分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述

關(guān)于分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述第一頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日分子雜交技術(shù)利用單鏈核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)；抗原與抗體、受體與配體、蛋白與其他分子的相互作用進(jìn)行目的核酸、蛋白質(zhì)檢測(cè)，廣泛用于基因重組、生物印跡示蹤、生物芯片等領(lǐng)域，具有高特異性、高靈敏度、高通量等特點(diǎn)的技術(shù)。第二頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日核酸雜交(nucleicacidhybridization)DNA的變性(Denaturation)

：維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂，DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象復(fù)性：變性DNA在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。核酸分子雜交：指具有一定互補(bǔ)序列不同來(lái)源的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則經(jīng)過(guò)退火處理，形成異源雙鏈的過(guò)程。第三頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日核酸雜交核酸雜交探針(probe)：能夠與靶分子核酸按堿基互補(bǔ)原則特異性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。Southernblot:通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶降解樣本中DNA，再經(jīng)凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針（DNA/DNA雜交）進(jìn)行檢測(cè)的方法。用于基因組DNA特異性序列定位、檢測(cè)目標(biāo)DNA。Northernblot:應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA的一種雜交技術(shù)。用于研究特異性mRNA分子在細(xì)胞處于不同條件下發(fā)生量和質(zhì)的變化，或不同組織器官中基因表達(dá)的差異。第四頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日Southernblot第五頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日蛋白質(zhì)印跡-Westernblot將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異性蛋白質(zhì)檢測(cè)方法將獲得的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)，對(duì)不同分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，再將凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用特異性抗體（一抗）與膜上的靶蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，再加入與一抗特異性結(jié)合帶有標(biāo)記的二抗(HRP/AP)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影，檢測(cè)被檢生物樣本中目的基因蛋白表達(dá)情況第六頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日Westernblot第七頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日三種印跡技術(shù)的比較第八頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日原位雜交(insituhybridization,ISH)

