病毒宏基因組學(xué)-課件

2022/12/19讀書(shū)報(bào)告匯報(bào)人：李小陽(yáng)2103年1月4日2022/12/18讀書(shū)報(bào)告匯報(bào)人：李小陽(yáng)2103年1月4日病毒宏基因組學(xué)概述及其應(yīng)用研究背景宏基因組學(xué)簡(jiǎn)介病毒宏基因組學(xué)研究策略與技術(shù)路線研究成果與前景展望HereWeGo！病毒宏基因組學(xué)概述及其應(yīng)用研究背景宏基因組學(xué)簡(jiǎn)介病毒宏基因組2022/12/19一大難題virusAvirusBvirusCBACTERIAvirusD在人類生產(chǎn)生活中，致病的微生物眾多，其中病毒性疾病占據(jù)大多數(shù)，而現(xiàn)有的診斷方法不可能囊括所有的病毒。因此，從宏觀上把握致病性病毒的潛在數(shù)量種類以及致病機(jī)理變得尤為重要。2022/12/18一大難題virusAvirusBvi2022/12/19案例1：Electronmicrographsofthehumanfecalsample.(a)Rod-shapedparticlesnegativelystainedwithpotassiumphosphotungstatein2003.(b)Icosahedral(openarrows)andshortrod-shapedparticles(filledarrow)recentlystainedwithammoniummolybdate,fromthesecondfractionofthesucrosegradient.Scalebars=50nm.2013年6月巴西圣保羅阿道夫?魯茨研究所的西爾瓦娜等人利用病毒宏基因組學(xué)對(duì)人面部潛在微生物進(jìn)行研究。案例2：2002年Breitbart應(yīng)用鳥(niǎo)槍測(cè)序法（shotgunsequencing）首次對(duì)美國(guó)加州海岸的2處海洋中病毒群體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)374-7114個(gè)潛在的新病毒。遺憾的是無(wú)法對(duì)其進(jìn)行歸類。兩個(gè)案例2022/12/18案例1：Electronmicrogr病毒宏基因組學(xué)何以橫空出世四大瓶頸很多病毒缺乏特異的細(xì)胞系或者生長(zhǎng)過(guò)程中觀察不到細(xì)胞病變(CPE)。用電鏡來(lái)觀察病毒其靈敏性相對(duì)較低。血清學(xué)反應(yīng)，高效的特異性抗體很難獲得，有的出現(xiàn)交叉反應(yīng)而影響結(jié)果。PCR法必須基于基因序列，對(duì)于未知序列的病毒和變異性大的病毒此法難以實(shí)施。病毒宏基因組學(xué)何以橫空出世四大瓶頸很多病毒缺乏特異的細(xì)胞系或宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)研究的對(duì)象是特定環(huán)境下所有生物遺傳物質(zhì)的總和，它包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因總和。研究熱點(diǎn)：細(xì)菌和病毒宏基因組學(xué)。宏基因組學(xué)(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個(gè)整體,自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關(guān)系。宏基因組學(xué)(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個(gè)整體,自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關(guān)系。宏基因組學(xué)宏基因組學(xué)研究的對(duì)象是特定環(huán)境下所有生物遺傳物2022/12/19病毒宏基因組學(xué)病毒宏基因組學(xué)：宏基因組學(xué)的一分支，指研究特定環(huán)境中的病毒群落一門學(xué)科。應(yīng)用解釋未知病因挖掘新的活性物質(zhì)分析特定環(huán)境中的病毒群落發(fā)掘潛在的新的病毒性疾病2022/12/18病毒宏基因組學(xué)病毒宏基因組學(xué)：宏基因組學(xué)病毒宏基因組學(xué)2005年,Edwards首次提到病毒宏基因組學(xué)這一概念，其描述的是環(huán)境中的病毒群落—噬菌體。2007年,Delwart再次提到病毒宏基因組學(xué)這一概念,并對(duì)宏基因組學(xué)挖掘新病毒的方法進(jìn)行了闡述；該文側(cè)重于人和動(dòng)物機(jī)體中的真核病毒群落。最早應(yīng)用宏基因組學(xué)理論分析病毒群落的科學(xué)家是Breitbart教授，他于2002年應(yīng)用鳥(niǎo)槍測(cè)序法（shotgunsequencing）首次對(duì)美國(guó)加州海岸的2處海洋中病毒群體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)374-7114個(gè)潛在的新病毒。