基因工程的酶學基礎課件

第三章

基因工程的酶學基礎第三章

基因工程的酶學基礎1第一節(jié)、限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)、ＤＮＡ連接酶第三節(jié)、DNA聚合酶第四節(jié)、其他酶第一節(jié)、限制性核酸內(nèi)切酶2一、限制性核酸內(nèi)切酶

（restrictionendonuclease）這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核苷酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶31、寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象

人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）細菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉1、寄主控制的限制（restriction）4第三章基因工程的酶學基礎課件5E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶

當λ(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當λ6作用：保護自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解R/M體系：

寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶作用：R/M體系：7限制性內(nèi)切酶本是微生物細胞中用于專門水解外源DNA的一類酶，其功能是避免外源DNA的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制。由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。根據(jù)酶的功能、大小和反應條件，及切割DNA的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶2、限制性內(nèi)切酶的分類限制性內(nèi)切酶本是微生物細胞中用于專門水解外源DNA的一類酶，8阿爾伯(1929～)1965年W.Arber（瑞士）首次從理論上提出了生物體內(nèi)存在著一種具有切割基因功能的限制性內(nèi)切酶，并于1968年成功分離出I型限制性內(nèi)切酶。1970年，美國分子生物學家、遺傳學家H·O·Smith（史密斯）（1931～）分離出了II型限制性內(nèi)切酶。1971年，美國微生物遺傳學家D·Nathans內(nèi)森斯（1928～）使用II型限制性內(nèi)切酶首次完成了對基因的切割。他們的研究成果為人類在分子水平上實現(xiàn)人工基因重組提供了有效的技術手段，他們于1978年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。阿爾伯(1929～)1965年W.Arber（9

分子量較大，反應需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，而且切割是隨機的，所以在基因工程中應用不大。

Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

Ⅰ型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。Ⅰ型酶：1968年，M10

這類酶可識別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24～26bp處切開DNA，所以它的切割位點也是沒有特異性的。

Ⅲ型酶這類酶可識別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24～11分子量較?。?05Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應只需Mg++的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應用。

識別位點是一個回文對稱結構，并且切割位點也在這一回文對稱結構上。

許多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重組。Ⅱ型酶分子量較小（105Da），只有一種多肽，通常以同源二12主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMMg2+Mg2+SAMATP識別序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉對稱序列GAGCCCAGCAG切割位點距距識別序列1kb處隨機性切割識別序列內(nèi)或附近特異性切割識別序列下游24--26bp處主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白13

第一個字母：大寫，表示所來自的微生物屬名的第一個字母

第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母

其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號

羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號

3、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則例：

EcoRI:來自于Escheria

coli

RY13的第一個限制酶

第一個字母：大寫，表示所來自的微生物屬名的第一個字母14同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶Haemophilusinfluenzaed屬名種名株名嗜血流感桿菌d株HindIIHindIII1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶Haemophil151.限制酶識別靶序列同DNA的來源無關；2.限制酶識別靶序列是唯一的（對某種限制酶只具一個限制位點的質(zhì)粒）。4、限制酶的特性4、限制酶的特性16二、Ⅱ型酶二、Ⅱ型酶171、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列，大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側，識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構1、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分18第三章基因工程的酶學基礎課件192.核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式

（1）粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是圍繞著一個對稱結構中心，這樣形式的斷裂結果形成具有粘性末端的DNA片斷。（2）平末端:兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。5′-端突出粘性末端

3′-端突出5′

AATTC

3′Ｇ

5′Ｇ

3′ACGTC2.核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式（1）粘性末端：兩條鏈20EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A21PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C22SmaⅠ等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-C-C-G-G-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-G-G-C-C-C-C-T-C…5’SmaⅠ等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-C-C-G-G23第三章基因工程的酶學基礎課件24指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶，同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對同裂酶(CCGG)，當靶序列中有一個5-甲基胞嘧啶時HpaⅡ不能進行切割，而MspⅠ可以。3．同裂酶（isoschizomers)指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶，同裂酶進行同樣25指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。4．同尾酶（isocaudamer）指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸26

雜種位點（hybridsite）由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價結合形成的位點,一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。

