酵母表達(dá)系統(tǒng)教案課件

酵母表達(dá)系統(tǒng)陳凱酵母表達(dá)系統(tǒng)陳凱1主要內(nèi)容一、酵母表達(dá)系統(tǒng)的種類；二、酵母的表達(dá)載體；三、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)；四、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)；五、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中外源基因表達(dá)優(yōu)化。第1頁/共31頁主要內(nèi)容第1頁/共31頁2酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物。（可有性繁殖）第2頁/共31頁酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單3一、酵母表達(dá)系統(tǒng)的種類1、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)；2、甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)---巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母；3、裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng)；4、乳酸克魯維亞酵母表達(dá)系統(tǒng)；5、Arxulaadeninivorams。第3頁/共31頁一、酵母表達(dá)系統(tǒng)的種類第3頁/共31頁4二、酵母的表達(dá)載體

酵母表達(dá)載體依據(jù)其復(fù)制形式分為自主復(fù)制型和整合型兩種。1、游離質(zhì)粒載體指帶有自主復(fù)制序列（ARS）的復(fù)制型質(zhì)粒和帶有酵母內(nèi)源質(zhì)粒2μ環(huán)的衍生質(zhì)粒載體。

它細(xì)分為三種：

①酵母附加型質(zhì)粒（YEp）----拷貝數(shù)高較穩(wěn)定；

②酵母復(fù)制質(zhì)粒（YRp）-----拷貝數(shù)高但不穩(wěn)定；

③酵母著絲質(zhì)粒（YCp）----每個細(xì)胞平均只有一個拷貝，穩(wěn)定。第4頁/共31頁二、酵母的表達(dá)載體第4頁/共31頁52、整合載體

整合載體（yeastintegrationplasmid，YIp）指不含酵母自助復(fù)制序列，不能獨立復(fù)制的載體，但含有整合介導(dǎo)區(qū)，可通過同源重組整合入酵母基因組并隨同酵母染色體一起復(fù)制。第5頁/共31頁2、整合載體第5頁/共31頁6三、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)

釀酒酵母是目前了解最完全的真核生物，1996年完成全基因組測序，是一種真核生物模式菌，被FDA認(rèn)定為安全性生物。1、常用的啟動子1）糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的啟動子：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PGK、乙醇脫氫酶基因ADH；2）半乳糖激酶啟動子：GAL1；3）

pho4TS-PHO5啟動子。第6頁/共31頁三、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)第6頁/共31頁72、釀酒酵母分泌系統(tǒng)1）信號肽結(jié)構(gòu)：2）常用分泌信號肽：①性結(jié)合因子---MF-α；②酸性磷酸酯酶---PHO5；③蔗糖酶---SUC2；④

殺手毒素因子KIL。3）信號肽特點：

①保守性低；②大多異源宿主系統(tǒng)的信號肽不能互用；第7頁/共31頁2、釀酒酵母分泌系統(tǒng)第7頁/共31頁84）MF-α信號肽：①由88個AA組成；②分泌效率高；③在酵母系統(tǒng)具有通用性。第8頁/共31頁4）MF-α信號肽：第8頁/共31頁93、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)1）糖基化位點：

Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）2）糖基化類型：

①N-型糖基化：天門冬酰氨酸殘基上的酰胺氮進(jìn)行糖基化，對蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。