2006年，Zhang等應(yīng)用宏基因組學(xué)在人的糞便中發(fā)現(xiàn)了大量的植物病毒。2010年，Li等分析了蝙蝠糞便中的病毒群落。該研究發(fā)現(xiàn)了大量新的哺乳動(dòng)物病毒和昆蟲(chóng)病毒。病毒宏基因組學(xué)2005年,Edwards首次提到病2022/12/19研究策略與技術(shù)路線樣品的處理遺傳物質(zhì)的分離與富集構(gòu)建文庫(kù)宏基因組學(xué)文庫(kù)的篩選序列分析2022/12/18研究策略與技術(shù)路線樣品的處理遺傳物質(zhì)的分2022/12/19研究策略與技術(shù)路線解凍稀釋離心過(guò)濾消化樣品的處理VIS:VeryImportantStep2022/12/18研究策略與技術(shù)路線解凍稀釋離心過(guò)濾消化樣2022/12/19研究策略與技術(shù)路線PCR產(chǎn)物的純化PCR擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄雙鏈cDNA合成DNARNA遺傳物質(zhì)的分離與富集2022/12/18研究策略與技術(shù)路線PCR產(chǎn)物的純化PC2022/12/19研究策略與技術(shù)路線文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)基因組cDNA文庫(kù)：cDNA文庫(kù)中的外源DNA片段，是互補(bǔ)DNA。cDNA是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的雙鏈cDNA。基因組DNA文庫(kù)：將生物體的全部基因組用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段，與合適載體體外轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞所獲得的陽(yáng)性菌落。基因文庫(kù)：某個(gè)生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外通過(guò)重組后，轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，并通過(guò)一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽(yáng)性菌落(或噬菌體),所有的菌落或噬菌體的集合。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線文庫(kù)的構(gòu)建基因組部分基2022/12/19基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的關(guān)系文庫(kù)的構(gòu)建2022/12/18基因組文文庫(kù)的構(gòu)建2022/12/19研究策略與技術(shù)路線文庫(kù)的構(gòu)建根據(jù)宏基因組學(xué)文庫(kù)篩選方法和研究目的的不同，構(gòu)建宏基因組學(xué)文庫(kù)的載體和方法也各有不同。構(gòu)建的宏基因組學(xué)文庫(kù)分為載體克隆文庫(kù)和基于新一代測(cè)序技術(shù)的加接頭的文庫(kù)。常用構(gòu)建文庫(kù)的載體為：大片段插入載體[細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC）和粘粒（coamid）載體]、表達(dá)載體(pBluescriptSK+)、穿梭載體(CosmidpOS700Ⅰ)及普通克隆T載體。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線文根據(jù)宏基因組學(xué)文庫(kù)篩2022/12/19研究策略與技術(shù)路線①載體的制備。②高純度大分子量基因組DNA的提取。③高質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量DNA的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離。④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞。⑤重組克隆的挑取和保存?；蚪MDNA文庫(kù)的構(gòu)建程序：連接轉(zhuǎn)化篩選陽(yáng)性克隆2022/12/18研究策略與技術(shù)路線①載體的制備?；蚪M2022/12/19研究策略與技術(shù)路線連接目的基因載體載體的種類可裝載的外源DNA質(zhì)粒（plasmid）＜10kbλ噬菌體（λ

phage）0-23kb粘粒載體（cosmid）~45kb細(xì)菌人工染色體BAC~100kb酵母人工染色體YAC~300kb-1.2Mb

