guan3動物細胞培養(yǎng)

第3章動物細胞與組織培養(yǎng)動物的細胞與組織培養(yǎng)

定義：從動物體內(nèi)取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)生理環(huán)境，在體外建立無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。1動物細胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)（massculture）：將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層克隆培養(yǎng)（clonalculture）：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

DefinitionsofTissueCultureTerms

cellculture-themaintenanceandgrowingofdispersedcellsoutsidetheorganism.Secondaryculture－Cellstakenfromaprimarycultureandpassedordividedinvitro.Thesecellshavealimitednumberofdivisionsorpassages.tissueculture-themaintenanceofatissueorfragmentinawaythatmayallowdifferentiationandpreservationofthearchitectureand/orfunction

monolayer-singlelayerofcellsgrowingonasurfaceorganculture-maintenanceoftissues,wholeorpartsoforgansinawaythatmayallowdifferentiationandpreservationofthearchitectureand/orfunctionexplant-anexcisedfragmentofanorganwhichusuallyretainssomedegreeoftissuearchitecture原代培養(yǎng)（primaryculture）：即細胞或組織離開機體后的首次培養(yǎng)。primaryculture-startedfromcells,tissuesororganstakendirectlyfromananimal傳代（passage）：培養(yǎng)的細胞生長到一定的密度后轉(zhuǎn)移到新的容器中培養(yǎng)或需要更換到新的培養(yǎng)液稱為傳代或傳代培養(yǎng)。subculture-thetransplantationofcellsfromoneculturetoanother(passaging)細胞系（cellline）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系所組成。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，可稱為有限細胞系。如果可以連續(xù)傳代則稱為連續(xù)細胞株原代培養(yǎng)細胞成功傳代即為細胞系。cellline-arisesfromtheprimarycultureatthetimeofthefirstsubculture-"finite"lifespancontinuouscellline-acelllinewhichhasbeen"transformed"-"infinite"lifespan細胞株（cellstrain）：從培養(yǎng)細胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標志的細胞群?？寺。╟lone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。2發(fā)展歷史動物細胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)起源于19世紀所應(yīng)用的某些胚胎學技術(shù)。動物細胞（組織）培養(yǎng)的奠基人是美國生物學家Harrison。在1907年采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，保持存活了幾周時間，并觀察到細胞突起的生長過程。Harrison--isolatedpiecesoffrogembryonictissueknowntogiverisetonervefibres-grewtheminfroglymph-observedoutgrowthofaxonsoverperiodofweeksin1907.

法國學者Carrel功不可沒。他1923年設(shè)計的卡氏培養(yǎng)瓶，用雞胚抽提液培養(yǎng)心肌組織取得成功并維持34年之久,特別注意到實驗中的無菌操作。表三、實驗室中常用的幾種細胞系細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞HenriettaLacksBHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin19513應(yīng)用領(lǐng)域生產(chǎn)單克隆抗體和疫苗。組織與器官再生、培養(yǎng)。動物細胞基因工程動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的生物制品

（1）病毒疫苗：乙肝疫苗(HbsAg)、脊髓灰質(zhì)炎疫苗(Polio)、狂犬疫苗(Rabies)等。（2）非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素（IFN）、白細胞介素（IL）、B細胞生長因子（BCGF）、巨噬細胞激活因子（MAN）T細胞替代因子（TRF）等。（3）多肽生長因子：神經(jīng)生長因子（NGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）、血清生長因子（SF）等。（4）酶類：組織血纖維溶酶原激活劑（t－PA）等。（5）激素：紅細胞生成素（EPO）、促黃體生成素（LH）、促濾胞素（FSH）等。（6）腫瘤特異性抗原：癌胚抗原（CEA）等。（7）

單克隆抗體（MCAB）。（8）病毒殺蟲劑：桿狀病毒等。（9）皮膚移植：單細胞培養(yǎng)等。3.1.1動物細胞的特點問題一與微生物、植物細胞相比，動物細胞有哪些特殊之處？

動物細胞與微生物細胞相比，主要有以下不同：

（1）動物細胞比微生物細胞大，無細胞壁。（2）動物細胞倍增時間長，生長緩慢，易受污染。（3）培養(yǎng)過程需氧量少，對機械攪拌或剪切力敏感。（4）動物細胞間主要以聚集體形式存在。（5）原代細胞一般繁殖50代左右即退化死亡。3.1.2體外培養(yǎng)

原代培養(yǎng)（亦稱初代培養(yǎng)）傳代培養(yǎng)（亦稱繼代培養(yǎng)）。PrimaryCultureretentionofthe3Dshapeoutgrowthandmigrationofcells3.1.3動物細胞（組織）培養(yǎng)的生長特性

體外培養(yǎng)細胞類型1粘附型細胞anchorage－dependent

粘附生長是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式。粘附有兩種含義：一是細胞之間相互接觸；二是細胞與細胞外基質(zhì)結(jié)合。動物細胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動物細胞是必須附壁即附著在固體表面生長，當細胞布滿表面后即停止生長，這時若取走一片細胞，存留在表面上的細胞就會沿著表面生長而重新布滿創(chuàng)面,稱為單層附壁培養(yǎng)。細胞貼壁延展過程Contactinhibition

Whencellscontacteachother,theyceasetheirgrowth.CellsarrestinG0phaseofthecellcycle.

