酶聯(lián)免疫吸附實驗課件

酶聯(lián)免疫吸附實驗2022/12/19酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗2022/12/14酶聯(lián)免疫吸附實驗11.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。酶聯(lián)免疫吸附實驗1.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固2在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。酶聯(lián)免疫吸附實驗在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗3再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢

物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。酶聯(lián)免疫吸附實驗再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時4間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖）。酶聯(lián)免疫吸附實驗間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人5酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗6操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。酶聯(lián)免疫吸附實驗操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原73）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。

4）加底物顯色

酶聯(lián)免疫吸附實驗3）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶8本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

酶聯(lián)免疫吸附實驗本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)9間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)。

酶聯(lián)免疫吸附實驗間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取10抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?。酶?lián)免疫吸附實驗抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人11ELISA的試劑在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測定。ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。

酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA的試劑在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測定。酶聯(lián)12完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

（3）酶的底物；

（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；

（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）酶反應(yīng)終止液。酶聯(lián)免疫吸附實驗完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：酶聯(lián)免疫吸附實驗132.1免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程:酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8142.1.1固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。可作ELISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.1固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為15ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以16現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。酶聯(lián)免疫吸附實驗現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括17良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。

酶聯(lián)免疫吸附實驗良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，18常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每

孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分

別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的

平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。酶聯(lián)免疫吸附實驗常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml19為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項目的最合適的固相載體。酶聯(lián)免疫吸附實驗為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗202.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(21載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。酶聯(lián)免疫吸附實驗載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋22脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。抗心磷脂抗體的ELISA試劑一般采用這種包被方式。酶聯(lián)免疫吸附實驗脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶232.1.3包被用抗原

用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.3包被用抗原

用于包被固相載體的抗原按其來源24重組抗原

是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。

酶聯(lián)免疫吸附實驗重組抗原

是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌25合成多肽抗原合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。酶聯(lián)免疫吸附實驗合成多肽抗原酶聯(lián)免疫吸附實驗26應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。酶聯(lián)免疫吸附實驗應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白272.1.4包被用抗體

包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應(yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.4包被用抗體

包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和282.1.5包被的條件

包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認(rèn)為具有同等的包被效果。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.5包被的條件

包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度29包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。酶聯(lián)免疫吸附實驗包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料302.1.6封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.6封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用31脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高。酶聯(lián)免疫吸附實驗脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價廉，可以高濃度322.2結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤诮Y(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.2結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA332.2.1酶

用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。

在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.2.1酶

用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高342.3洗滌液

在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。2.4酶反應(yīng)終止液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式

ELISA中一般采用2mol/L。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.3洗滌液

在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.0352.5陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.5陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positi36ELISA的操作要點(diǎn)優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件!

酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA的操作要點(diǎn)優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證373.1標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.1標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測定的標(biāo)本十分38血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。酶聯(lián)免疫吸附實驗血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性H39混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。酶聯(lián)免疫吸附實驗混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融403.2試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.2試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的413.3加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.3加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本42有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。酶聯(lián)免疫吸附實驗有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)433.4保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.4保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加44溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度。酶聯(lián)免疫吸附實驗溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。453.5洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.5洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，46聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。酶聯(lián)免疫吸附實驗聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種47流水沖洗式洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。流水沖洗式洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。酶聯(lián)免疫吸附實驗流水沖洗式酶聯(lián)免疫吸附實驗483.6顯色和比色3.6.1顯色

顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.6顯色和比色酶聯(lián)免疫吸附實驗49在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時間一般不需要嚴(yán)格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。酶聯(lián)免疫吸附實驗在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定504.6.2比色

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。酶聯(lián)免疫吸附實驗4.6.2比色

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的51比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算。酶聯(lián)免疫吸附實驗比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液523.7結(jié)果判斷

定性的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的簡單回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。“陽性”表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)?！瓣幮浴眲t為無反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.7結(jié)果判斷

定性的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗53演講完畢，謝謝聽講!再見，seeyouagain3rew2022/12/19酶聯(lián)免疫吸附實驗演講完畢，謝謝聽講!再見，seeyouagain3rew54酶聯(lián)免疫吸附實驗2022/12/19酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗2022/12/14酶聯(lián)免疫吸附實驗551.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。酶聯(lián)免疫吸附實驗1.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固56在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。酶聯(lián)免疫吸附實驗在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗57再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢

物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。酶聯(lián)免疫吸附實驗再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時58間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖）。酶聯(lián)免疫吸附實驗間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人59酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗60操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。酶聯(lián)免疫吸附實驗操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原613）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。

4）加底物顯色

酶聯(lián)免疫吸附實驗3）加酶標(biāo)抗抗體。可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶62本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

酶聯(lián)免疫吸附實驗本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)63間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)。

酶聯(lián)免疫吸附實驗間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取64抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬蕉绊懓恍ЧＣ嘎?lián)免疫吸附實驗抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人65ELISA的試劑在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測定。ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。

酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA的試劑在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測定。酶聯(lián)66完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

（3）酶的底物；

（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；

（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）酶反應(yīng)終止液。酶聯(lián)免疫吸附實驗完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：酶聯(lián)免疫吸附實驗672.1免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程:酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8682.1.1固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.1固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為69ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以70現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。酶聯(lián)免疫吸附實驗現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括71良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。

酶聯(lián)免疫吸附實驗良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，72常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每

孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分

別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的

平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。酶聯(lián)免疫吸附實驗常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml73為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項目的最合適的固相載體。酶聯(lián)免疫吸附實驗為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗742.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(75載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。酶聯(lián)免疫吸附實驗載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋76脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。酶聯(lián)免疫吸附實驗脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶772.1.3包被用抗原

用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.3包被用抗原

用于包被固相載體的抗原按其來源78重組抗原

是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。

酶聯(lián)免疫吸附實驗重組抗原

是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌79合成多肽抗原合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。酶聯(lián)免疫吸附實驗合成多肽抗原酶聯(lián)免疫吸附實驗80應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。酶聯(lián)免疫吸附實驗應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白812.1.4包被用抗體

包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應(yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.4包被用抗體

包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和822.1.5包被的條件

包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認(rèn)為具有同等的包被效果。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.5包被的條件

包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度83包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。酶聯(lián)免疫吸附實驗包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料842.1.6封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.6封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用85脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高。酶聯(lián)免疫吸附實驗脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價廉，可以高濃度862.2結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤诮Y(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.2結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA872.2.1酶

用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。

在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.2.1酶

用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高882.3洗滌液

在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。2.4酶反應(yīng)終止液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式

ELISA中一般采用2mol/L。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.3洗滌液

在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.0892.5陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.5陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positi90ELISA的操作要點(diǎn)優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件!

酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA的操作要點(diǎn)優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證913.1標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.1標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測定的標(biāo)本十分92血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。酶聯(lián)免疫吸附實驗血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性H93混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。酶聯(lián)免疫吸附實驗混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融943.2試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.2試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的953.3加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.3加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本96有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加