BamHⅠG

GATCCBclⅠT

GATC

A

C

CTAG

G

A

CTAG

T雜種位點：T

GATC

C（BamHⅠ）

（BclⅠ）

ACTAG

G

雜種位點（hybridsite）27

（１）分子間的連接：不同的DNA片斷通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來。5．限制片斷的末端連接作用5．限制片斷的末端連接作用28（2）分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配對而形成的環(huán)形分子（2）分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配296.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應條件Tris--HCl50mMpH7.5MgCl210mM0-50mM低鹽酶NaCl0-150mM100mM中鹽酶DTT1mM150mM高鹽酶Volume20-100μlT37℃1-1.5h1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1μg標準DNA所需的酶量6.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應的操作大部分II型核酸內(nèi)30對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應注意：BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：5‘…GCTACATGGATTCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：5‘…GCTACATG31（１）DNA的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量；b.擴大酶催化反應的體系（稀釋）；

c.延長酶催化反應的保溫時間。d.加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當?shù)臏囟?．影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：7．影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：32（2）DNA的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC’3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG’3或5‘CCTGG’3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引入甲基（2）DNA的甲基化程度33第三章基因工程的酶學基礎課件34高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象。EcoRI在正常條件下識別并切割5‘GAATTC’3序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PuPuATTPyPy3’或者5‘AATT’3（3）核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)嘧啶堿基T/C嘌呤堿基A/G高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等35（4）酶切消化反應的溫度：

大多數(shù)酶的標準反應溫度37度（5）DNA的分子結構：

某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性的DNA高29倍（4）酶切消化反應的溫度：36（1）.氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：

不正確的NaCl或Mg++濃度，會降低限制酶的活性，還可能導致識別序列的改變

（2）.Tris-HCl：

維持最適的pH值（pH＝7.4）（3）.β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：

維持酶的穩(wěn)定性（4）.牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性8．核酸內(nèi)切限制酶標準的緩沖液8．核酸內(nèi)切限制酶標準的緩沖液37（1）核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用（2）核酸內(nèi)切限制酶對DNA的局部消化完全的酶切消化：識別序列n個堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對DNA的切割能達到每隔4n切割一次的水平9．核酸內(nèi)切限制酶對DNA的消化作用9．核酸內(nèi)切限制酶對DNA的消化作用38小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）大分子量的片斷-----多（基因文庫）

（3）核酸內(nèi)切限制酶對真核生物基因組的消化作用小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）（339一、ＤＮＡ連接酶二、體外連接一、ＤＮＡ連接酶40一、ＤＮＡ連接酶能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。1.ＤＮＡ連接酶的作用機理一、ＤＮＡ連接酶能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基41第三章基因工程的酶學基礎課件42磷酸酰胺鍵賴氨酸殘基腺苷－磷酸DNA的腺苷酸復合物3’-OH對P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機理此反應是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費兩個高能磷酸鍵磷酸酰胺鍵賴氨酸殘基腺苷－磷酸DNA的腺苷酸復合物連接酶的作431)DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的2)T4DNA連接酶：大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP2.連接酶的來源1)DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的2.連接酶44該酶常從Ｔ４噬菌體的受體細胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化DNA中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結合起來DNA連接酶對具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。3.T４DNA連接酶（DNAligase）3.T４DNA連接酶（DNAligase）45第三章基因工程的酶學基礎課件46（1）反應溫度：連接缺口的溫度：37度連接粘性末端的最佳溫度：4～16度（2）Ｔ４ＤＮＡ連接酶的用量：平末端DNA分子的連接反應中，最適1～2個單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個單位。ATP的用量10μmol～1mmol/L之間（3）提高外源片斷與載體的濃度的比值（10～20倍）4.影響連接酶作用的因素（1）反應溫度：4.影響連接酶作用的因素471.用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片斷2.用T4DNA連接酶將平末端的DNA片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用DNA連接酶連接。3.先在DNA片斷末端加上化學合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用DNA連接酶連接

體外連接的三種方式二、體外連接1.用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片斷體外連接48

由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連，對載體的5’末端進行處理，用細菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進行共價鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個連接位點中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

