生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗(yàn)

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1.分光光度計(jì)（1）基本原理：溶液溶質(zhì)在其一定波長的吸收光中，其吸光度值與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，即遵循朗伯一比爾定律，通過也在一定液體厚度時(shí)測(cè)定其吸光度來與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較從而測(cè)得待測(cè)液溶質(zhì)濃度。（2）吸光度與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，稱為朗伯―比爾定律，簡稱比爾定律，即光的吸收定律。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=-lgT=ebcA：吸光度，又稱光密度“”；￡:吸光系數(shù)（L-molT-cm-i）；比例常數(shù)，稱吸光系數(shù)b：樣品光程（cm）,通常使用的吸收池，則b=1cm；c：樣品濃度（mol/L）。吸光度“A”具有加和性，即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)￡相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例：尿嘧啶核甘酸溶液用1cm石英吸收池測(cè)定260nm的吸光度為，用同一吸收池測(cè)定純?nèi)軇┑奈舛葹?，已知其摩爾吸光系?shù)二X103M-icm,計(jì)算其摩爾濃度.VA=ebC???A=（溶劑加樣品的吸光度）一（溶劑的吸光度）.?.A=-=*/b=1cm.??C==X10-5mol/L(2)等電點(diǎn)的計(jì)算方法;標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(1)配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。(2)在測(cè)定條件相同的情況下，分別測(cè)定其吸光度。(3)以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(不必考慮顯色劑等引起的濃度變化)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖。(4)在相同條件下測(cè)出樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。2、酪蛋白的提取過程：坤乳23沉淀內(nèi)耐4ml添渾離心,innnn2分，2、酪蛋白的提取過程：坤乳23沉淀內(nèi)耐4ml添渾離心,innnn2分，5分鐘］脫水)4。七水浴獲熱1U分鐘U1AL諼沖液同眄預(yù)熱>用酒言加入11AC緩沖懣為2nli<EJ14.8>離心，，a<)。轉(zhuǎn)/分，3分鐘X沉淀W.lmoiXLXaOH2tfcil力II至10ml沆淀用親饋水說那離心J0M。傳/分盧分沖〔除凱淀中何案物)沉淀fig+wI洗豫離心，IQQ口優(yōu)方/分，吊分加工陳廟)潔彼指敞潔'液.原理；牛乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，它是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為。利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的性質(zhì)，將牛乳的PH調(diào)至?xí)r，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純化的酪蛋白。.主要試劑：牛乳醋酸鈉緩沖液,PH4.6,乙醇，乙酸，氫氧化鈉PPT后面問題：(1)醋酸緩沖液、蒸餾水、乙醇、丙酮洗滌沉淀的目的分別是什么醋酸緩沖液：調(diào)節(jié)PH到等電點(diǎn)。蒸餾水：出去沉淀中的可溶物。乙醇：除去沉淀中的脂類物質(zhì)。丙酮洗滌：脫水。（2）最后所得的沉淀中加入1NaOH的作用是什么酪蛋白是酸性蛋白質(zhì)，溶解于堿性溶液中，方便下次雙縮脲法測(cè)定。（3）制備高產(chǎn)率酪蛋白的關(guān)鍵是什么剛開始時(shí)對(duì)牛奶的ph的調(diào)節(jié),最好是調(diào)節(jié)到,越接近越好,這是最主要的。（4）請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)另一種提取酪蛋白的方法。1、向酪蛋白溶液中加入高濃度（NH4）2SO4溶液2、10000轉(zhuǎn)/分,5分鐘，去上清液3、95%乙醇4ml洗滌離心，10000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，去上清液4、丙酮4ml洗滌離心，10000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，去上清液5、LNaOH2ml加水至10ml3、雙縮服法測(cè)蛋白質(zhì)含量（1）.蛋白質(zhì)測(cè)定的5種方法：凱式定氮法（Kjedahl法）紫外吸收法雙縮脲法（Biuret法）Folin-酚試劑法（Lorry法）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）TCA：三氯乙酸4.