酶化學(xué)III-作用機(jī)制課件

酶的作用機(jī)制和活性調(diào)節(jié)一、酶的活性部位

1、活性中心的概念

酶是蛋白質(zhì)，研究表明，酶的特殊催化能力只局限于在大分子的一定區(qū)域，也就是說只有少數(shù)特異的氨基酸殘基參與底物結(jié)合及催化作用。這些特異的氨基酸殘基比較集中的區(qū)域，即與酶活力直接相關(guān)的區(qū)域稱為酶的活性部位(activesite)或活性中心(activecenter)。參與構(gòu)成酶的活性中心和維持酶的空間構(gòu)象所必需的基團(tuán)稱為酶分子的必需基團(tuán)(necessarygroup)組成酶活性中心的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)主要有Glu和Asp的-COOH，Lys的ε-NH2，His的咪唑基，Ser的-OH，Cys的-SH，Tyr的側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合部位催化部位酶活性中心

結(jié)合部位：負(fù)責(zé)與底物結(jié)合，決定酶的專一性催化部位：負(fù)責(zé)催化底物鍵的斷裂形成新鍵，決定酶的催化性質(zhì)和催化能力2、活性中心與必需基團(tuán)

調(diào)控部位(Regulatorysite):

酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合的部位，從而引起酶分子空間構(gòu)象的變化，對酶起激活或抑制作用3、活性中心的特點

活性部位在酶分子的總體中只占相當(dāng)小的部分，通常只占整個酶分子體積的1%~2%幾乎所有的酶都由100多個氨基酸殘基組成，而活性部位只有幾個氨基酸殘基所構(gòu)成，酶分子的催化部位一般只由2~3個氨基酸殘基組成，而結(jié)合部位的殘基數(shù)目因不同的酶而異，可能是一個，也可能是數(shù)個牛胰核糖核酸酶A124His12His119Lys41溶菌酶129Asp52Glu35木瓜蛋白酶212Cys25His159枯草桿菌蛋白酶275His64Ser221胰凝乳蛋白酶245His57Asp102Ser195酶氨基酸殘基數(shù)活性中心殘基碳酸酐酶258His93—Zn—His95↓His117一些酶活性中心的氨基酸殘基

酶的活性部位是一個三維實體

酶的活性中心是一個三維結(jié)構(gòu)，組成活性中心的氨基酸殘基在一級結(jié)構(gòu)上可以相距很遠(yuǎn)，可能位于同一條肽鏈的不同部位也可能位于不同的肽鏈上，但通過肽鏈的折疊，在空間結(jié)構(gòu)上都處于十分臨近的位置?；钚圆课坏娜S結(jié)構(gòu)是由酶的一級結(jié)構(gòu)決定且在一定外界條件下形成的。酶的高級結(jié)構(gòu)受到影響，酶的活性部位會遭到破壞，表現(xiàn)為酶活力的下降或喪失酶與底物的誘導(dǎo)契合

酶活性部位的柔性或可運(yùn)動性在研究酶的變性過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶分子的整體構(gòu)象還沒有受到明顯影響之前，活性部位已大部分被破壞，因而造成活性的喪失，說明酶的活性部位相對于整個酶分子來說更具柔性，這種柔性很可能正是表現(xiàn)其催化活性的一個必要因素

酶和底物之間的作用力

酶與底物之間通過次級鍵相互識別和結(jié)合

非特異性共價修飾：修飾劑和氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)引起共價結(jié)合、氧化或還原等修飾反應(yīng)非必需基團(tuán)：修飾后不引起酶活力的變化必需基團(tuán)：修飾后引起酶活力降低或者喪失必需和非必需基團(tuán)的鑒別判斷必需基團(tuán)的實驗依據(jù)：

酶活力喪失程度和修飾劑濃度成一定比例關(guān)系

底物或與活性部位結(jié)合的可逆抑制劑可保護(hù)共價修飾劑的抑制作用例1：DFP或DIFP(二異丙基氟磷酸)對絲氨酸的共價修飾特異性共價修飾：修飾劑專一地修飾酶活性部位的某一氨基酸殘基，使其失活例2:TPCK(N-對甲苯磺酰苯丙酰氯甲基酮)TPCK修飾His，使His烷基化(2)、X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析法X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析可以解析酶分子的三維結(jié)構(gòu)，有助于了解酶活性部位氨基酸殘基所處的相對位置和實際狀態(tài)，以及與活性部位有關(guān)的其他基團(tuán)1965年P(guān)hillips等人解析溶菌酶的空間結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制