1.粘性末端DAN片斷的連接1.粘性末端DAN片斷的連接49第三章基因工程的酶學基礎課件50第三章基因工程的酶學基礎課件51

（1）T4DNA連接酶（2)用末端核苷酸轉移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法2.平末端DNA片斷的連接2.平末端DNA片斷的連接52

2.1同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10～40個堿基2.1同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片53同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，對獲得插入片斷進行進一步的研究。

應用適當?shù)膁NTP加尾，再生出共外源DNA片段插入的有用的限制位點。右圖說明了如何用poly（dT）加尾法再生出HindⅢ限制位點的情況。同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的542.2銜接物連接法平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個核苷酸，其結構特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點的回文結構。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點

HpaIIHpaIIBamHI

或Sau3A2.2銜接物連接法HpaII55

銜接物（linker）：是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。

銜接物（linker）：是指用化學方法合成的一段由10～156銜接物連接法銜接物連接法57雙銜接物：可以實現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時對克隆片斷的再刪除也比較方便。雙銜接物：可以實現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時對克隆片斷的再58雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補齊，加入第二銜接物EcolI雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成59在用DNA銜接物連接法時，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把克隆的基因切斷。在用DNA銜接物連接法時，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)601978年，美國康奈爾大學生化分子生物學系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對DNA接頭分子末端，進行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。2.3DNA接頭（adapter）連接法：1978年，美國康奈爾大學生化分子生物學系的教授吳61第三章基因工程的酶學基礎課件62DNA接頭連接法goDNA接頭連接法go63第三節(jié)、DNA聚合酶第三節(jié)、DNA聚合酶64一、大腸桿菌DNA聚合酶、二、大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片斷酶、三、T4DNA聚合酶、四、T7DNA聚合酶、五、反轉錄酶等。常用的DNA聚合酶常用的DNA聚合酶65共同點：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。共同點：66一、大腸桿菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）、DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、

PolＩ和PolⅡ的主要功能參與DNA的合成；PolⅢ的功能同DNA的復制有關；PolＩ同DNA分子克隆的關系最為密切。一、大腸桿菌DNA聚合酶671957年，美國的生物學家A.Kornberg首次證實，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為109×103dal。1.大腸桿菌DNA聚合酶ＩDNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個片斷，一個具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一個具有全部5’3’的外切酶活性。1.大腸桿菌DNA聚合酶ＩDNA聚合酶Ｉ，可以被蛋68

1)底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；2)Mg＋＋離子；3)帶有3’-OH游離基團的引物鏈；4)DNA模板：單鏈，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個或多個斷裂）。

2.DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：2.DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：693.DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

1)5’3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；

2)切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距5’末端數(shù)個核苷酸遠的一個鍵上發(fā)生；

3)DNA的合成可以增強5’3’的核酸外切酶活性；

4)5’3’核酸外切酶的活性位點同聚合作用的活性位點以及3’5’的水解作用位點是分開的。3.DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

70第三章基因工程的酶學基礎課件71

能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開始向5’的方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。

對酶活的影響：

反應物中缺乏dNTPs時，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，將會發(fā)揮作用。但對于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時，這種降解活性將會被5’3’的聚合酶活性所抑制。

4.DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性4.DNA聚合酶Ｉ的3’72

73

通過DNA缺口轉移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標記的DNA探針

DNA缺口轉移（nicktranslationnicktranslation）

在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。當外切酶活性從缺口的5’一側移去一個5’核苷酸之后，聚合酶作用就會在缺口的3’一側補上一個新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個鍵，隨著5’一側的核苷酸不斷移去，3’一側的核苷酸又按序列增補，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動

5.DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：5.DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：74第三章基因工程的酶學基礎課件75

典型的反應體系是。在25μl總體積中含有1μg純化的特定DNA片斷，并加入適量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標記的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的斷裂或缺口；PolＩ：進行缺口轉移，使反應混合物中的32p標記的核苷酸取代原有的未標記的核苷酸，最終從頭到尾都被標記。DNA雜交探針的制備DNA雜交探針的制備76第三章基因工程的酶學基礎課件77