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理：考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，染料主要是與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸和芳香氨基酸殘基結(jié)合，使染料最大吸收峰位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。在595nm下測(cè)定的吸光度A595,與蛋白質(zhì)濃度成正比。.干擾物質(zhì)有哪些TritonX-100、SDS、強(qiáng)堿性緩沖液等.G250與R250的區(qū)別：比考馬斯亮藍(lán)R250多二個(gè)甲基，染色靈敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。優(yōu)點(diǎn)在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色。所以常用于需要重復(fù)性好和穩(wěn)定的染色，適于作定量分析。⑶.PPT后的4個(gè)思考題。說明各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定法中哪幾種可以測(cè)出蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量，哪幾種只能測(cè)定其相對(duì)含量，為什么只有凱氏定氮法可以測(cè)定蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量，因?yàn)槊康鞍踪|(zhì)含1g氮，試驗(yàn)中可以除去非蛋白氮，所以，通過氮含量的測(cè)定，可以得到蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量。其他的幾種方法，由于都使用了標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以，所測(cè)得的未知蛋白的含量，都是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量而言的?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量使用的局限性有哪些(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)時(shí)有較大的偏差，最好選用與待測(cè)樣品氨基酸成份相同的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的TritonX-100、SDS、強(qiáng)堿性緩沖液等。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線形，因而不能用比爾定律進(jìn)行計(jì)算而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。在實(shí)驗(yàn)中，使用的水一定是蒸餾水嗎為什么因?yàn)锽radford檢測(cè)中要用的試劑配制，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作都要用到水.如果不是使用蒸儲(chǔ)水,可能水里面會(huì)有一些游離的離子或者電解質(zhì)，會(huì)影響試劑配制的準(zhǔn)確性,干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果.而水中殘留的有機(jī)物等可能會(huì)和考馬斯亮藍(lán)發(fā)生變色反應(yīng)，這樣制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)比實(shí)際值偏高，導(dǎo)致最終濃度檢測(cè)的結(jié)果比實(shí)際結(jié)果偏低。SDS干擾考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理是什么當(dāng)溶液中存在一定量的SDS后所測(cè)得的吸光度比正常值相對(duì)減小。但是隨著SDS濃度的增加，吸光度的減小量應(yīng)沒有呈現(xiàn)出很明顯的規(guī)律。由于SDS的存在，阻礙了染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的結(jié)合，使得吸光度減小。由于SDS與染料分子對(duì)蛋白質(zhì)的競(jìng)爭結(jié)合，使得顯色減弱，吸光度值降低，因此在曲線前段呈下降趨勢(shì)；但由于SDS破壞氫鍵，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更加伸展，一些原來包裹在結(jié)構(gòu)中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出來，所以會(huì)有少量的吸光度回升；但最終SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合達(dá)到所處溶液條件下的“飽和”時(shí)，過量的SDS就不起作用了，曲線是最后為平緩段。要去除SDS的干擾，可以利用它與K+結(jié)合生成沉淀的性質(zhì)將其去除。K+對(duì)考馬斯亮藍(lán)方法不產(chǎn)生干擾。5、醋酸纖維薄膜電泳原理：生物分子在某個(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向不同分子以不同速度移動(dòng)。