srRNA基因技術(shù)在油藏微生物研究的應(yīng)用研究背景

厭氧微生物的研究方法與技術(shù)單擊此處添加標題文字市政工程：16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物研究的應(yīng)用分子生態(tài)學研究方法234目錄：

傳統(tǒng)研究方法厭氧微生物介紹11.厭氧微生物的定義：厭氧微生物尚無公認的確切定義，但通常認為這是一類只能在低氧分壓的條件下生長，而不能在空氣（18%氧氣）和（或）10％二氧化碳濃度下的固體培養(yǎng)基表面生長的微生物。第一章、厭氧微生物介紹嚴格厭氧微生物：氧氣對其有毒性厭氧微生物兼性厭氧微生物：有氧無氧條件下都可生存。第一章、厭氧微生物介紹2.幾種厭氧微生物的圖片：1.厭氧微生物研究方法背景：

厭氧微生物是整個微生物世界的一個重要組成部分。但由于厭氧微生物難于培養(yǎng)其相關(guān)的技術(shù)一直未得到很好的開發(fā)利用，但隨著近二十多年隨著厭氧操作技術(shù)的不斷完善，厭氧微生物研究方法的不斷改進，尤其近十多年來許多新技術(shù)和方法的應(yīng)用，致使厭氧微生物學取得很大的進展，獲得了豐碩的成果。第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2、常見的幾種傳統(tǒng)研究技術(shù)與方法：

第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法一般厭氧技術(shù)嚴格厭氧技術(shù)厭氧微生物傳統(tǒng)研究技術(shù)與方法其他厭氧技術(shù)第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.1一般厭氧技術(shù)：厭氧袋厭氧罐一般厭氧技術(shù)第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.1.1厭氧袋技術(shù)：根據(jù)氫“燃燒”除氧的原理所設(shè)計的一種簡易厭氧袋，不但適用于培養(yǎng)各種臨床標本中的厭氧菌，也適合培養(yǎng)其他專性厭氧菌。第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.1.1.1厭氧袋技術(shù)原理：利用氫硼化鈉(NaBH4)或氫硼化鉀(KBH4)與水反應(yīng)產(chǎn)生氫，氫與密封袋中的氧氣在把催化下結(jié)合成水，從而建立起無氧小環(huán)境。1厭氧袋中二氧化碳由下列反應(yīng)提供:檸檬酸+3NaH003一檸檬酸鈉+3H2O+3CO22利用美藍的變色反應(yīng)作為厭氧度的指示劑。厭氧環(huán)境則指示劑呈無色，有O2則變?yōu)樗{色。也有用刃天青指示劑。3第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.1.2厭氧罐技術(shù)：厭氧罐的商品名為Jar，一種小型的培養(yǎng)厭氧菌的密封容器。國外的名牌有“Gaspak”、“Tobal”、“BTL”、“Donwhitley”等厭氧罐。使厭氧罐達到無氧狀態(tài)有多種方法，例如，用抽氣換氣法以氮或二氧化碳驅(qū)除罐內(nèi)氧氣;在各種不同的除氧方法中，獲得最迅速發(fā)展和廣泛使用的是利用含把(或鉑)的常溫催化劑使氫與氧發(fā)生“燃燒”以達到除氧的方法。第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.1.2.1厭氧罐技術(shù)構(gòu)造：罐體目前最廣泛使用的厭氧罐體都是采用透明的聚碳酸醋硬質(zhì)塑料制成。常見的規(guī)格是內(nèi)徑為15Cm，高25cm的圓筒形罐體，其內(nèi)可放直徑gcm培養(yǎng)皿10只;在蓋的下方中央，旋連著一個金屬絲網(wǎng)盒，用于存放活化的鈀粒H2和CO2的供應(yīng)厭氧罐供氫和CO2有內(nèi)源法和外源法兩種。內(nèi)源法相似于厭氧袋。外源法抽氣換氣程序為:抽氣-換氣一再抽氣一充N2一CO2一H2催化劑和厭氧指示劑一般用常溫下即可起催化的“冷式”催化劑，如“鈀?！钡?，它是由含鈀的石棉等填充料加工而成的。每次使用前，把催化劑都應(yīng)在140一160℃烘箱內(nèi)烘2h活化。指示劑為美藍。第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.1.2.2厭氧罐技術(shù)優(yōu)缺點：缺點：優(yōu)點：1、沒有厭氧分離操作系統(tǒng)。2、對厭氧菌進行恒溫厭氧培養(yǎng)時，要將厭氧罐放置到另一個恒溫培養(yǎng)箱(不如BugBox等厭氧工作站方便，能二者兼顧)。3、對厭氧菌培養(yǎng)的好壞不易觀察。4、因為將密封系統(tǒng)啟開取出觀察，勢必造成厭氧環(huán)境被破壞。1、目前已廣泛使用在醫(yī)院啤酒廠等場所。2、輕便、簡單。3、與厭氧袋對比，某些厭氧罐法也采用外源H2和CO2，相對而言方便、省時，易操作。第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.2嚴格厭氧技術(shù)：有區(qū)別于一般厭氧技術(shù)，為了培養(yǎng)嚴格厭氧微生物而開發(fā)的嚴格厭氧技術(shù)對厭氧環(huán)境要求更為嚴格。其所能提供的厭氧環(huán)境更為嚴格。目前主要技術(shù)厭氧手套箱法(如英國Ruskinn厭氧工作站）第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.2.1厭氧手套箱技術(shù)：以Ruskinn的厭氧工作站為例：