雖然載體種類眾多，但基于研究的目的基因大小以及相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，質(zhì)粒載體和BAC的選用較為頻繁。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線連接目的基因載體載體的2022/12/19研究策略與技術(shù)路線宿主選擇----常用的宿主主要有大腸埃希菌以及鏈霉菌屬或假單胞菌屬。轉(zhuǎn)化宿主DH5αE.Coli陽(yáng)性克隆的篩選涂布氨芐抗性平板37℃倒置培養(yǎng)菌液PCRAGE測(cè)序與序列分析：選取大小不等的片段測(cè)序，分析測(cè)序的結(jié)果質(zhì)量，將測(cè)序波峰良好的序列進(jìn)行載體和引物的去除及拼接。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，應(yīng)用blastn和blastx工具，分別進(jìn)行核苷酸序列和6框架閱讀翻譯的氨基酸序列比對(duì)。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線宿主選擇----常用的2022/12/19研究策略與技術(shù)路線基因組cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：

第一，細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；第二，第一鏈cDNA合成；第三，第二鏈cDNA合成；第四，雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體，并導(dǎo)入宿主中增殖。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線基因組cDNA文庫(kù)的2022/12/19總RNAOligo(dt)纖維素柱或磁珠分離5'AAAAOligo(dt)+reversetranscriptasemRNA5'AAAADNA3'TTTTRNaseH5'AAAADNAploymeraseDANligase3'TTTTTdT加尾5'AAAA3'3'TTTT5'5'AAAACCCCCCCC5'第一步：mRNA的分離。第二步：第一條cDNA鏈的合成。第三步：第二條cDNA鏈的合成。第四步：克隆雙鏈cDNA至載體并導(dǎo)入E.coli2022/12/18總RNAOligo(dt)纖維素柱或2022/12/19研究策略與技術(shù)路線篩選宏基因組學(xué)文庫(kù)的技術(shù)功能性篩選法底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法穩(wěn)定性同位素技術(shù)篩選法熒光原位雜交技術(shù)法能有效的篩選到具有活性的物質(zhì)和新型抗生素。受限于表達(dá)型的宿主菌株、工作量大及效率低。直接測(cè)序法序列拼接--拼接的contigs或者單序列通過(guò)不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核苷酸和氨基酸的比對(duì)--篩選有用的目的信息。羅氏公司454焦磷酸測(cè)序技術(shù)和Illumina公司推出的Solexa測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序2022/12/18研究策略與技術(shù)路線篩選宏基因組學(xué)文庫(kù)的技2022/12/19研究成果與前景展望在我國(guó)腹瀉兒童糞便中首次發(fā)現(xiàn)HBoV2、HPeV、Aichivirus、Klassevirus/salivirus和Humancosavirus等新發(fā)病毒（單同領(lǐng)，2011）。在美國(guó)豬群中發(fā)現(xiàn)了kubovirus,sapovirus,sapelvirus,豬腸道病毒9和豬腸道病毒10，星狀病毒，Teschovirus，PBoV3,環(huán)病毒，新的微小核酸RNA病毒等。其中星狀病毒和PBoV3為新的種；環(huán)病毒、Rosavirus1和Rosavirus1可能為的新的病毒屬或者新的病毒科（單同領(lǐng)，2011）。對(duì)患有腸道病毒性腸炎的火雞群，進(jìn)行病毒宏基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了大量的呼腸孤病毒、?。遥危敛《?、星狀病毒等，系統(tǒng)描述了多種病毒共同感染火雞，導(dǎo)致火雞生產(chǎn)性能降低的可能性（Day，2010）。對(duì)采集北美的蝙蝠糞便進(jìn)行病毒組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蝙蝠體內(nèi)攜帶的病毒種類十分豐富，不僅含有大量的動(dòng)物病毒，而且還有植物和昆蟲(chóng)病毒（Li，Donaldson，2010）。應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析我國(guó)腹瀉仔豬糞便內(nèi)的病毒群落，初步鑒定出此次腹瀉的主要病因?yàn)樽儺怭EDV；分離和鑒定1株變異PEDV（JS-2013），其可作為研發(fā)疫苗的候選毒株（單同領(lǐng)，童光志，2013）。