電泳影響因素： 蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度取決于蛋白質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)、數(shù)量、自身大小和形狀；此外還受外界因素的影響如，電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的PH、離子強(qiáng)度等。.結(jié)合實(shí)驗(yàn)報(bào)告冊(cè)，回憶操作過程，首先醋酸纖維薄膜先看粗糙面，在粗糙面上畫點(diǎn)樣線，畫好后做標(biāo)記，泡在緩沖溶液中浸泡完全（上面無白斑），然后點(diǎn)樣，點(diǎn)樣后放掉電泳槽中電泳，電泳后染色，然后脫色。（熟悉整個(gè)過程，如果把過程打亂，能否正確排序）（選擇題）結(jié)果是5條帶，哪條帶最接近點(diǎn)樣線，哪條線最遠(yuǎn)。要求會(huì)畫圖，畫圖要記醴酸纖維薄膜法顯示血清蛋白質(zhì)從正板起依次為白蛋白、31壬蛋白、液壬蛋白、P費(fèi)蛋白和下一球蛋白五條區(qū)帶i日3-程妹白=13工-珞蛇白=3P■-爆空白理垢白—點(diǎn)樣處得畫點(diǎn)樣線。.血清蛋白的臨床意義。組成：白蛋白、a1、a2、B和Y-球蛋白；功能：維持血漿膠體滲透壓；調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡；運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等；免疫作用。血清蛋白是血漿中最主要的固體成分，含量為60?80g/L減少：長期慢性發(fā)熱、大面積燒傷（白細(xì)胞增多），惡性腫瘤、肝癌（淋巴細(xì)胞和核細(xì)胞增多），肝功能嚴(yán)重受損、肝壞死、肝硬化（谷丙轉(zhuǎn)氨酶增多），甲狀腺功能亢進(jìn)、漿膜滲出性損害、結(jié)核病、慢性腹瀉、慢性肝炎、腎病綜合征、吸收不良綜合征，營養(yǎng)不良、貧血（紅細(xì)胞，紅蛋白稍偏低）等。增加：大量出汗、多發(fā)性骨髓瘤、腹瀉、巨球蛋白血癥、嚴(yán)重嘔吐、中母等。6、血糖測(cè)定（吳憲血糖測(cè)定法）（1）.吳憲血糖測(cè)定法的優(yōu)勢(shì)（波長620nm）:優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比雙縮尿法靈敏得多工作原理：葡萄糖+Cu（OH）2 - Cu2O!CuO+磷鉬酸- 鉬藍(lán)2鉬藍(lán)的藍(lán)色深淺與葡萄糖的含量成正比，所以可以用比色法來測(cè)定鉬藍(lán)的光吸收值來測(cè)定血糖的含量（波長620nm）。（2）為什么選用無蛋白血濾液有蛋白的話會(huì)與堿性銅試劑發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，也呈藍(lán)色，干擾最后的結(jié)果（3）水浴8min后，取出為何切記搖動(dòng) 氧化亞銅易已被氧化（4）空腹血糖的正常范圍：一般空腹全血血糖為?L（70?110毫克/分升），血漿血糖為?L（70?125毫克/分升）?？崭谷?，L（120毫克/分升）、血漿血糖，L（140毫克/分升），2次重復(fù)測(cè)定可診斷為糖尿當(dāng)空腹全血血糖在L（100毫克/分升）以上，血漿血糖在L（115毫克/分升）以上，應(yīng)做糖耐量試驗(yàn)。當(dāng)空腹全血血糖超過L（200毫克/分升）時(shí)，表示胰島素分泌極少或缺乏。因此，空腹血糖顯著增高時(shí)，不必進(jìn)行其它檢查，即可診斷為糖尿病。（5）PPT后的3個(gè)思考題Folin-吳憲法為什么要用無蛋白血濾液有蛋白的話會(huì)與堿性銅試劑發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，也呈藍(lán)色，干擾最后的結(jié)果Folin-吳法測(cè)定血糖的優(yōu)缺點(diǎn)是什么優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比雙縮尿法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)，要精確控操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性比較差，干擾物質(zhì)比較多進(jìn)行比色法測(cè)定時(shí)，如果測(cè)得樣品的A值超過100%，該如何處理，為什么測(cè)得樣品值超過100%是因?yàn)橛衅渌€原物質(zhì)，使其待測(cè)液中血糖的濃度過高所造成的，應(yīng)該將待測(cè)液稀釋后再進(jìn)行比色。7、谷丙氨酸酶的臨床意義;臨床ALT(GPT)廣泛存在于機(jī)體各種組織中，但在肝細(xì)胞中含量最多.當(dāng)肝臟有病變，特別是急性肝炎及肝細(xì)胞壞死，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高.在肝癌.肝硬變以及膽道疾病時(shí)，此酶活性也可中度或輕度增高.丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移醮(AlanineTransaminase,ALT)7、谷丙氨酸酶的臨床意義;臨床ALT(GPT)廣泛存在于機(jī)體各種組織中，但在肝細(xì)胞中含量最多.當(dāng)肝臟有病變，特別是急性肝炎及肝細(xì)胞壞死，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高.在肝癌.