這種厭氧手套箱工作站匯集分離純化操作、恒溫培養(yǎng)、方便觀察等傳統(tǒng)厭氧袋或罐所不具備的功能于一體且產(chǎn)品的類型包括專性厭氧、微好氧和低氧(次氧)的系列培養(yǎng)條件，充分滿足當代微生物學家及專業(yè)人士對厭氧培養(yǎng)應(yīng)具備的功能多樣化和產(chǎn)品系列化的綜合要求。第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.2.2厭氧手套箱技術(shù)原理：

基本原理相同于傳統(tǒng)的厭氧罐、厭氧袋，但Ruskinn的厭氧工作站作了較科學的改進，從而使其確保了比傳統(tǒng)厭氧罐或厭氧袋更嚴格的厭氧環(huán)境。1、供氣系統(tǒng)采用外源供氣(一個單瓶供氣)，氣體為無氧混合氣體;也可選雙氣供氣，即多加一個氮氣瓶，這種消耗更為經(jīng)濟。2、催化劑系統(tǒng)Ruskinn厭氧工作站各型號均采用特殊處理的把催化劑，省去了每次使用后的活化步驟，該催化劑可使用一年以上。第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法3、恒濕系統(tǒng)Ruskim:厭氧工作站對傳統(tǒng)厭氧罐的吸濕系統(tǒng)作了很大改進。如：concept400厭氧工作站在操作室頂部裝了一個恒濕器，當濕度高于設(shè)定值時，該恒濕器自動除濕;當環(huán)境濕度低于設(shè)定值時，該裝置將收集到冷凝水蒸發(fā)，以提高環(huán)境的濕度。第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.2.3厭氧手套箱技術(shù)特點：工作容量大，工作室可放置多達550個90mm的培養(yǎng)皿，2可調(diào)節(jié)的高密度熒光燈和鹵素觀察燈，由腳動開關(guān)控制。4快速轉(zhuǎn)移閘裝置可保證在45秒內(nèi)轉(zhuǎn)移40多個90mm培養(yǎng)皿33符合人類環(huán)境改造學設(shè)計原理31第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.2.4厭氧手套箱技術(shù)優(yōu)點：①厭氧培養(yǎng)技術(shù)的多功能性:與傳統(tǒng)的厭氧罐對比，厭氧工作站能在其工作箱中進行高質(zhì)量的厭氧菌的分離、純化、培養(yǎng)，且易觀察(不用解除厭氧環(huán)境)。②快速和高質(zhì)量地分離效果:通過袖式裸手操作系統(tǒng)和快速氣閘轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可快速操作和分離厭氧菌。而傳統(tǒng)厭氧罐或厭氧袋沒有分離操作空間。第二章、厭氧微生物的傳統(tǒng)研究方法2.3其他厭氧技術(shù)：1、生物耗氧法2、亨蓋特厭氧滾管技術(shù)3、皰肉培養(yǎng)基第三章、分子生態(tài)學研究方法1.分子生態(tài)學引入背景：（1）傳統(tǒng)的厭氧微生物分離培養(yǎng)方法不能滿足厭氧微生物原位識別及形態(tài)學研究的需要,并且在多樣性和動力學研究方面還存在著嚴重的局限性：①培養(yǎng)過程復(fù)雜耗時;②只能反映顯微鏡條件下極少部分(<10%)的菌落數(shù)。