酶聯(lián)免疫吸附實驗課件

酶聯(lián)免疫吸附實驗2022/12/19酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗2022/12/14酶聯(lián)免疫吸附實驗11.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。酶聯(lián)免疫吸附實驗1.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固2在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。酶聯(lián)免疫吸附實驗在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗3再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢

物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。酶聯(lián)免疫吸附實驗再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時4間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖）。酶聯(lián)免疫吸附實驗間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人5酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗6操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。酶聯(lián)免疫吸附實驗操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原73）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。

4）加底物顯色

酶聯(lián)免疫吸附實驗3）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶8本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

酶聯(lián)免疫吸附實驗本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)9間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)。

酶聯(lián)免疫吸附實驗間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取10抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?。酶?lián)免疫吸附實驗抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人11ELISA的試劑在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進行測定。ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。

酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA的試劑在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進行測定。酶聯(lián)12完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

（3）酶的底物；

（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；

（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）酶反應(yīng)終止液。酶聯(lián)免疫吸附實驗完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：酶聯(lián)免疫吸附實驗132.1免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程:酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8142.1.1固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.1固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為15ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標(biāo)本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以16現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。酶聯(lián)免疫吸附實驗現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括17良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。

酶聯(lián)免疫吸附實驗良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，18常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每

孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分

別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的

平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。酶聯(lián)免疫吸附實驗常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml19為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項目的最合適的固相載體。酶聯(lián)免疫吸附實驗為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗202.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(21載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。酶聯(lián)免疫吸附實驗載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋22脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。抗心磷脂抗體的ELISA試劑一般采用這種包被方式。酶聯(lián)免疫吸附實驗脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶232.1.3包被用抗原

用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.3包被用抗原

用于包被固相載體的抗原按其來源24重組抗原

是抗原基因在質(zhì)粒體中表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。

酶聯(lián)免疫吸附實驗重組抗原

是抗原基因在質(zhì)粒體中表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌25合成多肽抗原合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。酶聯(lián)免疫吸附實驗合成多肽抗原酶聯(lián)免疫吸附實驗26應(yīng)用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進行包被可引起其他抗體的漏檢。酶聯(lián)免疫吸附實驗應(yīng)用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白272.1.4包被用抗體

包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液?？寡宀荒苤苯佑糜诎唬瑧?yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.4包被用抗體

包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和282.1.5包被的條件

包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.5包被的條件

包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度29包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。酶聯(lián)免疫吸附實驗包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料302.1.6封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.6封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用31脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高。酶聯(lián)免疫吸附實驗脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度322.2結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.2結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA332.2.1酶

用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。

在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.2.1酶

用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高342.3洗滌液

在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。2.4酶反應(yīng)終止液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式

ELISA中一般采用2mol/L。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.3洗滌液

在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.0352.5陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.5陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positi36ELISA的操作要點優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件!

酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA的操作要點優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證373.1標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.1標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測定的標(biāo)本十分38血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。酶聯(lián)免疫吸附實驗血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性H39混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。酶聯(lián)免疫吸附實驗混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融403.2試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.2試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的413.3加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.3加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本42有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。酶聯(lián)免疫吸附實驗有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)433.4保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.4保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加44溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達頂峰。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。酶聯(lián)免疫吸附實驗溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。453.5洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.5洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，46聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。酶聯(lián)免疫吸附實驗聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種47流水沖洗式洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。流水沖洗式洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。酶聯(lián)免疫吸附實驗流水沖洗式酶聯(lián)免疫吸附實驗483.6顯色和比色3.6.1顯色

顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.6顯色和比色酶聯(lián)免疫吸附實驗49在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴(yán)格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。酶聯(lián)免疫吸附實驗在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定504.6.2比色

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。酶聯(lián)免疫吸附實驗4.6.2比色

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的51比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。酶聯(lián)免疫吸附實驗比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液523.7結(jié)果判斷

定性的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的簡單回答，分別用“陽性”、“陰性”表示?！瓣栃浴北硎驹摌?biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)?！瓣幮浴眲t為無反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.7結(jié)果判斷

定性的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗53演講完畢，謝謝聽講!再見，seeyouagain3rew2022/12/19酶聯(lián)免疫吸附實驗演講完畢，謝謝聽講!再見，seeyouagain3rew54酶聯(lián)免疫吸附實驗2022/12/19酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗2022/12/14酶聯(lián)免疫吸附實驗551.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。酶聯(lián)免疫吸附實驗1.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固56在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。酶聯(lián)免疫吸附實驗在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗57再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢

物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。酶聯(lián)免疫吸附實驗再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時58間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖）。酶聯(lián)免疫吸附實驗間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人59酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗60操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。酶聯(lián)免疫吸附實驗操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原613）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。

4）加底物顯色

酶聯(lián)免疫吸附實驗3）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶62本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

酶聯(lián)免疫吸附實驗本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)63間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)。

酶聯(lián)免疫吸附實驗間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取64抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?。酶?lián)免疫吸附實驗抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人65ELISA的試劑在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進行測定。ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。

酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA的試劑在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進行測定。酶聯(lián)66完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

（3）酶的底物；

（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；

（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）酶反應(yīng)終止液。酶聯(lián)免疫吸附實驗完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：酶聯(lián)免疫吸附實驗672.1免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程:酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8682.1.1固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.1固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為69ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標(biāo)本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以70現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。酶聯(lián)免疫吸附實驗現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括71良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。

酶聯(lián)免疫吸附實驗良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，72常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每

孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分

別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的

平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。酶聯(lián)免疫吸附實驗常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml73為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項目的最合適的固相載體。酶聯(lián)免疫吸附實驗為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗742.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(75載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。酶聯(lián)免疫吸附實驗載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋76脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。酶聯(lián)免疫吸附實驗脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶772.1.3包被用抗原

用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.3包被用抗原

用于包被固相載體的抗原按其來源78重組抗原

是抗原基因在質(zhì)粒體中表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。

酶聯(lián)免疫吸附實驗重組抗原

是抗原基因在質(zhì)粒體中表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌79合成多肽抗原合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。酶聯(lián)免疫吸附實驗合成多肽抗原酶聯(lián)免疫吸附實驗80應(yīng)用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進行包被可引起其他抗體的漏檢。酶聯(lián)免疫吸附實驗應(yīng)用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白812.1.4包被用抗體

包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液?？寡宀荒苤苯佑糜诎唬瑧?yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.4包被用抗體

包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和822.1.5包被的條件

包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.5包被的條件

包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度83包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。酶聯(lián)免疫吸附實驗包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料842.1.6封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.1.6封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用85脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高。酶聯(lián)免疫吸附實驗脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度862.2結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.2結(jié)合物

結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA872.2.1酶

用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。

在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.2.1酶

用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高882.3洗滌液

在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。2.4酶反應(yīng)終止液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式

ELISA中一般采用2mol/L。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.3洗滌液

在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.0892.5陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。酶聯(lián)免疫吸附實驗2.5陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positi90ELISA的操作要點優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件!

酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA的操作要點優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證913.1標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.1標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測定的標(biāo)本十分92血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。酶聯(lián)免疫吸附實驗血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性H93混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。酶聯(lián)免疫吸附實驗混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融943.2試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.2試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的953.3加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。酶聯(lián)免疫吸附實驗3.3加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本96有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加