肝硬變以及膽道疾病時(shí)，此酶活性也可中度或輕度增高.丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移醮(AlanineTransaminase,ALT)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GlutamicpyruvicTransaminase,GPT)年N-：OOHHsN—靜時(shí)二翻￥丙副發(fā)(1)、谷丙氨酸酶的測(cè)定方法；知道什么是賴氏法，什么是改良賴氏法乳酸脫氫的乳酸脫氫的改良賴氏法GPT」丙氨酸+一函戊二酸 . ?有氨酸十丙酮酸分光光度法ZAI>++乳酸?頓氏.法（R^ilman）.心宮開張對(duì)樗-氫疇活?莊單也提出規(guī)定，他是用卡n氏手夫（Karman）和定單住岫,即用卡門氏法所測(cè)出的單仔艇#目當(dāng)于籟氏法所產(chǎn)生花西胴酸黃的相關(guān)系生乙套用卡門氏單住而五..由心匕可見，涮定同一徐血清的樗-氫酶活,性，用不同方法測(cè)穿，其位不一樣。國而它4門的工常值庖國也可有顯著差異.（2）、改良后的方法優(yōu)勢(shì)在哪.反應(yīng)溫度：40℃改為37℃；.底物濃度：高改低；.套用卡門氏單位，與速率法一致，反映了酶的真實(shí)活性（3）、在做實(shí)驗(yàn)時(shí)用到a—酮戊二酸、丙酮酸、硝基苯肼，他們的原理以及試劑的作用；（4）、該實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：2,4-二硝基苯朋可與有酮基的化合物作用形成苯腺硝醍化合物；溶血標(biāo)本不宜采用，因血細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活力較高，影響測(cè)定結(jié)果；在測(cè)定時(shí)，如酶活力較大（大于150KarU），應(yīng)將樣品稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。（5）、PPT后的6個(gè)思考題1、ALT的臨床意義AST的測(cè)定對(duì)于肝病的診斷具有十分重要的意義，特別是AST/ALT比值大小對(duì)于臨床判定肝病嚴(yán)重程度具有十分重要的意義，是臨床診治肝病的重要指標(biāo)之一2、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定的注意事項(xiàng)以及為何要避免溶血常溫下標(biāo)本不宜久存，（2）嚴(yán)重脂血、黃疸、溶血和糖尿病酮癥酸中毒病人血清標(biāo)本可增加測(cè)定的吸光度，測(cè)定這類標(biāo)本應(yīng)做血清標(biāo)本對(duì)照組（3）當(dāng)標(biāo)本的酶活性超過150K

時(shí)，應(yīng)將血清中用L氯化鈉稀釋重做，其結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)（4）酮戊二酸，2,4-二硝基甲苯肼是直接顯色物，NAOH的濃度與顯色深淺有關(guān)，因此它們的濃度必須很準(zhǔn)確（5）丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)濃度要求十分精確（6）加入2,4-二硝基苯肼溶液之后應(yīng)充分混勻當(dāng)溶血之后，紅細(xì)胞中的ALT會(huì)進(jìn)入血液中，導(dǎo)致測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較大，不符合實(shí)際情況3、對(duì)照管的意義是什么減少非試驗(yàn)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響4、底物液為何要37℃預(yù)溫5min人體的體溫為37℃，只有在此溫度下酶的活性才會(huì)達(dá)到最大，因此必須先讓酶的活性達(dá)到最大才與底物反應(yīng)5、為什么在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)要加入基質(zhì)液使反應(yīng)的溶液體積相同，減少因體積不同而造成的實(shí)驗(yàn)非決定性因素的影響6、為什么在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)加入基質(zhì)液的體積不同，對(duì)反應(yīng)沒有影響基底液與底物和酶都不反應(yīng)，它的作用只是調(diào)節(jié)溶液的體積酶活性的單位：國際單位：1961年酶學(xué)委員會(huì)建議使用統(tǒng)一單位，在規(guī)定條件下，1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1umol底物所需的酶量，稱為一個(gè)國際單位（IU,又稱U）?？ㄩT氏單位的定義為:在紫外分光光度計(jì)中，1ml血清（反應(yīng)溶^凝思量為3ml）在波長下，周內(nèi)彳至為1.0心m晶上匕色皿,在25C,1分鐘內(nèi)生成的丙酮酸，在孝L酸加氫薛催化,下，使NADH+H*重成NAD+,使光密度下降0.G01為1個(gè)轉(zhuǎn)氨酶活性單住n谷氨酸十丙酮酸NAT>H+H谷氨酸十丙酮酸NAT>H+H+乳酸脫氧酶ZAJD,+乳酸丙氨酸+酮戊二酸=■NA0H在260rlm和34Onm處備育--吸收J(rèn)車，而NAD,只有26Ontn一處吸耳笊心多，因止匕以NADH為輔E晦白勺各種脫氮酶都可逋過34口門巾光吸收值的及變,定量測(cè)定畸活力工8、豬肝DNA基因組DNA的提取制備DMA溶液工口NA沉淀溶于O」制備DMA溶液工口NA沉淀溶于O」nwl/L的N^OH<lmL^在沉淀中加入N3CI-EDTA溶液洗2次,同上離心離心二4OOOrpmr5min（絲狀物〉將訊徒懸于：LOmlNaCI-EDTA溶液中，分裝于2支MnilEP管t小心吸出LU清液,向上清液中加入1.5一2倍體積的95%乙醇每管湎力口1ml250/dSDS溶液，邊加邊振蕩緩。