將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。為研究單一細(xì)胞中DNA和編碼各種蛋白質(zhì)、多肽的相應(yīng)mRNA的定位提供了手段，使從分子水平研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及有關(guān)基因調(diào)控提供了有效的工具。第九頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日菌落原位雜交與熒光原位雜交(FISH)第十頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日生物芯片(biochip)將核酸、多肽或蛋白質(zhì)分子、組織切片和細(xì)胞等制成探針，以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等載體上，構(gòu)成二維分子列陣，與待測(cè)生物樣本靶分子雜交，通過(guò)檢測(cè)信號(hào)實(shí)現(xiàn)快速、高效、高通量樣本檢測(cè)。第十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日微列陣芯片(microarraychip)基因芯片(DNAmicroarray)：將cDNA或寡核苷酸按微陣列方式固定在微型載體上，以此為探針與待測(cè)樣品中基因雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列信息的快速檢測(cè)和分析。蛋白質(zhì)芯片(proteinmicroarray)：將已知的多肽、蛋白質(zhì)按微陣列方式固定在微型載體上，利用抗原與抗體、受體與配體、酶與底物、蛋白與其他小分子間相互作用，檢測(cè)分析多肽、蛋白質(zhì)的一項(xiàng)技術(shù)。第十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日微列陣芯片(microarraychip)細(xì)胞芯片：在芯片上完成對(duì)細(xì)胞的捕獲、固定、平衡、運(yùn)輸、刺激及培養(yǎng)等精確控制，并通過(guò)微型化的化學(xué)分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞樣品的高通量、多參數(shù)、連續(xù)原位信號(hào)檢測(cè)和細(xì)胞組分的理化分析等研究目的。組織芯片：將不同生物體的組織按預(yù)先設(shè)計(jì)或研究需要排列在固相載體山所形成的組織微列陣。第十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日基因芯片第十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日目的基因制備技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)：在體外由引物介導(dǎo)的、酶促快速合成擴(kuò)增特定基因或DNA片段的一種方法。cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary):某一生物特定器官或特定發(fā)育階段的細(xì)胞內(nèi)總mRNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此構(gòu)建的重組DNA克隆群?；瘜W(xué)合成：序列已知的較短目的基因第十五頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)原理：以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶作用下，以dNTPs為底物，按照半保留復(fù)制原理，通過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟不斷重復(fù)完成新DNA合成。PCR體系的基本成分：模板、特異性引物、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、二價(jià)陽(yáng)離子(Mg2+)、緩沖液、一價(jià)陽(yáng)離子第十六頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日PCR的基本步驟變性：雙鏈DNA解離成為單鏈(94℃)退火(復(fù)性)：引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合（50℃左右）延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)原則，合成一條新的互補(bǔ)鏈（70℃左右）第十七頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日PCR的應(yīng)用研究—目的基因的擴(kuò)增、基因克?。籇NA測(cè)序；基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究、分析突變?cè)\斷—細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)檢測(cè)及診斷人類基因組工程—遺傳圖譜的構(gòu)建；DNA測(cè)序；表達(dá)圖譜法醫(yī)—犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析、親子鑒定腫瘤—各種腫瘤檢測(cè)其他……第十八頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日cDNA文庫(kù)基本原理：用Oligo(dT)作為逆轉(zhuǎn)錄引物，或使用隨機(jī)引物，以提取的總mRNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，合成的cDNA連接到適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后獲得包含cDNA的克隆群?；静襟E：(1)提純獲取高質(zhì)量的mRNA;(2)cDNA第一條鏈的合成;(3)cDNA第二條鏈的合成;(4)雙鏈cDNA的修飾;(5)雙鏈cDNA的分子克隆;(6)cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增;(7)cDNA文庫(kù)鑒定評(píng)價(jià)。第十九頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日第二十頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日cDNA文庫(kù)的優(yōu)越性在基因組水平上研究某基因?qū)ζ鞴俳M織和細(xì)胞在個(gè)體發(fā)育中的影響cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行，尤其適用于某些特殊組織基因的制備由于每一個(gè)cDNA克隆都包含一種mRNA序列，在篩選中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率降低為了測(cè)定mRNA序列，利用它的cDNA拷貝序列就可以有效分析外顯子的基因結(jié)構(gòu)第二十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)合成作為核酸分子雜交探針作為測(cè)序及PCR的引物制備較小的基因或天然來(lái)源不易得到的完整基因或用于改造天然基因作為DNA末端改造中的接頭、引入酶切位點(diǎn)用于基因定位及位點(diǎn)專一性改變第二十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日基因敲除技術(shù)(Geneknockout)外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中。原理與基本操作:(1)ESCs(embryostemcells)的獲得;(2)基因載體的構(gòu)建;(3)目的基因?qū)?(4)同源重組ESC的篩選;(5)靶細(xì)胞導(dǎo)入小鼠體內(nèi);(6)表型研究;(7)得到純合體第二十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日基因敲除小鼠的產(chǎn)生原理第二十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日RNA干擾技術(shù)RAN干擾(RNAinterference,RNAi):外源和內(nèi)源性雙鏈RNA(double-strandRNA,dsRNA)在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的技術(shù)。RNAi的作用機(jī)制:RNA誘導(dǎo)的DNA甲基化：RNA被降解為21-23nt小片段，特異性誘導(dǎo)同源序列DNA甲基化。dsRNA誘導(dǎo)的RNAi作用。第二十五頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日dsRNA誘導(dǎo)的RNAi作用機(jī)制起始階段：dsRNA被Dicer加工裂解為21-23nt的siRNA效應(yīng)階段：siRNA與解旋酶、ATP、多種蛋白質(zhì)形成RISC，結(jié)合并切割靶mRNA第二十六頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日RNAi的作用特點(diǎn)高度特異性高效性受多基因控制需要siRNA介導(dǎo)對(duì)靶基因位點(diǎn)具有選擇性具有放大效應(yīng)第二十七頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日siRNA的設(shè)計(jì)與制備設(shè)計(jì)原則:(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開(kāi)始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn);(2)盡量避免5‘和3’端的非編碼區(qū)；(3)siRNA序列的GC含量應(yīng)為30