通過三維結(jié)構(gòu)可以看出：活性部位有關(guān)氨基酸的排列位置酶-底物復(fù)合物中，底物周圍氨基酸的排列狀況

根據(jù)被水解的糖苷鍵鄰近氨基酸分析，確定催化基團(tuán)為Glu35和Asp52胰凝乳蛋白酶活性部位的分析SerAspHis

Ser195、

His57、

Asp102聯(lián)在一起形成“電荷中繼網(wǎng)”，使得Ser195的羥基具有非常高的親和性

Ile16是胰凝乳蛋白酶原轉(zhuǎn)變成酶的關(guān)鍵1985年Gardell將羧肽酶A突變：Tyr248Phe248，結(jié)果：kcat和天然酶一樣，Km值高出6倍說明Tyr248主要參與底物的結(jié)合，與催化活性無關(guān)1987年Craik將胰蛋白酶突變：Asp102Asn102，導(dǎo)致kcat低5000倍，水解酯的活性僅為天然酶的10-4

說明對蛋白酶的催化活性是必需的定點突變研究活性中心的實例：二、影響酶催化效率的因素(一)底物和酶的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)

鄰近效應(yīng)(approximation,proximity)

指兩個反應(yīng)的分子，它們反應(yīng)的基團(tuán)需要互相靠近，才能反應(yīng)定向效應(yīng)(orientation)

定義：由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點

定向效應(yīng)包括：

反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)之間(雙底物反應(yīng)基團(tuán)鄰近)酶的催化基團(tuán)和底物的反應(yīng)基團(tuán)

活性中心內(nèi)的定向使反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)

酶在發(fā)揮作用前，必須與底物密切結(jié)合

酶與底物相互接近時，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互結(jié)合

酶的構(gòu)象改變有利于底物結(jié)合；底物在酶的誘導(dǎo)下發(fā)生變形，處于不穩(wěn)定狀態(tài)(過渡態(tài))，易受催化基團(tuán)進(jìn)攻

過渡態(tài)的底物與酶的活性中心結(jié)構(gòu)最相吻合(三)酸堿催化(acid-basecatalysis)定義：酸堿催化是通過瞬時的向反應(yīng)物提供質(zhì)子或者從反應(yīng)物接受質(zhì)子從而穩(wěn)定過渡態(tài)，加速反應(yīng)的一類催化機(jī)制

專一的酸堿催化(狹義酸堿催化)

在水溶液中通過高反應(yīng)性的H+和OH-進(jìn)行的催化，即強(qiáng)酸強(qiáng)堿的催化。細(xì)胞一般處于中性pH條件下，H+和OH-濃度很低，因此細(xì)胞環(huán)境通常不是專一的酸堿催化總酸堿催化(廣義酸堿催化)

通過H+和OH-以及能夠提供H+和OH-的供體進(jìn)行的催化，生理條件不是強(qiáng)酸強(qiáng)堿而是近于中性的環(huán)境，因此高反應(yīng)性的H+和OH-環(huán)境不存在，因此廣義的酸堿催化指的是細(xì)胞內(nèi)的弱酸弱堿參與的接受H+和提供H+的催化許多酶的活性部位存在幾種參與總酸堿催化作用的功能基團(tuán)，如氨基、羧基、巰基、酚羥基以及咪唑基，它們能在近中性的pH范圍內(nèi)作為質(zhì)子受體或者供體

影響酸堿催化反應(yīng)速率的因素：酸或者堿的強(qiáng)度(pK值)質(zhì)子傳遞速率例：His的重要性

咪唑基pK約為6.0，在生理pH下,酸和堿形式共存，可接受質(zhì)子和提供質(zhì)子質(zhì)子傳遞速率十分迅速，其半衰期小于10-10s從進(jìn)化上推測His不是作為蛋白的結(jié)構(gòu)成分，而是被選擇作為酶分子的催化結(jié)構(gòu)而保留下來(四)共價催化(covalentcatalysis)定義：

又稱親核催化(nucleophiliccatalysis)或親電催化(electrophiliccatalysis)，在催化時，親核催化劑或者親電催化劑能夠分別放出電子或汲取電子并作用于底物的缺電子中心或負(fù)電中心，迅速形成不穩(wěn)定的共價中間復(fù)合物，降低反應(yīng)活化能，使反應(yīng)加速

親核催化

未成鍵電子對進(jìn)攻缺電子中心形成共價結(jié)合，迅速形成不穩(wěn)定的共價中間復(fù)合物，降低反應(yīng)活化能，促使產(chǎn)物生成(五)金屬離子催化需要金屬的酶(1/3的酶)金屬酶(metalloenzymes)：

