細胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述課件

細胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料

制品的清洗與消毒清洗在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細胞的生長微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿的清洗膠塞的清洗塑料制品的清洗浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質(zhì)等先用自來水簡單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面浸泡時間：一般為過夜，不應(yīng)少于6小時清潔液常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）

強清潔液63∶1000∶200次強清洗液120∶200∶1000弱清潔液100∶100∶1000配制時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色

沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置如用手工操作需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品必要時用2%NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用消毒滅菌方法物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒的培養(yǎng)器皿，30min濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min干烤：160℃,2小時過濾：0.22μm化學消毒滅菌法70%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒抗生素主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預防培養(yǎng)物污染水水的制備：

細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水

細胞培養(yǎng)基市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點是價格便宜。缺點是配制過程繁瑣，質(zhì)量不易控制液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標準規(guī)?；a(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標準型）、DMEM-高糖（標準型）、DMEM-低糖（標準型）、McCoys5A、M199、F10等細胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇選擇培養(yǎng)基沒有一定的標準，有幾點建議可供參考：(1）建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時咨詢。(2)其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細胞。(3)根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細胞株多選RPMI1640。(4)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。制備1000mlRPMI

1640培養(yǎng)基

RPMI

1640

干粉培養(yǎng)基10.4g（1包）

蒸餾水

400ml

↓

磁力攪拌至完全溶解

↓

加三蒸餾水定容至1000ml

在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22μm孔徑濾膜的過濾器除菌，并分裝成200ml/瓶，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用前取一瓶溶解，每200ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。-------細胞培養(yǎng)液血清熱滅活：56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。如果不做細胞因子和免疫相關(guān)的實驗，建議血清不要滅活。

因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，還會影響血清的質(zhì)量。滅活后嚴重影響細胞生長速度，且細胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清PBS（Phosphate-BufferedSallines）KCl0.20gKH2PO40.20gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gDPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines）標準型CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣)0.10gKCl0.20gKH2PO40.20gMgCl2·6H2O0.10gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gD-Hanks’平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

胰蛋白酶溶液主要作用：使細胞間的蛋白質(zhì)水解，使細胞相互離散消化細胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補足D-Hanks平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中，-20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐ВＳ脻舛葹?.25%（0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.2左右胰蛋白酶溶液配制pH調(diào)整液NaHCO3溶液常用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M儲存液：用20ml雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入2mlHEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L谷氨酰胺補充液谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)使用終濃度為1-4mmol/L一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后（應(yīng)加溫30℃），過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mmol/L酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用器材和液體的準備細胞培養(yǎng)用的玻璃器材培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，160℃，2小時干烤滅菌后備用手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液15磅，121℃，20分鐘蒸氣滅菌MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用

無菌操作中的注意事項在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔操作前無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10分鐘操作時，小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用在整個無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進行哺乳動物細胞冷凍保存冷凍保存要點冷凍過程要緩慢。4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時（或過夜）→液氮長期保存凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。細胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。常用細胞冷凍保存液10％DMSO＋完全細胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）10％甘油＋完全細胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）冷凍保存細胞的解凍與復蘇要點快速解凍凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中解凍冷凍保存細胞的離心方法從液氮中取出凍存的細胞，立即放入37℃水浴中快速解凍將1－2ml凍存細胞液加入到25ml新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻用80g離心2－3分鐘，棄上清液用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細胞團，并計數(shù)細胞接種細胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3×105/ml。細胞的原代和傳代培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)原理細胞培養(yǎng)是模擬機體內(nèi)生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。由體內(nèi)直接取出組織或細胞進行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞離體時間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于研究。幼稚狀態(tài)的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)操作（鼠胎組織細胞培養(yǎng)為例）取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)結(jié)果細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層傳代細胞培養(yǎng)原理體外培養(yǎng)的原代細胞或細胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)培養(yǎng)的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次傳代細胞培養(yǎng)操作將長成單層的細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鐘在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變圓，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細胞懸液將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養(yǎng)瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進行培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)結(jié)果一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進行傳代細胞計數(shù)及活力測定

實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。具體操作：

1.蓋好蓋玻片：取血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。

2.制備計數(shù)用的細胞懸液：0.5ml細胞懸液到一離心管中，加入0.5ml臺盼藍染液（0.4％）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。3.將細胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。4.統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，分別數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中死細胞和活細胞數(shù)。5.計算原細胞懸液的細胞數(shù):按照下面公式計算細胞密度：

（細胞懸液的細胞數(shù)）/ml＝

（

四個大格子細胞數(shù)/4)

×2×104

說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。

公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

而

1ml＝1000mm3細胞培養(yǎng)常見問題解答培養(yǎng)液pH值變化太快CO2張力不對按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5％到10％改用不依賴CO2培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊松開瓶蓋1/4圈NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度

培養(yǎng)液中鹽濃度不正確在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s鹽制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液細菌、酵母或真菌污染丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來用去離子水反復沖洗玻璃器皿，然后除菌冰凍保存培養(yǎng)液將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時pH發(fā)生變化細菌或真菌污染丟棄培養(yǎng)物抗生素除菌培養(yǎng)細胞不貼壁胰蛋白酶消化過度縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度支原體污染分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物培養(yǎng)液中無貼壁因子原代細胞培養(yǎng)物污染原代培養(yǎng)組織在進入培養(yǎng)前已污染培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復沖洗組織培養(yǎng)細胞生長減慢由于更換不同培養(yǎng)液或血清比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗增加起始培養(yǎng)細胞濃度培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞讓細胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。換入新鮮配制培養(yǎng)液。補加谷氨酰胺或生長因子培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻Ｔ噭┍４娌划斞逍璞４嬖?5℃到-20℃。培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2周內(nèi)用完何時須更換培養(yǎng)基？視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素

欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？欲回收動物細胞，其離心速率一般為300xg(約1,000rpm)，5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度？冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細胞則以5x106cells/mlvial為宜冷凍管應(yīng)如何解凍？取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除DMSO？除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