在低濃度dNTPs的條件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs濃度時，PolＩ則能夠更有效的合成DNA。低濃度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高濃度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs參入DNA鏈（DnaseＩ數(shù)量）。

dNTP對PolＩ酶活性的影響dNTP對PolＩ酶活性的影響78

Klenow片斷：是由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來的分子量為76×1000dal的大片斷分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性，失去了全酶的5’3’外切酶活性。

二、Klenow片斷與DNA末端標記二、Klenow片斷與DNA末端標記79（1）、修補經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；（2）、標記DNA片斷的末端；（3）、cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成；（4）、DNA序列的測定。1.Klenow片斷的主要用途：1.Klenow片斷的主要用途：80

具有3’隱蔽末端的帶標記得的DNA片斷

5’GATCT…3’3’A…5’在反應物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道溫育后生成：

5’GATCT…3’

3’32pGA…5’

或是同時加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32p

AGA…5’2.DNA片斷末端標記2.DNA片斷末端標記81DNA片斷末端標記可以作為用凝膠電泳法測定分子大小的標記樣品。因為被標記的DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無關。所以在限制酶消化過程產(chǎn)生的大小DNA片斷都得到了同等程度的標記。不能夠有效的標記帶有5’突出末端的DNA分子。DNA片斷末端標記可以作為用凝膠電泳法測定分子大小82

1）從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性。2）在沒有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按3’5’的方向從3’-OH末端開始降解DNA。如果反應物中存在一種dNTP時，它的水解作用進行到暴露出同反應物中唯一的dNTP互補的核苷酸時就會停止。3）在反應過程中，通過T4DNA聚合作用，反應物中的α-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片斷上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

三、T4DNA聚合酶和取代合成法標記DNA片斷三、T4DNA聚合酶和取代合成法標記DNA片斷83

外切酶活性

聚合酶活性

無dNTPdNTP外切酶活性84具EcoR1位點的DNA分子對DNA分子3‘端有控制的降解合成作用產(chǎn)生選擇性標記T4DNA聚合酶的取代合成法標記DNA斷末端及制備鏈的特異探針具EcoR1位點的DNA分子對DNA分子3‘端有控制的降解合85這類酶來自于反轉錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成DNA。常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉錄酶兩種。四、反轉錄酶（reversetranscriptase）這種酶是1970年美國科學家特明（H.M.Temin）和巴爾的摩（D.Baltimore）分別于動物致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的，他們并因此獲得1975年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。（DavidBaltimore）HowardM.Temin這類酶來自于反轉錄病毒，它可以RNA為模板，催化86含有逆轉錄酶的病毒叫做反轉錄病毒，逆轉錄酶催化的反應叫反轉錄（reve-rsetranscrip-tion）。在這個過程中，遺傳信息流動的方向是從RNA到DNA，正好與轉錄過程相反，故稱反轉錄。病毒逆轉錄酶含Zn2+，以脫氧核苷三磷酸為底物，從5’到3’合成DNA，反應需要引物。這個酶在許多方面與DNA聚合酶相似。目前已發(fā)現(xiàn)不少動物反轉錄病毒，近年來也發(fā)現(xiàn)了幾種人類反轉錄病毒。艾滋病毒也是一種反轉錄病毒。

有的逆轉錄酶已提純，可作為合成某些特定RNA的互補DNA的工具酶，也可用于DNA的序列分析和克隆重組DNA。含有逆轉錄酶的病毒叫做反轉錄病毒，逆轉錄酶催化的反87第三章基因工程的酶學基礎課件88反轉錄酶所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3`-OH的RNA或DNA。它有5‘--3’合成DNA活性，但是無3‘-5’外切活性。AMV（禽成髓細胞瘤病毒）反轉錄酶包含兩條多肽鏈，具5‘--3’DNA聚合活性和很強的RNA酶H活性。M-MuLV（鼠白血病病毒）反轉錄酶是單鏈多肽，84kDa，其RNaseH活性弱，有利于合成較長cDNA。反轉錄酶所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3`-OH的R891978年，S.Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細胞中純化出來的一種核酸酶。具有5’3’的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3’5’核酸外切酶活性。