2022/12/18研究成果與前景展望在我國(guó)腹瀉兒童糞便中首前景展望前景展望面臨的挑戰(zhàn)運(yùn)用病毒宏基因組學(xué)，已經(jīng)成功地從多種環(huán)境樣品中鑒定出多種病毒，使人們了解到不同環(huán)境的病毒構(gòu)成，從而更科學(xué)地防制病毒的侵染。描繪出一些中間宿主的病毒攜帶情況，這不僅豐富了病毒庫(kù)，而且增加了對(duì)病毒多樣性和分布的了解。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)一些致病性病毒和潛在致病性病毒的變化情況，并且有助于診斷一些新發(fā)的或尚不明病原體的疾病，還可以快速地偵檢突發(fā)病毒性公共衛(wèi)生事件。過(guò)濾技術(shù)高通量測(cè)序法病毒宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)前景展望前景展望面臨的挑戰(zhàn)運(yùn)用病毒宏基因組學(xué)，1繼續(xù)進(jìn)行副豬嗜血桿菌TbpA基因的原核表達(dá)與蛋白純化2學(xué)習(xí)高級(jí)生物化學(xué)、分子生物學(xué)、PCR技術(shù)和DNAstar軟件。3閱讀與病毒宏基因組相關(guān)的文獻(xiàn)學(xué)習(xí)計(jì)劃1繼續(xù)進(jìn)行副豬嗜血桿菌TbpA基因的原核表達(dá)與蛋白純化2學(xué)習(xí)2022/12/19謝謝大家！請(qǐng)大家批評(píng)指正！2022/12/18謝謝大家！2022/12/19讀書(shū)報(bào)告匯報(bào)人：李小陽(yáng)2103年1月4日2022/12/18讀書(shū)報(bào)告匯報(bào)人：李小陽(yáng)2103年1月4日病毒宏基因組學(xué)概述及其應(yīng)用研究背景宏基因組學(xué)簡(jiǎn)介病毒宏基因組學(xué)研究策略與技術(shù)路線研究成果與前景展望HereWeGo！病毒宏基因組學(xué)概述及其應(yīng)用研究背景宏基因組學(xué)簡(jiǎn)介病毒宏基因組2022/12/19一大難題virusAvirusBvirusCBACTERIAvirusD在人類生產(chǎn)生活中，致病的微生物眾多，其中病毒性疾病占據(jù)大多數(shù)，而現(xiàn)有的診斷方法不可能囊括所有的病毒。因此，從宏觀上把握致病性病毒的潛在數(shù)量種類以及致病機(jī)理變得尤為重要。2022/12/18一大難題virusAvirusBvi2022/12/19案例1：Electronmicrographsofthehumanfecalsample.(a)Rod-shapedparticlesnegativelystainedwithpotassiumphosphotungstatein2003.(b)Icosahedral(openarrows)andshortrod-shapedparticles(filledarrow)recentlystainedwithammoniummolybdate,fromthesecondfractionofthesucrosegradient.Scalebars=50nm.2013年6月巴西圣保羅阿道夫?魯茨研究所的西爾瓦娜等人利用病毒宏基因組學(xué)對(duì)人面部潛在微生物進(jìn)行研究。案例2：2002年Breitbart應(yīng)用鳥(niǎo)槍測(cè)序法（shotgunsequencing）首次對(duì)美國(guó)加州海岸的2處海洋中病毒群體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)374-7114個(gè)潛在的新病毒。遺憾的是無(wú)法對(duì)其進(jìn)行歸類。兩個(gè)案例2022/12/18案例1：Electronmicrogr病毒宏基因組學(xué)何以橫空出世四大瓶頸很多病毒缺乏特異的細(xì)胞系或者生長(zhǎng)過(guò)程中觀察不到細(xì)胞病變(CPE)。用電鏡來(lái)觀察病毒其靈敏性相對(duì)較低。血清學(xué)反應(yīng)，高效的特異性抗體很難獲得，有的出現(xiàn)交叉反應(yīng)而影響結(jié)果。PCR法必須基于基因序列，對(duì)于未知序列的病毒和變異性大的病毒此法難以實(shí)施。病毒宏基因組學(xué)何以橫空出世四大瓶頸很多病毒缺乏特異的細(xì)胞系或宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)研究的對(duì)象是特定環(huán)境下所有生物遺傳物質(zhì)的總和，它包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因總和。研究熱點(diǎn)：細(xì)菌和病毒宏基因組學(xué)。宏基因組學(xué)(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個(gè)整體,自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關(guān)系。