②O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進(jìn)行糖基化。3）糖基化特點：過糖基化（超糖基化修飾）第9頁/共31頁3、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)第9頁/共31頁104、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)缺點：1）對產(chǎn)物的翻譯后修飾與高等真核生物不同，常發(fā)生超糖基化（N-糖基鏈上出現(xiàn)>100個甘露糖，是正常的十幾倍）；2）不易進(jìn)行高密度發(fā)酵，表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量低；3）分泌效率低，>30KDa的蛋白幾乎不分泌；4）表達(dá)的蛋白C端易被截斷；第10頁/共31頁4、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)缺點：第10頁/共31頁11四、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母，是80年代開發(fā)和研制的一種外源蛋白高效表達(dá)系統(tǒng)。1、特點●含醇氧化酶基因（AOX）強啟動子，用甲醇可嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá)；●外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定；●自身分泌的背景蛋白少；●表達(dá)水平高，即可胞內(nèi)表達(dá)又能胞外表達(dá)；●具有翻譯后修飾系統(tǒng)（糖基化、磷酸化、脂酰化）；●使用簡單，成本低廉；●可高密度發(fā)酵，且發(fā)酵工藝成熟，易放大；第11頁/共31頁四、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)第11頁/共31頁122、宿主細(xì)胞目前廣泛應(yīng)用于外源基因表達(dá)和研究的畢赤酵母宿主菌有兩種主要類型：營養(yǎng)缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌。1）營養(yǎng)缺陷型菌株第12頁/共31頁2、宿主細(xì)胞第12頁/共31頁132）蛋白酶缺陷型菌株第13頁/共31頁2）蛋白酶缺陷型菌株第13頁/共31頁143、表達(dá)載體由于畢赤酵母沒有穩(wěn)定的游離型載體，故應(yīng)用整合型載體，通過同源重組整合到酵母染色體來實現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。分泌表達(dá)型載體pPICZαAEcoRI、XbaI、KpnI……HIS4α-Factor，Zeoncin第14頁/共31頁3、表達(dá)載體分泌表達(dá)型載體pPICZαAEco15胞內(nèi)表達(dá)型載體第15頁/共31頁胞內(nèi)表達(dá)型載體第15頁/共31頁16常用啟動子第16頁/共31頁常用啟動子第16頁/共31頁174、轉(zhuǎn)化及篩選鑒定①表達(dá)載體的線性化②感受態(tài)細(xì)胞的制備③轉(zhuǎn)化④營養(yǎng)缺陷篩選（His）⑤抗性篩選（G418）⑥鑒定（菌落PCR或表達(dá)）第17頁/共31頁4、轉(zhuǎn)化及篩選鑒定①表達(dá)載體的線性化②感受態(tài)細(xì)胞的制備③轉(zhuǎn)化18（1）表達(dá)載體的線性化

未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，故需使用特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理。處理的目的：1）防止隨機插入重組時質(zhì)粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達(dá)失活；2）讓同源重組以指定的方式發(fā)生。第18頁/共31頁（1）表達(dá)載體的線性化第18頁/共31頁19（2）轉(zhuǎn)化方式第19頁/共31頁（2）轉(zhuǎn)化方式第19頁/共31頁20（3）目的基因的整合方式1）基因插入AOX1或aox1::AGR4位點第20頁/共31頁（3）目的基因的整合方式第20頁/共31頁212）基因替換AOXI位點第21頁/共31頁2）基因替換AOXI位點第21頁/共31頁223）基因插入HIS4位點第22頁/共31頁3）基因插入HIS4位點第22頁/共31頁234）多拷貝插入第23頁/共31頁4）多拷貝插入第23頁/共31頁24（4）篩選1）組氨酸缺陷平板初篩

畢赤酵母菌GS115及KM117在組氨酸脫氫酶位點（His4）有突變，因而不能合成組氨酸。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒含HIS4基因可與宿主互補，通過MD篩選培養(yǎng)基即可選擇轉(zhuǎn)化子。2）G418平板篩選多拷貝

質(zhì)粒上含有細(xì)菌的Kana基因（其與表達(dá)盒之間有遺傳連鎖），賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性。遺傳霉素抗性水平主要依賴整合的kana基因的數(shù)目；每個單拷貝的基因賦予畢赤酵母約0.25mg/ml的遺傳霉素抗性水平。第24頁/共31頁（4）篩選第24頁/共31頁25五、外源基因表達(dá)優(yōu)化1、基因拷貝數(shù)（基因劑量）：

目的基因的拷貝數(shù)對表達(dá)量影響極大，不同的基因?qū)截悢?shù)的要求不同。因此，實驗時要對不同拷貝的菌株進(jìn)行表達(dá)量篩選。2、基因序列組成：①A+T含量高的基因在酵母中由于提前終止而不能有效的轉(zhuǎn)錄[序列TAAATAAA/G是酵母的poly（A）識別信號]。因此控制其含量在30%~55%之間是切實可行的方法。②mRNA的5‘-UTR長度及其核苷酸序列對外源基因在酵母中的表達(dá)影響很大。因此目的基因的5’-UTR與AOX1基因的（114個AA，AT含量為73%）必須保持盡可能的接近，最好完全符合。第25頁/共31頁五、外源基因表達(dá)優(yōu)化1、基因拷貝數(shù)（基因劑量）：第25頁/共263、密碼子優(yōu)化：

