培養(yǎng)基配制21課件

293T細(xì)胞在不同血清及不同濃度血清中的生長能力測試對比

細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)習(xí)成果報(bào)告趙鋒2016.6.19甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司293T細(xì)胞在不同血清及不同濃度血清中的生廠商產(chǎn)品貨號批號BiologicalIndustriesTest進(jìn)口NBCS04-102-1

BiologicalIndustriesFBS04-001-1

BiologicalIndustriesDMEM-Hg01-100-1

BiologicalIndustriesPBS02-024-1

BiologicalIndustries胰酶03-050-1

CORNINGT25V119297

備注：用

____________細(xì)胞培養(yǎng)I.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?93T細(xì)胞在不同血清及不同濃度血清中的生長能力測試對比。II.實(shí)驗(yàn)材料：宿主細(xì)胞來源：中國科學(xué)院上海細(xì)胞系甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司廠商產(chǎn)品貨號批號BiologicalIndustriesTⅢ.實(shí)驗(yàn)步驟：1.細(xì)胞培養(yǎng)前操作程序1.1操作前準(zhǔn)備步驟

1.1.1培養(yǎng)基與胰酶等需用試劑，由冰箱取出，置于室溫回溫備用；同時(shí)開啟生物操作柜風(fēng)機(jī)和紫外光燈管電源，殺菌10-15分鐘后切換至日光燈照明。1.1.2確認(rèn)C02培養(yǎng)箱與自制培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定應(yīng)為37C，二氧化碳濃度應(yīng)為5%。所有操作步驟中，要進(jìn)入生物操作柜的物品，都必定要均勻噴灑過75%的酒精才可進(jìn)入生物操作柜。操作人員戴上手套的手，進(jìn)入生物操作柜之前，也需均勻噴灑過酒精。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司Ⅲ.實(shí)驗(yàn)步驟：甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司2.培養(yǎng)基配制2.1配制三種培養(yǎng)基

DMEM-Hg+10%FBSDMEM-Hg+10%NBCSDMEM-Hg+20%NBCS2.2無菌測試實(shí)驗(yàn)

取一個(gè)六孔板，每個(gè)孔加入3ml培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基做兩個(gè)平行，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，中間連續(xù)觀察六孔板菌落生長情況。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司2.培養(yǎng)基配制甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司2.2培養(yǎng)基成分以及作用培養(yǎng)基:緩沖鹽,氨基酸,維生素,醣/碳源.血清/生長因子:生長因子,貼壁因子...培養(yǎng)環(huán)境:氧氣:參與能量代謝.5%二氧化碳:維持酸堿平衡.甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司Glutamine為細(xì)胞主要ATP來源.易分解,半衰期:4℃為一個(gè)月,37℃約一周.BI基礎(chǔ)培養(yǎng)基:4℃一年,谷氨酰胺>100mg/L.

血清:生長因子,蛋白質(zhì),脂肪,醣類.

血清替代物:生長因子/蛋白質(zhì).

貼壁試劑:細(xì)胞外基質(zhì),促貼壁因子.甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司3.細(xì)胞解凍

購買的細(xì)胞通常會將細(xì)胞、培養(yǎng)基和抗凍劑混合之后裝在冷凍小管中冷凍并存放于液態(tài)氮桶。在開始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需將冷凍小管解凍。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司3.細(xì)胞解凍甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司3.1操作過程

將冷凍小管（293T細(xì)胞）由液氮中取出置于室溫回溫當(dāng)小管外面的霜溶化后就可拿到生物安全柜中操作以五毫升移液管吸取4mL新鮮培養(yǎng)基小心沖散管內(nèi)冰塊。用移液管將全部溶液轉(zhuǎn)移至干凈的15ml離心管中，再加入5mL新鮮培養(yǎng)基，拿到離心機(jī)以1000rpm離心5分鐘。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司3.1操作過程甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司

