guan3動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

第3章動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)動(dòng)物的細(xì)胞與組織培養(yǎng)

定義：從動(dòng)物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理環(huán)境，在體外建立無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)（massculture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層克隆培養(yǎng)（clonalculture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

DefinitionsofTissueCultureTerms

cellculture-themaintenanceandgrowingofdispersedcellsoutsidetheorganism.Secondaryculture－Cellstakenfromaprimarycultureandpassedordividedinvitro.Thesecellshavealimitednumberofdivisionsorpassages.tissueculture-themaintenanceofatissueorfragmentinawaythatmayallowdifferentiationandpreservationofthearchitectureand/orfunction

monolayer-singlelayerofcellsgrowingonasurfaceorganculture-maintenanceoftissues,wholeorpartsoforgansinawaythatmayallowdifferentiationandpreservationofthearchitectureand/orfunctionexplant-anexcisedfragmentofanorganwhichusuallyretainssomedegreeoftissuearchitecture原代培養(yǎng)（primaryculture）：即細(xì)胞或組織離開(kāi)機(jī)體后的首次培養(yǎng)。primaryculture-startedfromcells,tissuesororganstakendirectlyfromananimal傳代（passage）：培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)到一定的密度后轉(zhuǎn)移到新的容器中培養(yǎng)或需要更換到新的培養(yǎng)液稱為傳代或傳代培養(yǎng)。subculture-thetransplantationofcellsfromoneculturetoanother(passaging)細(xì)胞系（cellline）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，可稱為有限細(xì)胞系。如果可以連續(xù)傳代則稱為連續(xù)細(xì)胞株原代培養(yǎng)細(xì)胞成功傳代即為細(xì)胞系。cellline-arisesfromtheprimarycultureatthetimeofthefirstsubculture-"finite"lifespancontinuouscellline-acelllinewhichhasbeen"transformed"-"infinite"lifespan細(xì)胞株（cellstrain）：從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。克?。╟lone）：亦稱無(wú)性系。指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。2發(fā)展歷史動(dòng)物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)起源于19世紀(jì)所應(yīng)用的某些胚胎學(xué)技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的奠基人是美國(guó)生物學(xué)家Harrison。在1907年采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，保持存活了幾周時(shí)間，并觀察到細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過(guò)程。Harrison--isolatedpiecesoffrogembryonictissueknowntogiverisetonervefibres-grewtheminfroglymph-observedoutgrowthofaxonsoverperiodofweeksin1907.

法國(guó)學(xué)者Carrel功不可沒(méi)。他1923年設(shè)計(jì)的卡氏培養(yǎng)瓶，用雞胚抽提液培養(yǎng)心肌組織取得成功并維持34年之久,特別注意到實(shí)驗(yàn)中的無(wú)菌操作。表三、實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來(lái)源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞HenriettaLacksBHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉(cāng)鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國(guó)地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin19513應(yīng)用領(lǐng)域生產(chǎn)單克隆抗體和疫苗。組織與器官再生、培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的生物制品

（1）病毒疫苗：乙肝疫苗(HbsAg)、脊髓灰質(zhì)炎疫苗(Polio)、狂犬疫苗(Rabies)等。（2）非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素（IFN）、白細(xì)胞介素（IL）、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BCGF）、巨噬細(xì)胞激活因子（MAN）T細(xì)胞替代因子（TRF）等。（3）多肽生長(zhǎng)因子：神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血清生長(zhǎng)因子（SF）等。（4）酶類：組織血纖維溶酶原激活劑（t－PA）等。（5）激素：紅細(xì)胞生成素（EPO）、促黃體生成素（LH）、促濾胞素（FSH）等。（6）腫瘤特異性抗原：癌胚抗原（CEA）等。（7）

單克隆抗體（MCAB）。（8）病毒殺蟲(chóng)劑：桿狀病毒等。（9）皮膚移植：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)等。3.1.1動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)問(wèn)題一與微生物、植物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞有哪些特殊之處？

動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞相比，主要有以下不同：

（1）動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁。（2）動(dòng)物細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受污染。（3）培養(yǎng)過(guò)程需氧量少，對(duì)機(jī)械攪拌或剪切力敏感。（4）動(dòng)物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在。（5）原代細(xì)胞一般繁殖50代左右即退化死亡。3.1.2體外培養(yǎng)

原代培養(yǎng)（亦稱初代培養(yǎng)）傳代培養(yǎng)（亦稱繼代培養(yǎng)）。PrimaryCultureretentionofthe3Dshapeoutgrowthandmigrationofcells3.1.3動(dòng)物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性

體外培養(yǎng)細(xì)胞類型1粘附型細(xì)胞anchorage－dependent

粘附生長(zhǎng)是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式。粘附有兩種含義：一是細(xì)胞之間相互接觸；二是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是必須附壁即附著在固體表面生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞布滿表面后即停止生長(zhǎng)，這時(shí)若取走一片細(xì)胞，存留在表面上的細(xì)胞就會(huì)沿著表面生長(zhǎng)而重新布滿創(chuàng)面,稱為單層附壁培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁延展過(guò)程Contactinhibition

Whencellscontacteachother,theyceasetheirgrowth.CellsarrestinG0phaseofthecellcycle.

Transformedcellswillcontinuetoproliferateandpileupeachother.