含緊密結(jié)合的金屬離子，多屬于過渡金屬如Fe2+

、Fe3+

、Cu2+

、Zn2+

、Mn2+

、Co3+金屬激活的酶(metal-activatedenzymes)：

含松散結(jié)合的金屬離子，通常為堿和堿土金屬離子，如Na+

、K+

、Ca2+

、Mg2+金屬離子以3種主要途徑參與催化過程通過結(jié)合底物為反應(yīng)定向

與底物分子形成絡(luò)合鍵，作為金屬橋參與催化通過可逆地改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)

金屬離子價鍵的變化，作為酶的輔助因子參與電子的轉(zhuǎn)移，如Cu2+

、

Fe3+通過靜電穩(wěn)定或屏蔽負(fù)電荷激酶的底物是Mg2+-ATP復(fù)合物(六)活性部位微環(huán)境的影響

活性部位的疏水環(huán)境導(dǎo)致反應(yīng)活性和反應(yīng)速率的改變

非極性環(huán)境中的介電常數(shù)較水介質(zhì)中要低非極性環(huán)境中兩個帶電荷基團(tuán)間的靜電作用比在極性環(huán)境中要顯著提高

底物分子與酶的活性部位結(jié)合后，被埋沒在疏水裂隙中，增強(qiáng)了底物分子與催化基團(tuán)之間的作用力

疏水環(huán)境大大有利于酶的催化作用三、酶活性的調(diào)節(jié)(一)別構(gòu)調(diào)節(jié)(allostericregulation)某些酶分子在活性中心外存在另一配體的結(jié)合部位(別構(gòu)部位)別構(gòu)部位與配體的結(jié)合使酶活性中心構(gòu)象輕微變化而影響酶的功能

能與別構(gòu)部位結(jié)合的配體稱為別構(gòu)效應(yīng)劑，具有別構(gòu)效應(yīng)的酶稱為別構(gòu)酶

別構(gòu)效應(yīng)有別構(gòu)激活(正協(xié)同效應(yīng))和別構(gòu)抑制(副協(xié)同效應(yīng))

代謝底物經(jīng)常是別構(gòu)激活劑，而代謝產(chǎn)物往往是別構(gòu)抑制劑

別構(gòu)酶通常是寡聚酶催化亞基調(diào)節(jié)亞基別構(gòu)激活別構(gòu)酶動力學(xué)不符合米式方程(二)酶原激活酶原：某些活性酶的無活性前體蛋白酶原激活：無活性的酶原形成活性酶的過程

酶原激活的實質(zhì)：活性中心的形成或暴露過程

酶原激活的常見形式：切下一段多余的肽鏈蛋白(酶)原活性蛋白(酶)蛋白(酶)原活性蛋白(酶)胃蛋白酶原胃蛋白酶凝血酶原凝血酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶胰島素原胰島素胰蛋白酶原胰蛋白酶纖維蛋白原纖維蛋白羧肽酶原羧肽酶膠原酶原膠原酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶胃蛋白酶原的激活胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活活性最高，但不穩(wěn)定40%活性胰蛋白酶對胰腺分泌的各種蛋白酶原的激活作用胰蛋白酶原彈性蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原羧肽酶原腸激酶六肽彈性蛋白酶胰蛋白酶羧肽酶胰凝乳蛋白酶(三)共價修飾

酶的共價修飾酶蛋白肽鏈上的一些基團(tuán)可與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價結(jié)合，從而改變酶的活性，這種酶活性的調(diào)節(jié)方式稱為共價修飾，能進(jìn)行共價修飾的酶稱為共價修飾酶共價修飾的特點：

在修飾過程中，酶的活性在無活性(或低活性)和有活性(高活性)兩種狀態(tài)中改變

共價修飾的互變是由不同的酶所催化的

酶活性屬于快速調(diào)節(jié)

有激素信號啟動的共價修飾會引起級聯(lián)放大效應(yīng)常見的共價修飾形式

磷酸化與去磷酸化(最常見形式)

甲基化與去甲基化

腺苷?；c去腺苷?；?/p>

尿苷?；c去尿苷?；阴；c去乙?；?/p>

-SH與-S-S-互變磷酸化腺苷?；蜍挣；疉DP-糖基化甲基化磷酸化與去磷酸化磷酸化與去磷酸化四、同工酶

(isoenzymeorisozyme)

同工酶

催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶

同工酶的特點：

同工酶都是寡聚酶

同工酶存在同一種屬或同一個體的不同組織或者同一細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中

同工酶是長期進(jìn)化的產(chǎn)物

同工酶對進(jìn)化、發(fā)育和細(xì)胞分化的研究具有重要意義

同工酶可用于疾病的診斷乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)是了解最清楚的同工酶它催化乳酸脫氫生成丙酮酸

LDH是四聚體蛋白，由兩種亞基M(肌肉型)和H(心肌型)組成

LDH1H4LDH2H3MLDH3H2