至生物操作柜中倒掉上清液，用移液管將殘余液體吸走。

用干凈的移液管抽取新鮮培養(yǎng)基，以吸放的方式將離心管中的細(xì)胞懸浮起來之后，即可將細(xì)胞與培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中來培養(yǎng)。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司

隔日，為移除可能殘余的抗凍劑，移除培養(yǎng)皿中原有的培養(yǎng)基，用移液管再次加入新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至此完成細(xì)胞解凍培養(yǎng)的程序。

觀察無菌測試結(jié)果，在倒置顯微鏡下可以看到血清中的纖維凝結(jié)，無菌落生長，可以使用。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司4.細(xì)胞培養(yǎng)

將培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中的細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)，或是根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行分盤。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司4.細(xì)胞培養(yǎng)甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司4.1操作過程將培養(yǎng)皿自培養(yǎng)箱中取出，于生物安全柜中用移液管抽去所有溶液。用移液管吸取3-5mL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，加入至培養(yǎng)皿中，以輕微搖晃的方式潤洗細(xì)胞層，之后用相同一支移液管將PBS溶液吸取至廢液收集瓶。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司4.1操作過程甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司吸取1-3mL的胰酶溶液，均勻加入至培養(yǎng)皿當(dāng)中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-10分鐘(視不同細(xì)胞貼壁能力而定)。用移液管吸取新鮮培養(yǎng)基沖散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液置于干凈離心管并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過計(jì)數(shù)得到細(xì)胞濃度：5.3×105個(gè)/ml甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司吸取1-3mL的胰酶溶液，均勻加入至培養(yǎng)皿當(dāng)中，放入培養(yǎng)箱中通過計(jì)算，以總數(shù)1×104個(gè)293T細(xì)胞接種到3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天后，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。接種過程：取一個(gè)六孔板，每個(gè)孔加入3ml培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基做兩個(gè)平行，按100ul接種量接種到每個(gè)孔中，輕輕搖勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司通過計(jì)算，以總數(shù)1×104個(gè)293T細(xì)胞接種到3種培養(yǎng)基中培DMEM-Hg+10%FBSDMEM-Hg+10%NBCSDMEM-Hg+20%NBCSDMEM-Hg+10%FBSDMEM-Hg+10%NBCSDMEM-Hg+20%NBCS每孔接種100ul293T細(xì)胞甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司DMEM-Hg+10%FBSDMEM-5.細(xì)胞計(jì)數(shù)

計(jì)算細(xì)胞濃度或是細(xì)胞數(shù)目、存活率。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司5.細(xì)胞計(jì)數(shù)甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司5.1操作步驟：取出血球計(jì)數(shù)板，用酒精擦拭其玻片與蓋玻片表面。將蓋玻片放置于玻片上。取Trypanblue10μl于一干凈Eppendorf管上。用移液器以10μl的培養(yǎng)基將細(xì)胞重新懸浮起來，取出置于Eppendorf管中，混合均勻。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司5.1操作步驟：甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司用移液器取微量混合液填充至其中一個(gè)chamber中(圖右)。此時(shí)血球計(jì)數(shù)板用倒立顯微鏡以10X物鏡觀看

chamber中央。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司用移液器取微量混合液甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司數(shù)算區(qū)塊1、2、3、4、5中的細(xì)胞數(shù)目之后平均，得到平均數(shù)A。此估計(jì)法為A在50-200之間時(shí)估計(jì)較準(zhǔn)確。若此時(shí)A大于200，則需稀釋一倍之后再來計(jì)算，直到A介于50-200之間(圖右)。細(xì)胞濃度=A×Dilutefactor×104cells/ml.甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司數(shù)算區(qū)塊1、2、3、4、5中的細(xì)胞數(shù)目之后平均，得到平均Viability=(The#ofunstainedcells／Thetotal#ofcells)×100%細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜將破裂，此時(shí)Trypanblue進(jìn)入細(xì)胞中，細(xì)胞將被染成藍(lán)色；活細(xì)胞則不會被染色呈淡藍(lán)色或白色。藉由顏色的區(qū)分來分辨活細(xì)胞與死細(xì)胞。計(jì)算五區(qū)的viability后取平均得到細(xì)胞存活率。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司Viability=(The#ofunstaine6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果DMEM-Hg+10%FBS-1：5/4