五、T7DNA聚合酶：用途：（1）用于對大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二級結構的影響，聚合能力較強可延伸合成數(shù)千個核苷酸）（2）通過延伸或取代合成法標記DNA3’末端（3）將雙鏈DNA的5’或3’突出末端轉變成平末端的結構。1978年，S.Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿90六、修飾的T7DNA聚合酶

對天然的T7DNA聚合酶進行修飾，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。用途：

（1）作為一種DNA序列分析的工具酶：加工性能高；無3’5’的外切酶活性；具有催化脫氧核糖類似物聚合的能力。（2）制備探針；可催化較低水平的dNTP（<0.1μmol/L）參入。（3）有效的填補和標記具有5’突出末端的DNA片斷的3’-末端。聚合作用高；失去了3’5’的外切酶活性六、修飾的T7DNA聚合酶用途：91第四節(jié)其他酶一、T4多核苷酸激酶二、末端核苷酸轉移酶三、堿性磷酸酶四、S1核酸酶五、Rnase七、DNaseI六、RNaseH第四節(jié)其他酶一、T4多核苷酸激酶二、末端核苷酸轉移酶三92該酶的用途是：

①為化學測序法標記DNA的5’末端；

②在DNA片段連接之前，使5’-磷酸末端缺失，減少非特異性克隆。一、T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase,PNK）

T4噬菌體的pseT基因編碼的一種蛋白質(zhì)，最初也是從T4噬菌體感染的大腸桿菌細胞中分離出來的，因此又叫做T4多核苷酸激酶。

T4多核苷酸激酶催化γ-磷酸從ATP分子轉移給DNA或RNA分子的5′-OH末端，當使用γ-32P標記的ATP作前體物時，多核苷酸激酶便可以使底物核酸分子的5′-OH末端標記上γ-32P。這種標記又叫做正向反應（forwardreaction），是一種十分有效的過程，它常用來標記核酸分子的5′-末端，或是使寡核苷酸磷酸化。一、T4多核苷酸激酶T4噬菌體的pseT基因編碼的93第三章基因工程的酶學基礎課件94第三章基因工程的酶學基礎課件95該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二甲胂酸緩沖液中，能催化5’脫氧核苷三磷酸進行5’－3’方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。

二、末端核苷酸轉移酶（terminaltransferase）二、末端核苷酸轉移酶（terminaltransferas96它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達幾百個它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的雙鏈DNA它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段為引物，97用途：

1.催化[α-32P]-3’-脫氧核苷酸標記DNA片斷的3’末端。可用于測序的終止，一般不含游離的3’-OH末端2.催化非放射性的標記物摻入到DNA片斷的3’-末端：生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生物素蛋白結合物的接受位點3.用于在平頭DNA上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端用途：98三、堿性磷酸酶

來自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當需要5’端同位素標記或為了避免DNA片段自身連接（或環(huán)化）時可進行脫磷酸反應。CIP的比活性比BAP的高出10-20倍，CIP在SDS中68℃就可完全失活，而BAP卻是熱抗性酶。三、堿性磷酸酶CIP的比活性比BAP的高出10-99第三章基因工程的酶學基礎課件100來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結構的處理，降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍Zn2+必需最適pH范圍為4.0---4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍四、S1核酸酶特點：來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末101第三章基因工程的酶學基礎課件102S1核酸酶降解單鏈DNA或RNA(Vogtetal．1973)，產(chǎn)生帶5‘磷酸的單鏈核苷酸或寡核苷酸。雙鏈DNA、雙鏈RNA及DNA-RNA雜交體對此酶相對不敏感。然而如果所用S1核酸酶的酶量非常大，則雙鏈核酸可被完全消化。中等量的S1核酸酶可在切口或小缺口處切割雙鏈核酸(KroekerandKowalski

1978)用途:(1)分析DNA-RNA雜交體的結構(BerkandSharp

1977，F(xiàn)avaloroetal．1980)(2)去除DNA片段中突出的單鏈尾以產(chǎn)生平端(3)打開雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)S1核酸酶降解單鏈DNA或RNA(Vogtetal．19103五、RnaseRNase

大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA分子。

1.RNaseA

分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（100℃加熱15min仍具活性）,用于除去DNA樣品中的RNA分子

2.核酸酶S7，亦稱微球菌核酸酶，對RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源miRNA五、RnaseRNase104