加入始1倍體積的氯仿一樣虎醉泡合液,蛔蝶形板篇與E『n.離心1口口正口（lOOOOrpm^*行QP水溶工OeEC不停振蕩）5mol/lNaClX^&lmU蜘蝶影振取一支lOmlEF管.裝入糊狀物（基本裝滿）401OOOOrpm^^SminHF朋ANA提取的流程圖實(shí)驗(yàn)原理一定要掌握。提取過程中用到的試劑作用;PPT后的思考題（1）實(shí)驗(yàn)原理:DNA與RNA的分離：DNP在NaCl鹽溶液中溶解度很低，而RNP則溶于鹽溶液，利用這一性質(zhì)可將生物組織中的DNA與RNA分開。DNA在高濃度的鹽溶液中溶解度最大。去除DNP中的蛋白：SDS使之變性除去（同時(shí)破壞核酸分解酶）。進(jìn)一步純化則利用氯仿-異戊醇震蕩除蛋白，震蕩時(shí)，蛋白質(zhì)變性，形成凝膠，并與DNA分開，DNA則留在水層中。沉淀DNA：利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇將DNA從溶液中沉淀出來。提取過程中用到的試劑作用1、取新鮮豬肝4g，用LLEDTA溶液洗去血液，剪碎。加入10mLLLEDTA溶液，置勻漿器中研磨。（初步破碎細(xì)胞）。（已做）2、取一支10mLEP管，裝入糊狀物（基本裝滿），離心5min（10000rpm），棄去上清液。沉淀用lLEDTA溶液洗兩次。每次加入溶液后用吸管吹打均勻再離心（同上），直到上清液無血細(xì)胞。棄上清液，所得沉淀為DNP（DNA蛋白復(fù)合物）粗制品3、向上述沉淀物加入LNaClLEDTA溶液5mL，然后每管滴加25%的SDS溶液1mL，邊加邊振蕩。加畢，置60℃水浴10min（不停振蕩），直至溶液變得粘稠并略透明，取出冷卻至室溫。此步驟使核酸與蛋白質(zhì)分離。4、每管加入5mol/lNaCl溶液2mL，蝴蝶形振蕩5山皿。加入約1倍體積的氯仿一異戊醇混合液，蝴蝶形振蕩5山皿，離心10山皿（4000^山）。（此步驟后溶液分三個(gè)相：上層水相（DNA）；中層變性蛋白質(zhì)相；下層有機(jī)相和殘余的RNA。）5、吸出上清液，棄去沉淀。向上清液中緩慢加入-2倍體積的95%乙醇，DNA沉淀析出，［離4（4000rpm）5min］用玻棒攪出的絲狀物則為粗DNA6、制備DNA溶液：用L的NaOH1mL,溶解DNA沉淀，為下次的《DNA含量測(cè)定》提供材料PPT后的思考題.核酸提取中SDS、氯仿-異戊醇各有什么作用SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。氯仿可去除DNA溶液中微量酚的污染，異戊醇還可減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡.結(jié)合本人操作的體會(huì)，試述在提取過程中應(yīng)應(yīng)該注意些什么且如何避免大分子DNA的降解和斷裂震蕩過程中力度不能過大，力度過大會(huì)導(dǎo)致DNA分子斷裂，也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。離心時(shí)間應(yīng)適合，時(shí)間太長可能會(huì)導(dǎo)致DNA分子斷裂，時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致DNA分子不能得以與蛋白質(zhì)分離，水浴時(shí)間與溫度應(yīng)該適宜，溫度為65度時(shí)間為6分鐘最適合。.核酸提取過程中，除去雜蛋白的方法主要有哪幾種4種：紫外線吸收法，定磷法，二苯胺法，地衣酚（苔黑酚）法.預(yù)習(xí)：核酸定量測(cè)定方法有幾種9、DNA樣品含量的測(cè)定（有5種方法；我們做了紫外法和二苯胺法，其他方法要掌握實(shí)驗(yàn)原理，做實(shí)驗(yàn)的兩種方法不僅要掌握實(shí)驗(yàn)原理，還要掌握操作過程。）二苯胺法實(shí)驗(yàn)原理 脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595nm處有最大光吸收。DNA在40-400ug范圍內(nèi)，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應(yīng)。其他多數(shù)糖類，包括核糖在內(nèi)，一般無此反應(yīng)。紫外吸收法實(shí)驗(yàn)原理 DNA和RNA都有吸收紫外光的性質(zhì)，它們的吸收高峰在260nm波長處。吸收紫外光的性質(zhì)是嘌吟環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以嘌吟和嘧啶以及一切含有它們的物質(zhì)，不論是核甘、核甘酸或核酸都有吸收紫外光的特性10、質(zhì)粒DNA提?。ㄕ莆諏?shí)驗(yàn)原理，試劑的作用；什么叫做質(zhì)粒質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒有什么特點(diǎn)我們用堿裂解法，該法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；以及最后的實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)；PPT后的3個(gè)思考題。）