（2）近10年發(fā)展起來的以分子生物學方法為基礎(chǔ)的分子生態(tài)學,大大拓寬了厭氧微生物生態(tài)學的研究視野,使之可以更客觀、更直接地探討厭氧微生物種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及其與環(huán)境間的相互關(guān)系。第三章、分子生態(tài)學研究方法2.分子生態(tài)學技術(shù)：1、核酸探針檢測技術(shù)2、利用引物的PCR技術(shù)3、DNA序列分析4、基因芯片技術(shù)第三章、分子生態(tài)學研究方法2.1核酸探針檢測技術(shù)：原理：以核酸分子雜交技術(shù)為核心,利用探針分析DNA序列及片段長度多態(tài)性.2.1.2探針：能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段。3、PCR產(chǎn)物或人工合成的寡核苷酸探針2、從RNA制備cDNA探針1、長探針和短探針探針類型：第三章、分子生態(tài)學研究方法2.1.3應(yīng)用方向：（1）應(yīng)用于對環(huán)境中的厭氧微生物的檢測,定性、定量分析它們的存在、分布、豐度和適應(yīng)性等研究目標。（2）作為一種能高度靈敏檢測污染環(huán)境下厭氧微生物種群變化的方法。第三章、分子生態(tài)學研究方法2.2利用引物的PCR技術(shù)：2.2.1簡介：1985年,Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù),即以一對特定的寡核苷酸片段為引物,在耐熱的TaqDNA聚合酶作用下,體外合成特異的DNA片段,在數(shù)小時內(nèi)可將目的基因擴增上百萬倍.2.2.2意義：使得在復(fù)雜環(huán)境中,對那些混合物內(nèi)低含量的群體成員或微生物群中某個特異基因的檢測與研究成為可能.PCR技術(shù)分類：1)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)2）競爭PCR(C-PCR)3）隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)第三章、分子生態(tài)學研究方法2.3DNA序列分析技術(shù)：

最充分揭示DNA多樣性的方法是DNA序列分析.尤其是熒光標記的核酸自動測序儀的普遍使用,同時隨著分子信息學的發(fā)展,已有許多功能基因及專門的rDNA序列數(shù)據(jù)庫軟件供序列比較,使核基因的序列分析可揭示更高水平多態(tài)性.生態(tài)學上用的最多的是“通用”引物擴增DNA某些基因(如rDNA)的DNA片段,隨后用通用引物直接測序.第三章、分子生態(tài)學研究方法2.4基因芯片技術(shù)：2.4.1簡介：

基因芯片(Microarray)技術(shù)于1991年首次在Science雜志上被提出,是生物芯片(Biochip)的一種。該技術(shù)是隨著人類基因組計劃的逐步實施和分子生物學的迅猛發(fā)展而產(chǎn)生的。在短短的10多年時間里基因芯片的研究和應(yīng)用取得了巨大的進步?；蛐酒夹g(shù)分類：1、含有編碼關(guān)于不同生物化學循環(huán)過程關(guān)鍵酶的功能基因芯片。2、含有源于核糖體核酸(rRNA)基因探針的系統(tǒng)發(fā)育的寡核苷酸芯片3、用純培養(yǎng)微生物的整個DNA基因組構(gòu)建的群落基因組芯片第三章、分子生態(tài)學研究方法技術(shù)優(yōu)點：