Transformedcellswillcontinuetoproliferateandpileupeachother.

體外培養(yǎng)細胞類型（形態(tài)）

1成纖維型2上皮型3游走型4多形型

（一）成纖維細胞型細胞

Fibroblast

外形與體內(nèi)成纖維細胞形狀相似，細胞大致呈梭形或不規(guī)則形。前者貼壁后呈長梭形，圓形細胞核位于中央，胞質(zhì)外伸出2－3個長短不同的突起，生長時呈放射狀、漩渦狀走向。多數(shù)細胞之間排列疏散，有較大的細胞間隙。有時也相互平行排列，成群細胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等形式。心肌，平滑肌、血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)常呈此類型。（二）上皮型細胞

Epithelialcell類似上皮細胞的細胞，特點是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長時彼此緊密連接成單層細胞。因為相互擁擠而呈現(xiàn)“鋪路石狀”。皮膚的表皮細胞、消化道與呼吸道的上皮細胞、肺泡上皮細胞、消化腺上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞等，Hela（三）游走型細胞

wandering分散生長，一般不連接成片形成群落；細胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)器皿壁上生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運動，速度快且方向不規(guī)則。該類細胞不穩(wěn)定，外形不規(guī)則且不斷變化，當細胞密度增大、連接成片時，形狀類似于成纖維樣細胞型或上皮細胞型。表現(xiàn)這種細胞形態(tài)的主要是單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞，如顆粒性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、某些腫瘤細胞等。（四）多形型細胞

Polymorphic多形型細胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細胞。多形型細胞不常見，只有某些像神經(jīng)組織細胞等難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的，才可歸于多形細胞。體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細胞的細胞最常見的是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。影響細胞形態(tài)的因素能夠影響細胞形態(tài)學特征的主要因素包括：血清成分、培養(yǎng)基成分及添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。例如，一些已分化的細胞在有無血清的培養(yǎng)液中生長，形態(tài)特征就會有所差異。形態(tài)會因條件而改變（來源、生長條件和功能狀態(tài)不同）。

2非粘附型細胞（懸浮型細胞）

體外生長不貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，因此也叫懸浮型細胞。一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長的細胞或微生物，當接種于體外環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生長。血液白細胞、淋巴組織細胞，某些腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉(zhuǎn)化細胞系等都屬此類細胞。這類細胞形態(tài)學特點是胞體始終為球形。懸浮培養(yǎng)類似微生物的深層培養(yǎng)。由于是懸浮生長，細胞密度一般都較高，培養(yǎng)的效率也高、操作也容易。這種方法有多方面的優(yōu)越性，易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過程的控制?？上茉趹腋顟B(tài)下生長的細胞種類有限，且不太方便觀察。

3.2動物細胞培養(yǎng)

的基本技術(shù)

3.2.1體外培養(yǎng)的條件

3.2.1.1與微生物細胞培養(yǎng)相比動物細胞培養(yǎng)的特殊性大多數(shù)哺乳動物細胞只有附著在固體或半固體的表面才能生長。動物細胞對于營養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需要血清。對于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性更差，對環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需嚴格監(jiān)控。動物細胞生長緩慢，因此培養(yǎng)時間較長。對環(huán)境的影響又比微生物為大，因此常用空氣、氧、二氧化碳和氮的混合氣體進行供氧和調(diào)節(jié)pH。培養(yǎng)條件TemperaturepHDissolvedgasNutrients培養(yǎng)基20世紀40年代以后，從事動物組織培養(yǎng)的各國科學家把研究的重點集中在培養(yǎng)基的改造上。1951年，Earle等人開發(fā)了供動物細胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。MediaThechoiceofmediaiscelltypespecificandoftenempirical-no"allpurpose"medium.Shouldprovide:nutrients,bufferingcapacity,isotonic,andbesterile天然培養(yǎng)基動物血清、組織提取液、雞胚胎提取液等優(yōu)點：營養(yǎng)價值高缺點：成分復(fù)雜、來源有限、成本較高小（胎）牛血清——蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素、多種生長因子等成分。合成培養(yǎng)基Earle于1951年首次使用。優(yōu)點：成分已知、易控制缺點：無法替代一些未知成分解決途徑——合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補無血清培養(yǎng)基血清培養(yǎng)基的優(yōu)點：含有豐富的利于細胞生長的成分血清培養(yǎng)基缺點：對后期產(chǎn)物的分離、提純及檢測造成干擾。來源有限、成本較高無血清培養(yǎng)基：試圖全部替代血清成分，尤其是生長因子（例如胰島素）、激素（例如生長激素）等。

培養(yǎng)過程圖解細胞系生長過程的3個主要階段

（一）原代（初代）培養(yǎng)期指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)這個階段，一般持續(xù)1-4周。在這個階段，細胞比較活躍，有細胞分裂，但不旺盛。組織和細胞剛離體，生物學特性變化不大，具有二倍體遺傳特性，最接近和反映體內(nèi)生長特性，很適合做藥物測試，細胞分化等實驗研究。（二）傳代期原代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便稱為細胞系，在全生命期中該階段的持續(xù)時間最長。一般情況下，當傳代10-50次后，細胞增殖逐漸緩慢，以致完全停止。

（三）衰退期該階段細胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。