以分辨組織固定不充分,自發(fā)裂解

相應(yīng)的措施預(yù)實驗摸索合適的修復(fù)條件增加固定時間;烤片;使用新鮮準(zhǔn)備的帶有充足電荷的玻片使用鋒利的刀片;分析時避開受損的區(qū)域切片薄一些;冰凍過程形成冰晶,蔗糖脫水及時固定;增加固定時間;提高固定劑/組織的比例;

將組織切得較小可能的原因相應(yīng)的措施16四,染色不正確

可能的原因固定方法對于抗原不合適抗原修復(fù)方法不合適沒有及時固定引起抗原的擴散

相應(yīng)的措施嘗試不同的固定劑或增加固定時間嘗試改變抗原修復(fù)條件立即固定組織;嘗試用交聯(lián)性固定劑替換有機(醇類)固定劑四,染色不正確可能的原因相應(yīng)的措施17感謝您的聆聽！感謝您的聆聽！18細(xì)胞免疫熒光技術(shù)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)19實驗?zāi)康恼莆彰庖邿晒饧夹g(shù)的基本原理熟悉細(xì)胞免疫熒光技術(shù)的方法了解在免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中如何獲得好的實驗結(jié)果實驗?zāi)康恼莆彰庖邿晒饧夹g(shù)的基本原理20實驗原理原位檢測抗原抗體特異反應(yīng)間接法間接熒光抗體染色法示意圖抗原抗體熒光素標(biāo)記的抗抗體激發(fā)光顯示熒光Hela細(xì)胞Vinculin實驗原理原位檢測間接熒光抗體染色法示意圖抗原抗體熒光素標(biāo)記21實驗用品試劑:固定液:4%PFA細(xì)胞通透:0、2%TritonX封閉試劑:10%正常山羊血清一抗:小鼠源抗Vinculin單克隆抗體二抗:AlexaFluor555標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGDAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)PBS洗滌緩沖液:PH7、4材料:Hela細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)皿儀器:熒光顯微鏡實驗用品試劑:材料:22實驗步驟一,細(xì)胞制備與細(xì)胞固定將細(xì)胞鋪在24孔板中將細(xì)胞培養(yǎng)至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗滌PBS洗滌實驗步驟一,細(xì)胞制備與細(xì)胞固定將細(xì)胞鋪在將細(xì)胞培養(yǎng)加23實驗步驟二,細(xì)胞免疫熒光ICC染色0、2%TritonX處理5min封閉室溫30min4℃過夜37℃1-2小時37℃5-10min熒光顯微鏡觀察加入一抗加入二抗加入DAPI復(fù)染PBS洗滌PBS洗滌PBS洗滌實驗步驟二,細(xì)胞免疫熒光ICC染色0、2%封24實驗結(jié)果三,觀察

humanHeLacells實驗結(jié)果三,觀察

humanHeLacells25實驗中應(yīng)注意的問題

細(xì)胞不要鋪的過密:60-70%防止細(xì)胞污染

固定時間不要太長,一般10-30min

TrionX處理時間不宜過長,膜蛋白可不必處理選擇合適的封閉液二抗孵育后,一定要洗干凈必要時用恒溫?fù)u床搖洗實驗中應(yīng)注意的問題細(xì)胞不要鋪的過密:60-70%26

1、免疫熒光技術(shù)

2、免疫酶技術(shù)

3、免疫親與技術(shù)

4、膠體金技術(shù)

標(biāo)記物

使抗體或抗原抗體復(fù)合物在各種顯微鏡下可見的物質(zhì)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)1、免疫熒光技術(shù)標(biāo)記物免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)27免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)注意事項選擇合適的方法材料要留好選擇抗體選擇標(biāo)記酶封閉液的選擇設(shè)定對比實驗免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)注意事項選擇合適的方法28考慮題檢測Hela細(xì)胞中蛋白A定位情況,考慮應(yīng)選擇什么方法,用什么儀器觀察？A考慮題檢測Hela細(xì)胞中蛋白A定位情況,考慮應(yīng)選擇什么方法,29疑難解答一,缺乏染色

可能的原因無抗原抗體失效固定不充分過度固定抗原修復(fù)無效不兼容的二抗和一抗漏用試劑或未按正確的順序加入試劑相應(yīng)的措施用原位雜交方法檢測蛋白表達(dá)按說明書儲存抗體;分裝抗體;避免反復(fù)凍融增加固定時間或改用不同的固定劑減少固定時間;抗原修復(fù)增加修復(fù)時間或更換修復(fù)液使用可以與一抗結(jié)合的二抗重復(fù)染色并確定使用的試劑和加入的順序疑難解答一,缺乏染色可能的原因相應(yīng)的措施30二,高背景二,高背景31

可能的原因一抗或二抗的濃度過高一抗和/或二抗與組織的非特異性結(jié)合組織過于干燥試劑粘附在舊的或未制備好的玻片上相應(yīng)的措施預(yù)實驗摸索最佳濃度一抗孵育前封閉(最好是二抗來源的血清)在染色過程中避免組織干燥用新鮮制備或購買的玻片進(jìn)行實驗可能的原因相應(yīng)的措施32三,細(xì)胞/組織的形態(tài)被破壞三,細(xì)胞/組織的形態(tài)被破壞33

可能的原因抗原修復(fù)方法過于劇烈組織切片從玻片上脫落組織切片撕裂或褶皺,切片下有氣泡組織形態(tài)難以分辨組織固定不充分,自發(fā)裂解

相應(yīng)的措施預(yù)實驗摸索合適的修復(fù)條件增加固定時間;烤片;使用新鮮準(zhǔn)備的帶有充足電荷的玻片使用鋒利的刀片;分析時避開受損的區(qū)域切片薄一些;冰凍過程形成冰晶,蔗糖脫水及時固定;增加固定時間;提高固定劑/組