RNA酶A是內(nèi)切核糖核酸酶，可特異地攻擊RNA上嘧啶殘基的3‘端，切割與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵。反應終產(chǎn)物是嘧啶3’磷酸及末端帶嘧啶3‘磷酸的寡核苷酸。用途：(1)從DNA-RNA或RNA—RNA雜合體中去除未雜合的RNA區(qū)。(2)確定DNA或RNA中單堿基突變的位置。在此方法中，RNA-DNA或RNA-RNA雜合體上的單堿基錯配可被RNA酶A識別并切割。利用含SP5或T7噬菌體啟動子的質(zhì)粒，在體外合成與野生型DNA或RNA互補的32p標記RNA探針，然后與待檢含單堿基置換的DNA或RNA退火，所產(chǎn)生的單堿基錯配可用RNA酶A切割，通過凝膠電泳分析切割產(chǎn)物的大小即可確定錯配的位置。在所有各種可能的單堿基錯配中，大約50％可用此法確定。

制備不含DNA酶的核糖核酸酶

將胰核糖核酸酶(RNaseA)溶解在0．01moI／L醋酸鈉(pH5．2)中，使終濃度為10mg／m[，加熱到100oC，15min，在室溫下緩慢冷卻。用0．1體積的1M的Tris-C1調(diào)整pH至7．4后，分裝小管保存在—20C備用。當濃縮的溶液在中性pH條件下加熱到100C時，核糖核酸酶產(chǎn)生沉淀。RNA酶A是內(nèi)切核糖核酸酶，可特異地攻擊RNA上嘧105第三章基因工程的酶學基礎課件106六、RNaseH作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去RNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。

六、RNaseH作用于DNA-RNA雜交分子中的RN107七、DNaseI1.特點：具內(nèi)切酶活性，作用于ds-DNA，但無核苷酸序列特異型，產(chǎn)生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活達最大值當酶濃度很低時，ds-DNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關，Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置2.用途

1)切口移位，制備DNA探針2)制備RNA樣品時除去DNA分子3)基因突變時產(chǎn)生切口七、DNaseI1.特點：108DNaseI

DNaseI109Mn++存在時

Mg++存在時

DNaseI作用特點DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位PolIMn++存在時Mg++存在時DNaseIDNaseI110第三章

基因工程的酶學基礎第三章

基因工程的酶學基礎111第一節(jié)、限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)、ＤＮＡ連接酶第三節(jié)、DNA聚合酶第四節(jié)、其他酶第一節(jié)、限制性核酸內(nèi)切酶112一、限制性核酸內(nèi)切酶

（restrictionendonuclease）這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核苷酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶1131、寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象

人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）細菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉1、寄主控制的限制（restriction）114第三章基因工程的酶學基礎課件115E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶

當λ(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當λ116作用：保護自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解R/M體系：

寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶作用：R/M體系：117限制性內(nèi)切酶本是微生物細胞中用于專門水解外源DNA的一類酶，其功能是避免外源DNA的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制。由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。根據(jù)酶的功能、大小和反應條件，及切割DNA的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶2、限制性內(nèi)切酶的分類限制性內(nèi)切酶本是微生物細胞中用于專門水解外源DNA的一類酶，118阿爾伯(1929～)1965年W.Arber（瑞士）首次從理論上提出了生物體內(nèi)存在著一種具有切割基因功能的限制性內(nèi)切酶，并于1968年成功分離出I型限制性內(nèi)切酶。1970年，美國分子生物學家、遺傳學家H·O·Smith（史密斯）（1931～）分離出了II型限制性內(nèi)切酶。1971年，美國微生物遺傳學家D·Nathans內(nèi)森斯（1928～）使用II型限制性內(nèi)切酶首次完成了對基因的切割。他們的研究成果為人類在分子水平上實現(xiàn)人工基因重組提供了有效的技術手段，他們于1978年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。阿爾伯(1929～)1965年W.Arber（119

分子量較大，反應需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，而且切割是隨機的，所以在基因工程中應用不大。

Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

Ⅰ型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。Ⅰ型酶：1968年，M120

這類酶可識別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24～26bp處切開DNA，所以它的切割位點也是沒有特異性的。

