蛋白質分分離純化和表征3

等電點（pI）:在特定pH條件下，某種蛋白質分子所帶正負電荷相等，靜電荷為零，這一pH稱為該蛋白質的等電點（pI）。幾種蛋白質等電點第一頁，共三十六頁。等電pH并不是一個恒定的值，它會因溶液中鹽的種類和離子強度的影響而有所不同。

等離子點(isoionicpiont):

蛋白質在純水溶液中的帶電狀態(tài)則沒有其他離子干擾，完全由H+的解離和結合來決定，這種條件下的等電點稱為等離子點。等離子點是蛋白質的特征性常數。第二頁，共三十六頁。二、蛋白質的分子大小與分子量的測定蛋白質的分子量的范圍：6×103～1×106Da。第三頁，共三十六頁。（一）根據化學組成測定最低相對分子量用化學分析方法測出蛋白質中某一微量元素的含量。并假設蛋白質分子中含有一個被測元素的原子，則可由此計算出蛋白質的最低分子量。

例：肌紅蛋白和血紅蛋白含鐵量均為0.335%,計算二者的相對分子質量。

最低相對分子量＝x100=鐵的百分含量鐵的原子量0.33555.8x100=16700測定蛋白質相對分子量的原理和方法也可以利用蛋白質中含量特少的aa，用同樣的原理計算蛋白質的最低分子量。第四頁，共三十六頁。（二）滲透壓法測定相對分子量滲透壓法測定Mr操作簡單，Mr在10-100kDa時較準，但不能區(qū)別蛋白質分子是否均一。滲透壓公式：Mr

=RTlimc→0πc(c=質量濃度，g/mol)第五頁，共三十六頁。（三）沉降分析測定Mr在強大的離心場中，如果蛋白質溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白質會發(fā)生沉降。沉降速度決定于蛋白質的分子量、分子密度、分子形狀和溶劑的密度、粘度。

沉降系數（Ｓ20,w）：單位離心場強度時的沉降速度。定義1Ｓ＝10-13秒（斯維得貝格單位）沉降速度法沉降平衡法第六頁，共三十六頁。（四）凝膠過濾法測定Mr凝膠過濾（層析）可按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，同時可以測定蛋白質分子量。蛋白質通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關:先測得幾種標準蛋白質的Ve（Ve為洗脫體積），并以其分子量對數對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量，并以其分子量對數對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測V測第七頁，共三十六頁。（五）SDS法測定Mr聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測蛋白質混合樣品，主要是根據各蛋白質各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關。當電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質的分子量。

第八頁，共三十六頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresis第九頁，共三十六頁。1．蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質顆粒大小屬于膠體粒子的范圍(1-100nm)。又由于其分子表面有許多極性基團，親水性極強，易溶于水成為穩(wěn)定的親水膠體溶液。蛋白質親水膠體的穩(wěn)定性主要取決于兩個因素：雙電層水化層a.丁達爾效應

b.布朗運動

c.不能透過半透膜三、膠體性質與蛋白質的沉淀第十頁，共三十六頁。2．蛋白質的沉淀蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的，相對的。假若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和雙電層，蛋白質親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮結沉淀現象，這既是所謂的蛋白質沉淀作用。①鹽析法（saltingout）：中性鹽（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→蛋白質脫去水化層。

優(yōu)點：不引起蛋白質變性。鹽溶（saltingin）：稀鹽溶液中蛋白質溶解度增加的現象。第十一頁，共三十六頁。②有機溶劑沉淀法：極性有機溶劑（甲醇，乙醇，丙酮）→脫去水化層以及降低介電常數而增加帶電質點間的相互作用。

條件：低溫操作，縮短時間。

③重金屬鹽沉淀法：

當溶液pH>pI,蛋白質顆粒帶負電荷,易與重金屬離子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)→生成沉淀。

④生物堿試劑和某些酸類沉淀法：

生物堿試劑—能引起生物堿沉淀的一類試劑。當溶液pH<pI時,蛋白質顆粒帶正電荷→易與生物堿試劑,酸根負離子反應→沉淀

用途：臨床除去體液中干擾測定的蛋白質第十二頁，共三十六頁。⑤加熱變性測定法原因：加熱變性使蛋白質天然結構解體，疏水基外露，損壞了水化層

用途：制豆腐（加熱+少量鹽鹵）第十三頁，共三十六頁。1.定義：在某些物理或化學因素作用下，天然蛋白質嚴密的空間結構被破壞，從而導致理化性質改變和生物學活性的喪失（如酶失去催化活力，激素喪失活性），則稱之為蛋白質變性作用(denaturation)