與傳統(tǒng)的多孔膜核酸雜交技術(shù)相比,玻片等為載體的基因芯片提供了更多的優(yōu)點,如高密度、高靈敏度、快速實時檢測、經(jīng)濟、自動化和低背景水平等第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物研究的應(yīng)用1.研究背景：（1）厭氧微生物采油技術(shù)(MEOR)技術(shù)相對其它的3次采油技術(shù)具有成本低、適用范圍廣、環(huán)境相對友好等優(yōu)點而備受重視（2）作為地下生物圈的組成部分,油藏微生物（主要是厭氧微生物）不僅在元素的生物地球化學循環(huán)過程中起著重要作用,其獨特的生理生化特征及微生物產(chǎn)生的酶和其他代謝產(chǎn)物在生物技術(shù)上具有巨大應(yīng)用潛力第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物研究的應(yīng)用2.油藏微生物類群：微生物類群鐵還原菌發(fā)酵菌硝酸鹽還原菌產(chǎn)甲烷古菌等硫酸鹽還原菌第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物研究的應(yīng)用3.技術(shù)原理：（3)16SrRNA基因的全序列分為可變區(qū)和恒定區(qū)兩部分,可變區(qū)序列因不同細菌而異,恒定區(qū)序列基本保守。可以利用恒定區(qū)序列擴增，利用可變區(qū)序列的差異來對不同屬、種的細菌進行分類鑒定。（2)16SrDNA分子結(jié)構(gòu)上高度保守,只在某些位置有少量的核苷酸序列改變,而且這些位置的改變有屬或種特異性。其所含信息較多,長度又較適中，更適合于微生物分子生態(tài)的研究。

（1)rRNA存在于所有的生物中,rRNA是細菌和真核細胞核糖體的基本組成部分。第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物研究的應(yīng)用4.研究方法：

微生物分子生態(tài)學方法多是建立在對SSURNA基因,特別是16SrDNA分子系統(tǒng)發(fā)育學研究的基礎(chǔ)上,其常用研究方法如圖所示第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物研究的應(yīng)用5.研究實例：（1）Agne′sGrabowski等通過地質(zhì)化學方法、常規(guī)可培養(yǎng)方法和分子生態(tài)學方法研究了低溫低鹽未注水油藏微生物多樣性,并發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)的厭氧菌(同型產(chǎn)乙酸菌、硝酸鹽還原菌、硫酸鹽還原菌、產(chǎn)甲烷古菌)在其群落中占優(yōu)勢,同型產(chǎn)乙酸菌數(shù)量超過硫酸鹽還原菌和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌.

（2）程海鷹等采用PCR-DGGE分析了油田采出水富集培養(yǎng)物的群落結(jié)構(gòu)（3）佘躍惠等對油田的進出水油藏微生物群落結(jié)構(gòu)進行了分子分析.小結(jié)：

上述分子生物學研究手段的出現(xiàn)雖然極大地提升了厭氧微生物生態(tài)學的研究水平,但是傳統(tǒng)厭氧微生物培養(yǎng)方法仍然是環(huán)境微生物生態(tài)研究不可或缺的重要手段,其作用不可忽視。參考文獻：[1]田揚捷,楊虹,吳秀娟,等.綜合應(yīng)用ITS及16SrDNA進行環(huán)境微生物生態(tài)研究[J].微生物學通報,2004,31(4):85-88.[2]段景杰,趙亞杰,呂振山.DNA檢測技術(shù)及其在微生物采油中的應(yīng)用[J].油田化學,2003,20(2):192-196.[3]鐘鳴,周啟星.2002.微生物分子生態(tài)學技術(shù)及其在環(huán)境污