Ⅲ型酶這類酶可識別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24～121分子量較小（105Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應只需Mg++的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應用。

識別位點是一個回文對稱結構，并且切割位點也在這一回文對稱結構上。

許多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重組。Ⅱ型酶分子量較?。?05Da），只有一種多肽，通常以同源二122主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMMg2+Mg2+SAMATP識別序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉對稱序列GAGCCCAGCAG切割位點距距識別序列1kb處隨機性切割識別序列內(nèi)或附近特異性切割識別序列下游24--26bp處主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白123

第一個字母：大寫，表示所來自的微生物屬名的第一個字母

第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母

其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號

羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號

3、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則例：

EcoRI:來自于Escheria

coli

RY13的第一個限制酶

第一個字母：大寫，表示所來自的微生物屬名的第一個字母124同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶Haemophilusinfluenzaed屬名種名株名嗜血流感桿菌d株HindIIHindIII1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶Haemophil1251.限制酶識別靶序列同DNA的來源無關；2.限制酶識別靶序列是唯一的（對某種限制酶只具一個限制位點的質(zhì)粒）。4、限制酶的特性4、限制酶的特性126二、Ⅱ型酶二、Ⅱ型酶1271、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列，大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側，識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構1、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分128第三章基因工程的酶學基礎課件1292.核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式

（1）粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是圍繞著一個對稱結構中心，這樣形式的斷裂結果形成具有粘性末端的DNA片斷。（2）平末端:兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。5′-端突出粘性末端

3′-端突出5′

AATTC

3′Ｇ

5′Ｇ

3′ACGTC2.核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式（1）粘性末端：兩條鏈130EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A131PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C132SmaⅠ等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-C-C-G-G-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-G-G-C-C-C-C-T-C…5’SmaⅠ等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-C-C-G-G133第三章基因工程的酶學基礎課件134指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶，同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對同裂酶(CCGG)，當靶序列中有一個5-甲基胞嘧啶時HpaⅡ不能進行切割，而MspⅠ可以。3．同裂酶（isoschizomers)指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶，同裂酶進行同樣135指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。4．同尾酶（isocaudamer）指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸136

雜種位點（hybridsite）由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價結合形成的位點,一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。

BamHⅠG

GATCCBclⅠT

GATC

A

C

CTAG

G

A

CTAG

T雜種位點：T

GATC

C（BamHⅠ）

（BclⅠ）

ACTAG

G

雜種位點（hybridsite）137

（１）分子間的連接：不同的DNA片斷通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來。5．限制片斷的末端連接作用5．限制片斷的末端連接作用138（2）分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配對而形成的環(huán)形分子（2）分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配1396.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應條件Tris--HCl50mMpH7.5MgCl210mM0-50mM低鹽酶NaCl0-150mM100mM中鹽酶DTT1mM150mM高鹽酶Volume20-100μlT37℃1-1.5h1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1μg標準DNA所需的酶量6.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應的操作大部分II型核酸內(nèi)140對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應注意：BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：5‘…GCTACATGGATTCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：5‘…GCTACATG141（１）DNA的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量；b.擴大酶催化反應的體系（稀釋）；

c.延長酶催化反應的保溫時間。d.加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當?shù)臏囟?．影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：7．影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：142（2）DNA的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC’3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG’3或5‘CCTGG’3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引入甲基（2）DNA的甲基化程度143第三章基因工程的酶學基礎課件144高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象。EcoRI在正常條件下識別并切割5‘GAATTC’3序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PuPuATTPyPy3’或者5‘AATT’3（3）核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)嘧啶堿基T/C嘌呤堿基A/G高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等145（4）酶切消化反應的溫度：

大多數(shù)酶的標準反應溫度37度（5）DNA的分子結構：

某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性的DNA高29倍（4）酶切消化反應的溫度：146（1）.氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：