。

有些蛋白質的變性是可逆的，通過適當的方法（如透析）將變性劑除去后，蛋白質可以恢復其天然立體結構，這個過程稱為復性（renaturation）。

一般認為蛋白質變性本質是次級鍵的破壞，只有空間構象的改變，并不涉及一級結構（共價鍵）的變化。四、蛋白質的變性與復性第十四頁，共三十六頁。第十五頁，共三十六頁。

化學因素：強酸、強堿、有機溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑、尿素等

物理因素：加熱、射線、超聲波、劇烈震蕩等2.變性因素第十六頁，共三十六頁。旋光值改變特性粘度增加溶解度降低擴散系數降低結晶能力喪失易于沉淀，若加熱還會凝固。但若遠離等電點則不一定沉淀變性后蛋白質肽鍵暴露而更加易于消化3.變性后蛋白質的表現第十七頁，共三十六頁。變性蛋白質為什么能復性？

在一定的環(huán)境條件下，蛋白質的一級結構能夠決定二、三、四級結構。變性蛋白質的二、三、四級結構雖然遭到破壞，但是一級結構仍然保持不變，因此除去變性劑后，在適當的環(huán)境條件下，蛋白質能卷曲折疊成為能量最低的構象，一般天然蛋白質正是具有這種能量最低的構象。第十八頁，共三十六頁。五、蛋白質分離純化的一般原則根據分子量：如沉降速度法離心根據密度：沉降平衡法離心根據電荷和分子量：聚丙烯酰胺凝膠電泳根據分子量和分子形狀：凝膠過濾根據溶解度：硫酸銨分級沉淀、有機溶劑分級沉淀根據電荷：等電點沉淀第十九頁，共三十六頁。六、蛋白質的分離純化方法

透析：利用半透膜的選擇通透性來純化象蛋白質這樣的大分子物質的過程叫透析。超過濾：是利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質通過半透膜，而蛋白質分子被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的，有時要用切向流過濾法。（一）根據分子大小不同的分離純化方法第二十頁，共三十六頁。凝膠過濾法

凝膠過濾（層析）是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。凝膠顆粒內部具有多孔網狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。第二十一頁，共三十六頁。第二十二頁，共三十六頁。（二）利用溶解度差別的純化方法影響蛋白質溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH、離子強度、介電常數和溫度。溶解度歸根結底取決于他們本身的分子結構。等電點沉淀技術：在等電點pH條件下，蛋白質為電中性，其物理性質如導電性、溶解度、黏度、滲透壓等都表現為最低值，易發(fā)生絮結沉淀。因此，等電點性質常被用于蛋白質的分離制備，被稱為等電點沉淀技術。第二十三頁，共三十六頁。

鹽析：當離子強度增加到足夠高時，例如飽和或半飽和的程度，很多蛋白質可以從水溶液中沉淀出來，這種現象稱為鹽析。有機溶劑分級分離法：引起蛋白質沉淀的主要原因是改變了介質的介電常數。

溫度對蛋白質溶解度的影響：0-40℃之間，大部分球狀蛋白質的溶解度隨溫度的升高而增加。第二十四頁，共三十六頁。（三）根據電荷不同的純化方法

電泳：在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動，這種現象稱為電泳。原則上按電泳的原理來分，可分為：自由界面電區(qū)帶電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）三種物理效應：樣品的濃縮效應、分子篩效應和電荷效應。第二十五頁，共三十六頁。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CHC=ONHCH2NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2ˉ

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m第二十六頁，共三十六頁。Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH=8.9T=7.5%第二十七頁，共三十六頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresis第二十八頁，共三十六頁。第二十九頁，共三十六頁。此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質進行分離的方法。若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質與H+發(fā)生交換而結合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負電荷的物質可與OH-發(fā)生交換而結合在樹脂上。物質在樹脂上結合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當的洗脫液便可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。離子交換：第三十頁，共三十六頁。第三十一頁，共三十六頁。（六）親和層析

親和層析法就是利用化學方法將可與待分離物質可逆性特異結合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當待提純的生物大分子通過此層析柱時，此生物大分子便與載體上的配體特異的結合而留在柱上，其他物質則被沖洗出去。然后再用適當方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達到分離提純的目的?？乖涂贵w激素和受體蛋白凝集素和糖蛋白第三十二頁，共三十六頁。配體蛋白質蛋白質和配體復合物交聯試劑載體配體載體與配體交聯體雜質雜質游離配體第三十三頁，共三十六頁。七、蛋白質的含量測定與純度測定蛋白質的量是研究蛋白質的最基本的一步。溶液中蛋白質的濃度測定方法很多，最早的經典方法是凱氏定氮法，稍后應用較廣泛的方法是雙縮脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年來大多數人用考馬斯亮藍法。（一）蛋白質的含量測定