宏基因組學(xué)(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個(gè)整體,自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關(guān)系。宏基因組學(xué)宏基因組學(xué)研究的對(duì)象是特定環(huán)境下所有生物遺傳物2022/12/19病毒宏基因組學(xué)病毒宏基因組學(xué)：宏基因組學(xué)的一分支，指研究特定環(huán)境中的病毒群落一門學(xué)科。應(yīng)用解釋未知病因挖掘新的活性物質(zhì)分析特定環(huán)境中的病毒群落發(fā)掘潛在的新的病毒性疾病2022/12/18病毒宏基因組學(xué)病毒宏基因組學(xué)：宏基因組學(xué)病毒宏基因組學(xué)2005年,Edwards首次提到病毒宏基因組學(xué)這一概念，其描述的是環(huán)境中的病毒群落—噬菌體。2007年,Delwart再次提到病毒宏基因組學(xué)這一概念,并對(duì)宏基因組學(xué)挖掘新病毒的方法進(jìn)行了闡述；該文側(cè)重于人和動(dòng)物機(jī)體中的真核病毒群落。最早應(yīng)用宏基因組學(xué)理論分析病毒群落的科學(xué)家是Breitbart教授，他于2002年應(yīng)用鳥(niǎo)槍測(cè)序法（shotgunsequencing）首次對(duì)美國(guó)加州海岸的2處海洋中病毒群體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)374-7114個(gè)潛在的新病毒。2006年，Zhang等應(yīng)用宏基因組學(xué)在人的糞便中發(fā)現(xiàn)了大量的植物病毒。2010年，Li等分析了蝙蝠糞便中的病毒群落。該研究發(fā)現(xiàn)了大量新的哺乳動(dòng)物病毒和昆蟲(chóng)病毒。病毒宏基因組學(xué)2005年,Edwards首次提到病2022/12/19研究策略與技術(shù)路線樣品的處理遺傳物質(zhì)的分離與富集構(gòu)建文庫(kù)宏基因組學(xué)文庫(kù)的篩選序列分析2022/12/18研究策略與技術(shù)路線樣品的處理遺傳物質(zhì)的分2022/12/19研究策略與技術(shù)路線解凍稀釋離心過(guò)濾消化樣品的處理VIS:VeryImportantStep2022/12/18研究策略與技術(shù)路線解凍稀釋離心過(guò)濾消化樣2022/12/19研究策略與技術(shù)路線PCR產(chǎn)物的純化PCR擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄雙鏈cDNA合成DNARNA遺傳物質(zhì)的分離與富集2022/12/18研究策略與技術(shù)路線PCR產(chǎn)物的純化PC2022/12/19研究策略與技術(shù)路線文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)基因組cDNA文庫(kù)：cDNA文庫(kù)中的外源DNA片段，是互補(bǔ)DNA。cDNA是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的雙鏈cDNA?；蚪MDNA文庫(kù)：將生物體的全部基因組用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段，與合適載體體外轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞所獲得的陽(yáng)性菌落?；蛭膸?kù)：某個(gè)生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外通過(guò)重組后，轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，并通過(guò)一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽(yáng)性菌落(或噬菌體),所有的菌落或噬菌體的集合。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線文庫(kù)的構(gòu)建基因組部分基2022/12/19基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的關(guān)系文庫(kù)的構(gòu)建2022/12/18基因組文文庫(kù)的構(gòu)建2022/12/19研究策略與技術(shù)路線文庫(kù)的構(gòu)建根據(jù)宏基因組學(xué)文庫(kù)篩選方法和研究目的的不同，構(gòu)建宏基因組學(xué)文庫(kù)的載體和方法也各有不同。構(gòu)建的宏基因組學(xué)文庫(kù)分為載體克隆文庫(kù)和基于新一代測(cè)序技術(shù)的加接頭的文庫(kù)。