外周血單個核細胞分離課件

外周血單個核細胞的分離及活力測定IsolationandstorageofPBMCandviabilitytest實驗原理人外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞。單個核細胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細胞不同。因此利用一種介于1.075-1.090之間的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細胞在分離液中呈梯度分布,從而分離出PBMC。人血液中各種細胞的密度如下：紅細胞：1.093白細胞：1.092淋巴細胞和單核細胞：1.075-1.090血小板：1.030-1.035F/H=1.077±0.001血小板⒈簡述補體的概念、分泌細胞及激活途徑。⒉簡述補體的經(jīng)典激活途徑的具體過程。⒊補體結(jié)合反應(yīng)為什么需分兩階段進行？如果將幾種成分反應(yīng)順序顛倒，結(jié)果會如何？⒋參加補體結(jié)合反應(yīng)的各已知成分，為什么須預(yù)先滴定？試驗中所設(shè)計的四種對照管有何意義？用毛細吸管輕輕插入灰白色層，沿管壁輕輕吸出該層的單個核細胞，盛入另一支離心管中。將所得到的PBMC懸液用5倍體積的Hanks液或RPMI-l640洗滌2次，1500rpm5min。臺盼藍染色測定細胞存活率臺盼藍（trypanblue）染色法是測定細胞活力的最簡便的方法。臺盼藍又稱錐藍，是一種陰離子型染料，它不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，但死亡細胞的細胞膜通透性增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內(nèi)，使死細胞著色呈藍色。細胞存活率(%)＝無色細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%計數(shù)200個細胞，一般活性應(yīng)在95％以上E玫瑰花環(huán)試驗

Erythrocyterosetteformationtest原理TcellsSRBCE-rosetteE玫瑰花環(huán)試驗高倍鏡下計數(shù)200個以上的淋巴細胞中花環(huán)形成細胞的百分數(shù)。凡能結(jié)合三個以上SRBC者為花環(huán)形成細胞。正常值：60-80%淋巴細胞功能檢測—淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗Detectionoflymphocytefunction：lymphocytetransformationtest原理指體外培養(yǎng)的淋巴細胞與特異性抗原或非特異性促有絲分裂物質(zhì)如植物血凝素（PHA）等接觸后發(fā)生胚變（或返祖）現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞的一種方法。淋巴細胞在抗原或促有絲分裂原的刺激下淋巴細胞的DNA合成而分裂增殖，并在細胞形態(tài)上也向母細胞轉(zhuǎn)化，因此通過形態(tài)學(xué)觀察或同位素摻入法可測得細胞分裂