×2×104=2.5×104個(gè)/mlDMEM-Hg+10%FBS-2：12/4

×2×104=6×104個(gè)/mlDMEM-Hg+10%NBCS-1：0/4

×2×104=0個(gè)/mlDMEM-Hg+10%NBCS-2：0/4

×2×104=0個(gè)/mlDMEM-Hg+20%NBCS-1：19/4

×2×104=9.5×104個(gè)/mlDMEM-Hg+20%NBCS-2：14/4

×2×104=7×104個(gè)/ml甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司7.鑒定血清的方法：理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量、球蛋白含量、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司7.鑒定血清的方法：甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司微生物檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細(xì)胞也能生長繁殖，但會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司微生物檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、促生長效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測。有兩種方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

（1）貼瓶率測定：是以貼壁細(xì)胞為培養(yǎng)對象，將細(xì)胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個(gè)細(xì)胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計(jì)集落數(shù)，計(jì)算出集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比，同樣再與標(biāo)準(zhǔn)血清比較，判斷血清質(zhì)量高低。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司促生長效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測。（2）克隆形成率測定：一般以懸浮生長的細(xì)胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細(xì)胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時(shí)間，統(tǒng)計(jì)有克隆生長的孔，計(jì)算出百分比，再與對照的標(biāo)準(zhǔn)血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質(zhì)量間的細(xì)微差別。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司（2）克隆形成率測定：一般以懸浮生長的細(xì)胞為培養(yǎng)對象，按（3）連續(xù)傳代培養(yǎng)法：是將細(xì)胞培養(yǎng)于3個(gè)一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個(gè)周期以上，觀察細(xì)胞生長狀況，并將每次的計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)血清的測試結(jié)果比較。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司（3）連續(xù)傳代培養(yǎng)法：是將細(xì)胞培養(yǎng)于3個(gè)一定體積的培養(yǎng)瓶對于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時(shí)感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長狀況。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司對于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮8.細(xì)胞培養(yǎng)中生長因子如何添加？

在細(xì)胞培養(yǎng)中使用的生長因子多為外源性的，即直接在培養(yǎng)基中加入成品生長因子，外源生長因子的半衰期短，局部使用容易被稀釋，而且要反復(fù)給藥，另外，無論從濃度上還是從生長因子的種類上說都是憑經(jīng)驗(yàn)，沒有具體的加入劑量和加入種類。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司8.細(xì)胞培養(yǎng)中生長因子如何添加？甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司

293T細(xì)胞在不同血清及不同濃度血清中的生長能力測試對比

細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)習(xí)成果報(bào)告趙鋒2016.6.19甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司293T細(xì)胞在不同血清及不同濃度血清中的生廠商產(chǎn)品貨號批號BiologicalIndustriesTest進(jìn)口NBCS04-102-1

BiologicalIndustriesFBS04-001-1

BiologicalIndustriesDMEM-Hg01-100-1

BiologicalIndustriesPBS02-024-1

BiologicalIndustries胰酶03-050-1

CORNINGT25V119297

備注：用

____________細(xì)胞培養(yǎng)I.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?93T細(xì)胞在不同血清及不同濃度血清中的生長能力測試對比。II.實(shí)驗(yàn)材料：宿主細(xì)胞來源：中國科學(xué)院上海細(xì)胞系甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司廠商產(chǎn)品貨號批號BiologicalIndustriesTⅢ.實(shí)驗(yàn)步驟：1.細(xì)胞培養(yǎng)前操作程序1.1操作前準(zhǔn)備步驟