二苯胺法實(shí)驗(yàn)原理 脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595nm處有最大光吸收。DNA在40-400ug范圍內(nèi)，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應(yīng)。其他多數(shù)糖類，包括核糖在內(nèi)，一般無此反應(yīng)。質(zhì)粒是一類存在于細(xì)菌和真菌細(xì)胞中具有自主復(fù)制能力的、共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的小型DNA分子。堿裂解法提取質(zhì)粒是實(shí)驗(yàn)室常用的方法這種方法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1、染色體外的小型DNA分子；2、共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu);3、自主復(fù)制。作用：1、外源DNA的載體2、保存基因3、表達(dá)蛋白用堿裂解法，該法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；溶液I：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成（保護(hù)、緩沖）①50mmol/L葡萄糖的作用是增加溶液的粘度（懸浮細(xì)胞）②25mmol/LEDTA的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子，防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用（保護(hù)作用）③10mmol/LTris-HCl使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）溶液H：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成（裂解、變性）①mol/LSDS：②1%NaOH（PH>12）：破壞細(xì)胞膜，裂解細(xì)胞注意：堿裂解的時(shí)間不要太長，以免基因組DNA斷裂成小片段。溶液HI：3mol/LHAc（）和3mol/LKAc組成的高鹽溶液（復(fù)性，分離）①HAc溶液能中和溶液H的堿性，使染色體DNA變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。②KAc會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽POD（十二烷基磺酸鉀），并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。PPT后的3個(gè)思考題。質(zhì)粒提取除了堿裂解法，還有其他什么方法各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)核酸提取過程中，除去雜蛋白的方法主要有哪幾種如果質(zhì)粒DNA中有蛋白質(zhì)殘留，如何判斷在提取過程中應(yīng)如何避免大分子DNA的降解和斷裂11、PCR技術(shù)（知道操作中加了哪些試劑試劑的作用是什么PCR的原理主要是3個(gè)步驟：變性，退火，延伸。過程是什么樣的PCR的特性。）（1）、過程：首先95℃預(yù)變性設(shè)置1min,1min后94℃30s進(jìn)入變性過程；然后是退火52℃30min；然后引物的延伸，72℃30s,從這開始循環(huán)，72℃10min,最后0℃保溫。（2）、試劑的作用是什么（一）DNA聚合酶TaqDNA聚合酶的用量為1?100ul,酶的濃度偏高，非特異性的產(chǎn)物將會(huì)增加，若酶的濃度偏低，側(cè)合成產(chǎn)物偏少。TaqDNA聚合酶可分為兩大類：1、具有校正功能的（有3'f5'核酸酶活性）比如：Vent,pfu,pwo等2、不具有校正功能的（無3'-5'核酸酶活性）比如：一般的TaqDNA聚合酶（二）模板核酸模板的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。（三）引物引物是待擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，它決定了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，引物的選擇是整個(gè)PCR反應(yīng)的關(guān)鍵，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性及成功與否。 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。（2）、PCR的原理主要是3個(gè)步驟：變性，退火，延伸。過程是什么樣的過程：首先95℃預(yù)變性設(shè)置1min,1min后94℃30s進(jìn)入變性過程；然后是退火52℃30min；然后引物的延伸，72℃30s，從這開始循環(huán)，72℃10min，最后0℃保溫1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；2、模板DNA與引物的退火：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；3、引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。（3）、PCR的特性1、特異性強(qiáng):PCR反應(yīng)的特異性決定因素為引物與模板DNA