體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（形態(tài)）

1成纖維型2上皮型3游走型4多形型

（一）成纖維細(xì)胞型細(xì)胞

Fibroblast

外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似，細(xì)胞大致呈梭形或不規(guī)則形。前者貼壁后呈長(zhǎng)梭形，圓形細(xì)胞核位于中央，胞質(zhì)外伸出2－3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、漩渦狀走向。多數(shù)細(xì)胞之間排列疏散，有較大的細(xì)胞間隙。有時(shí)也相互平行排列，成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等形式。心肌，平滑肌、血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)常呈此類型。（二）上皮型細(xì)胞

Epithelialcell類似上皮細(xì)胞的細(xì)胞，特點(diǎn)是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長(zhǎng)時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞。因?yàn)橄嗷頂D而呈現(xiàn)“鋪路石狀”。皮膚的表皮細(xì)胞、消化道與呼吸道的上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、消化腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，Hela（三）游走型細(xì)胞

wandering分散生長(zhǎng)，一般不連接成片形成群落；細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)器皿壁上生長(zhǎng)位置不固定，呈活躍的游走和變形運(yùn)動(dòng)，速度快且方向不規(guī)則。該類細(xì)胞不穩(wěn)定，外形不規(guī)則且不斷變化，當(dāng)細(xì)胞密度增大、連接成片時(shí)，形狀類似于成纖維樣細(xì)胞型或上皮細(xì)胞型。表現(xiàn)這種細(xì)胞形態(tài)的主要是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等。（四）多形型細(xì)胞

Polymorphic多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞。多形型細(xì)胞不常見(jiàn)，只有某些像神經(jīng)組織細(xì)胞等難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的，才可歸于多形細(xì)胞。體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細(xì)胞的細(xì)胞最常見(jiàn)的是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。影響細(xì)胞形態(tài)的因素能夠影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的主要因素包括：血清成分、培養(yǎng)基成分及添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。例如，一些已分化的細(xì)胞在有無(wú)血清的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，形態(tài)特征就會(huì)有所差異。形態(tài)會(huì)因條件而改變（來(lái)源、生長(zhǎng)條件和功能狀態(tài)不同）。

2非粘附型細(xì)胞（懸浮型細(xì)胞）

體外生長(zhǎng)不貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，因此也叫懸浮型細(xì)胞。一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)的細(xì)胞或微生物，當(dāng)接種于體外環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等都屬此類細(xì)胞。這類細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是胞體始終為球形。懸浮培養(yǎng)類似微生物的深層培養(yǎng)。由于是懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞密度一般都較高，培養(yǎng)的效率也高、操作也容易。這種方法有多方面的優(yōu)越性，易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過(guò)程的控制?？上茉趹腋顟B(tài)下生長(zhǎng)的細(xì)胞種類有限，且不太方便觀察。

3.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

的基本技術(shù)

3.2.1體外培養(yǎng)的條件

3.2.1.1與微生物細(xì)胞培養(yǎng)相比動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特殊性大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞只有附著在固體或半固體的表面才能生長(zhǎng)。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需要血清。對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性更差，對(duì)環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需嚴(yán)格監(jiān)控。動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，因此培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)環(huán)境的影響又比微生物為大，因此常用空氣、氧、二氧化碳和氮的混合氣體進(jìn)行供氧和調(diào)節(jié)pH。培養(yǎng)條件TemperaturepHDissolvedgasNutrients培養(yǎng)基20世紀(jì)40年代以后，從事動(dòng)物組織培養(yǎng)的各國(guó)科學(xué)家把研究的重點(diǎn)集中在培養(yǎng)基的改造上。1951年，Earle等人開(kāi)發(fā)了供動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。MediaThechoiceofmediaiscelltypespecificandoftenempirical-no"allpurpose"medium.Shouldprovide:nutrients,bufferingcapacity,isotonic,andbesterile天然培養(yǎng)基動(dòng)物血清、組織提取液、雞胚胎提取液等優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高缺點(diǎn)：成分復(fù)雜、來(lái)源有限、成本較高?。ㄌィ┡Ｑ濉鞍踪|(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素、多種生長(zhǎng)因子等成分。合成培養(yǎng)基Earle于1951年首次使用。優(yōu)點(diǎn)：成分已知、易控制缺點(diǎn)：無(wú)法替代一些未知成分解決途徑——合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補(bǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：含有豐富的利于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分血清培養(yǎng)基缺點(diǎn)：對(duì)后期產(chǎn)物的分離、提純及檢測(cè)造成干擾。來(lái)源有限、成本較高無(wú)血清培養(yǎng)基：試圖全部替代血清成分，尤其是生長(zhǎng)因子（例如胰島素）、激素（例如生長(zhǎng)激素）等。

培養(yǎng)過(guò)程圖解細(xì)胞系生長(zhǎng)過(guò)程的3個(gè)主要階段

（一）原代（初代）培養(yǎng)期指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)這個(gè)階段，一般持續(xù)1-4周。在這個(gè)階段，細(xì)胞比較活躍，有細(xì)胞分裂，但不旺盛。組織和細(xì)胞剛離體，生物學(xué)特性變化不大，具有二倍體遺傳特性，最接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，很適合做藥物測(cè)試，細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。（二）傳代期原代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱為細(xì)胞系，在全生命期中該階段的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。一般情況下，當(dāng)傳代10-50次后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以致完全停止。

（三）衰退期該階段細(xì)胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。