1.1.1培養(yǎng)基與胰酶等需用試劑，由冰箱取出，置于室溫回溫備用；同時(shí)開啟生物操作柜風(fēng)機(jī)和紫外光燈管電源，殺菌10-15分鐘后切換至日光燈照明。1.1.2確認(rèn)C02培養(yǎng)箱與自制培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定應(yīng)為37C，二氧化碳濃度應(yīng)為5%。所有操作步驟中，要進(jìn)入生物操作柜的物品，都必定要均勻噴灑過75%的酒精才可進(jìn)入生物操作柜。操作人員戴上手套的手，進(jìn)入生物操作柜之前，也需均勻噴灑過酒精。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司Ⅲ.實(shí)驗(yàn)步驟：甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司2.培養(yǎng)基配制2.1配制三種培養(yǎng)基

DMEM-Hg+10%FBSDMEM-Hg+10%NBCSDMEM-Hg+20%NBCS2.2無菌測試實(shí)驗(yàn)

取一個(gè)六孔板，每個(gè)孔加入3ml培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基做兩個(gè)平行，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，中間連續(xù)觀察六孔板菌落生長情況。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司2.培養(yǎng)基配制甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司2.2培養(yǎng)基成分以及作用培養(yǎng)基:緩沖鹽,氨基酸,維生素,醣/碳源.血清/生長因子:生長因子,貼壁因子...培養(yǎng)環(huán)境:氧氣:參與能量代謝.5%二氧化碳:維持酸堿平衡.甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司Glutamine為細(xì)胞主要ATP來源.易分解,半衰期:4℃為一個(gè)月,37℃約一周.BI基礎(chǔ)培養(yǎng)基:4℃一年,谷氨酰胺>100mg/L.

血清:生長因子,蛋白質(zhì),脂肪,醣類.

血清替代物:生長因子/蛋白質(zhì).

貼壁試劑:細(xì)胞外基質(zhì),促貼壁因子.甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司3.細(xì)胞解凍

購買的細(xì)胞通常會將細(xì)胞、培養(yǎng)基和抗凍劑混合之后裝在冷凍小管中冷凍并存放于液態(tài)氮桶。在開始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需將冷凍小管解凍。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司3.細(xì)胞解凍甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司3.1操作過程

將冷凍小管（293T細(xì)胞）由液氮中取出置于室溫回溫當(dāng)小管外面的霜溶化后就可拿到生物安全柜中操作以五毫升移液管吸取4mL新鮮培養(yǎng)基小心沖散管內(nèi)冰塊。用移液管將全部溶液轉(zhuǎn)移至干凈的15ml離心管中，再加入5mL新鮮培養(yǎng)基，拿到離心機(jī)以1000rpm離心5分鐘。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司3.1操作過程甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司

至生物操作柜中倒掉上清液，用移液管將殘余液體吸走。

用干凈的移液管抽取新鮮培養(yǎng)基，以吸放的方式將離心管中的細(xì)胞懸浮起來之后，即可將細(xì)胞與培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中來培養(yǎng)。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司

隔日，為移除可能殘余的抗凍劑，移除培養(yǎng)皿中原有的培養(yǎng)基，用移液管再次加入新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至此完成細(xì)胞解凍培養(yǎng)的程序。

觀察無菌測試結(jié)果，在倒置顯微鏡下可以看到血清中的纖維凝結(jié)，無菌落生長，可以使用。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司4.細(xì)胞培養(yǎng)