不正確的NaCl或Mg++濃度，會降低限制酶的活性，還可能導致識別序列的改變

（2）.Tris-HCl：

維持最適的pH值（pH＝7.4）（3）.β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：

維持酶的穩(wěn)定性（4）.牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性8．核酸內(nèi)切限制酶標準的緩沖液8．核酸內(nèi)切限制酶標準的緩沖液147（1）核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用（2）核酸內(nèi)切限制酶對DNA的局部消化完全的酶切消化：識別序列n個堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對DNA的切割能達到每隔4n切割一次的水平9．核酸內(nèi)切限制酶對DNA的消化作用9．核酸內(nèi)切限制酶對DNA的消化作用148小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）大分子量的片斷-----多（基因文庫）

（3）核酸內(nèi)切限制酶對真核生物基因組的消化作用小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）（3149一、ＤＮＡ連接酶二、體外連接一、ＤＮＡ連接酶150一、ＤＮＡ連接酶能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。1.ＤＮＡ連接酶的作用機理一、ＤＮＡ連接酶能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基151第三章基因工程的酶學基礎課件152磷酸酰胺鍵賴氨酸殘基腺苷－磷酸DNA的腺苷酸復合物3’-OH對P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機理此反應是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費兩個高能磷酸鍵磷酸酰胺鍵賴氨酸殘基腺苷－磷酸DNA的腺苷酸復合物連接酶的作1531)DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的2)T4DNA連接酶：大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP2.連接酶的來源1)DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的2.連接酶154該酶常從Ｔ４噬菌體的受體細胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化DNA中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結合起來DNA連接酶對具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。3.T４DNA連接酶（DNAligase）3.T４DNA連接酶（DNAligase）155第三章基因工程的酶學基礎課件156（1）反應溫度：連接缺口的溫度：37度連接粘性末端的最佳溫度：4～16度（2）Ｔ４ＤＮＡ連接酶的用量：平末端DNA分子的連接反應中，最適1～2個單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個單位。ATP的用量10μmol～1mmol/L之間（3）提高外源片斷與載體的濃度的比值（10～20倍）4.影響連接酶作用的因素（1）反應溫度：4.影響連接酶作用的因素1571.用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片斷2.用T4DNA連接酶將平末端的DNA片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用DNA連接酶連接。3.先在DNA片斷末端加上化學合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用DNA連接酶連接

體外連接的三種方式二、體外連接1.用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片斷體外連接158

由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連，對載體的5’末端進行處理，用細菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進行共價鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個連接位點中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

1.粘性末端DAN片斷的連接1.粘性末端DAN片斷的連接159第三章基因工程的酶學基礎課件160第三章基因工程的酶學基礎課件161

（1）T4DNA連接酶（2)用末端核苷酸轉移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法2.平末端DNA片斷的連接2.平末端DNA片斷的連接162

2.1同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10～40個堿基2.1同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片163同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，對獲得插入片斷進行進一步的研究。

應用適當?shù)膁NTP加尾，再生出共外源DNA片段插入的有用的限制位點。右圖說明了如何用poly（dT）加尾法再生出HindⅢ限制位點的情況。同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的1642.2銜接物連接法平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個核苷酸，其結構特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點的回文結構。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點

HpaIIHpaIIBamHI

或Sau3A2.2銜接物連接法HpaII165

銜接物（linker）：是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。

銜接物（linker）：是指用化學方法合成的一段由10～1166銜接物連接法銜接物連接法167雙銜接物：可以實現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時對克隆片斷的再刪除也比較方便。雙銜接物：可以實現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時對克隆片斷的再168雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補齊，加入第二銜接物EcolI雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成169在用DNA銜接物連接法時，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把克隆的基因切斷。在用DNA銜接物連接法時，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)1701978年，美國康奈爾大學生化分子生物學系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對DNA接頭分子末端，進行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。2.3DNA接頭（adapter）連接法：1978年，美國康奈爾大學生化分子生物學系的教授吳171第三章基因工程的酶學基礎課件172DNA接頭連接法goDNA接頭連接法go173第三節(jié)、DNA聚合酶第三節(jié)、DNA聚合酶174一、大腸桿菌DNA聚合酶、二、大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片斷酶、三、T4DNA聚合酶、四、T7DNA聚合酶、五、反轉錄酶等。常用的DNA聚合酶常用的DNA聚合酶175共同點：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。共同點：176一、大腸桿菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）、DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、

PolＩ和PolⅡ的主要功能參與DN