常用構(gòu)建文庫(kù)的載體為：大片段插入載體[細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC）和粘粒（coamid）載體]、表達(dá)載體(pBluescriptSK+)、穿梭載體(CosmidpOS700Ⅰ)及普通克隆T載體。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線文根據(jù)宏基因組學(xué)文庫(kù)篩2022/12/19研究策略與技術(shù)路線①載體的制備。②高純度大分子量基因組DNA的提取。③高質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量DNA的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離。④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞。⑤重組克隆的挑取和保存。基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建程序：連接轉(zhuǎn)化篩選陽(yáng)性克隆2022/12/18研究策略與技術(shù)路線①載體的制備。基因組2022/12/19研究策略與技術(shù)路線連接目的基因載體載體的種類可裝載的外源DNA質(zhì)粒（plasmid）＜10kbλ噬菌體（λ

phage）0-23kb粘粒載體（cosmid）~45kb細(xì)菌人工染色體BAC~100kb酵母人工染色體YAC~300kb-1.2Mb

雖然載體種類眾多，但基于研究的目的基因大小以及相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，質(zhì)粒載體和BAC的選用較為頻繁。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線連接目的基因載體載體的2022/12/19研究策略與技術(shù)路線宿主選擇----常用的宿主主要有大腸埃希菌以及鏈霉菌屬或假單胞菌屬。轉(zhuǎn)化宿主DH5αE.Coli陽(yáng)性克隆的篩選涂布氨芐抗性平板37℃倒置培養(yǎng)菌液PCRAGE測(cè)序與序列分析：選取大小不等的片段測(cè)序，分析測(cè)序的結(jié)果質(zhì)量，將測(cè)序波峰良好的序列進(jìn)行載體和引物的去除及拼接。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，應(yīng)用blastn和blastx工具，分別進(jìn)行核苷酸序列和6框架閱讀翻譯的氨基酸序列比對(duì)。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線宿主選擇----常用的2022/12/19研究策略與技術(shù)路線基因組cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：

第一，細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；第二，第一鏈cDNA合成；第三，第二鏈cDNA合成；第四，雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體，并導(dǎo)入宿主中增殖。2022/12/18研究策略與技術(shù)路線基因組cDNA文庫(kù)的2022/12/19總RNAOligo(dt)纖維素柱或磁珠分離5'AAAAOligo(dt)+reversetranscriptasemRNA5'AAAADNA3'TTTTRNaseH5'AAAADNAploymeraseDANligase3'TTTTTdT加尾5'AAAA3'3'TTTT5'5'AAAACCCCCCCC5'第一步：mRNA的分離。第二步：第一條cDNA鏈的合成。第三步：第二條cDNA鏈的合成。第四步：克隆雙鏈cDNA至載體并導(dǎo)入E.coli2022/12/18總RNAOligo(dt)纖維素柱或2022/12/19研究策略與技術(shù)路線篩選宏基因組學(xué)文庫(kù)的技術(shù)功能性篩選法底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法穩(wěn)定性同位素技術(shù)篩選法熒光原位雜交技術(shù)法能有效的篩選到具有活性的物質(zhì)和新型抗生素。受限于表達(dá)型的宿主菌株、工作量大及效率低。直接測(cè)序法序列拼接--拼接的contigs或者單序列通過(guò)不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核苷酸和氨基酸的比對(duì)--篩選有用的目的信息。羅氏公司454焦磷酸測(cè)序技術(shù)和Illumina公司推出的Solexa測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序2022/12/18研究策略與技術(shù)路線篩選宏基因組學(xué)文庫(kù)的技2