將培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中的細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)，或是根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行分盤。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司4.細(xì)胞培養(yǎng)甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司4.1操作過程將培養(yǎng)皿自培養(yǎng)箱中取出，于生物安全柜中用移液管抽去所有溶液。用移液管吸取3-5mL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，加入至培養(yǎng)皿中，以輕微搖晃的方式潤洗細(xì)胞層，之后用相同一支移液管將PBS溶液吸取至廢液收集瓶。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司4.1操作過程甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司吸取1-3mL的胰酶溶液，均勻加入至培養(yǎng)皿當(dāng)中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-10分鐘(視不同細(xì)胞貼壁能力而定)。用移液管吸取新鮮培養(yǎng)基沖散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液置于干凈離心管并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過計(jì)數(shù)得到細(xì)胞濃度：5.3×105個(gè)/ml甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司吸取1-3mL的胰酶溶液，均勻加入至培養(yǎng)皿當(dāng)中，放入培養(yǎng)箱中通過計(jì)算，以總數(shù)1×104個(gè)293T細(xì)胞接種到3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天后，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。接種過程：取一個(gè)六孔板，每個(gè)孔加入3ml培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基做兩個(gè)平行，按100ul接種量接種到每個(gè)孔中，輕輕搖勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司通過計(jì)算，以總數(shù)1×104個(gè)293T細(xì)胞接種到3種培養(yǎng)基中培DMEM-Hg+10%FBSDMEM-Hg+10%NBCSDMEM-Hg+20%NBCSDMEM-Hg+10%FBSDMEM-Hg+10%NBCSDMEM-Hg+20%NBCS每孔接種100ul293T細(xì)胞甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司DMEM-Hg+10%FBSDMEM-5.細(xì)胞計(jì)數(shù)

計(jì)算細(xì)胞濃度或是細(xì)胞數(shù)目、存活率。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司5.細(xì)胞計(jì)數(shù)甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司5.1操作步驟：取出血球計(jì)數(shù)板，用酒精擦拭其玻片與蓋玻片表面。將蓋玻片放置于玻片上。取Trypanblue10μl于一干凈Eppendorf管上。用移液器以10μl的培養(yǎng)基將細(xì)胞重新懸浮起來，取出置于Eppendorf管中，混合均勻。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司5.1操作步驟：甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司用移液器取微量混合液填充至其中一個(gè)chamber中(圖右)。此時(shí)血球計(jì)數(shù)板用倒立顯微鏡以10X物鏡觀看

chamber中央。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司用移液器取微量混合液甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司數(shù)算區(qū)塊1、2、3、4、5中的細(xì)胞數(shù)目之后平均，得到平均數(shù)A。此估計(jì)法為A在50-200之間時(shí)估計(jì)較準(zhǔn)確。若此時(shí)A大于200，則需稀釋一倍之后再來計(jì)算，直到A介于50-200之間(圖右)。細(xì)胞濃度=A×Dilutefactor×104cells/ml.甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司數(shù)算區(qū)塊1、2、3、4、5中的細(xì)胞數(shù)目之后平均，得到平均Viability=(The#ofunstainedcells／Thetotal#ofcells)×100%細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜將破裂，此時(shí)Trypanblue進(jìn)入細(xì)胞中，細(xì)胞將被染成藍(lán)色；活細(xì)胞則不會被染色呈淡藍(lán)色或白色。藉由顏色的區(qū)分來分辨活細(xì)胞與死細(xì)胞。計(jì)算五區(qū)的viability后取平均得到細(xì)胞存活率。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司Viability=(The#ofunstaine6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果DMEM-Hg+10%FBS-1：5/4

×2×104=2.5×104個(gè)/mlDMEM-Hg+10%FBS-2：12/4

×2×104=6×104個(gè)/mlDMEM-Hg+10%NBCS-1：0/4

×2×104=0個(gè)/mlDMEM-Hg+10%NBCS-2：0/4

×2×104=0個(gè)/mlDMEM-Hg+20%NBCS-1：19/4

×2×104=9.5×104個(gè)/mlDMEM-Hg+20%NBCS-2：14/4

×2×104=7×104個(gè)/ml甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司7.鑒定血清的方法：理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量、球蛋白含量、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司7.鑒定血清的方法：甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司微生物檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染