各物種存在這密碼子偏愛性的現(xiàn)象，因此采用酵母偏愛的密碼子可顯著提高表達(dá)量；4、啟動子：

選擇啟動子時,必須依據(jù)研究目的和外源蛋白的性質(zhì)來選擇最合適的啟動子,有時并不是啟動子越強越好,合理選擇與設(shè)計啟動子是提高外源蛋白產(chǎn)量的有效途徑。

5、糖基化修飾：

畢赤酵母的糖基化修飾作用對外源蛋白的表達(dá)量和蛋白性質(zhì)都有影響。其糖基化程度雖比釀酒酵母弱，但與天然蛋白相比，仍存糖基化過度問題。

因此在不影響功能的情況下，定向突變糖基化位點、或選擇與糖苷酶進(jìn)行共表達(dá)，來解決該問題。

第26頁/共31頁3、密碼子優(yōu)化：第26頁/共31頁276、信號肽：

根據(jù)不同結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的外源蛋白選擇適當(dāng)?shù)男盘栯牟⑦M(jìn)行相應(yīng)改造，以期實現(xiàn)高效表達(dá)。

第27頁/共31頁6、信號肽：第27頁/共31頁287、外源蛋白的降解：1）培養(yǎng)基中加入富含氨基酸和多肽的添加劑（蛋白胨和酪蛋白水解物)

；2）調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值以降低蛋白酶活性；3）添加蛋白酶抑制劑（PMSF、EDTA）；4）使用蛋白酶缺陷菌株；共表達(dá)蛋白水解酶抑制劑

5）共表達(dá)蛋白水解酶抑制劑（如分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制因子—SLPI）；

6）利用過氧化物酶體靶向信號(Peroxisomaltargetingsignal，PTS)與目的蛋白連接；7）在不改變重組蛋白性質(zhì)的前提下，去除蛋白酶的作用位點；8）利用在畢赤酵母中穩(wěn)定的蛋白伴侶與目的蛋白融合表達(dá)，可明顯地提高表達(dá)量（如二硫鍵異構(gòu)酶PDI。

第28頁/共31頁7、外源蛋白的降解：第28頁/共31頁29謝謝！第29頁/共31頁謝謝！第29頁/共31頁30甲醇的代謝途徑第30頁/共31頁甲醇的代謝途徑第30頁/共31頁31感謝您的觀看！第31頁/共31頁感謝您的觀看！第31頁/共31頁32酵母表達(dá)系統(tǒng)陳凱酵母表達(dá)系統(tǒng)陳凱33主要內(nèi)容一、酵母表達(dá)系統(tǒng)的種類；二、酵母的表達(dá)載體；三、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)；四、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)；五、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中外源基因表達(dá)優(yōu)化。第1頁/共31頁主要內(nèi)容第1頁/共31頁34酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物。（可有性繁殖）第2頁/共31頁酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單35一、酵母表達(dá)系統(tǒng)的種類1、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)；2、甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)---巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母；3、裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng)；4、乳酸克魯維亞酵母表達(dá)系統(tǒng)；5、Arxulaadeninivorams。第3頁/共31頁一、酵母表達(dá)系統(tǒng)的種類第3頁/共31頁36二、酵母的表達(dá)載體

酵母表達(dá)載體依據(jù)其復(fù)制形式分為自主復(fù)制型和整合型兩種。1、游離質(zhì)粒載體指帶有自主復(fù)制序列（ARS）的復(fù)制型質(zhì)粒和帶有酵母內(nèi)源質(zhì)粒2μ環(huán)的衍生質(zhì)粒載體。

它細(xì)分為三種：

①酵母附加型質(zhì)粒（YEp）----拷貝數(shù)高較穩(wěn)定；

②酵母復(fù)制質(zhì)粒（YRp）-----拷貝數(shù)高但不穩(wěn)定；

③酵母著絲質(zhì)粒（YCp）----每個細(xì)胞平均只有一個拷貝，穩(wěn)定。第4頁/共31頁二、酵母的表達(dá)載體第4頁/共31頁372、整合載體

整合載體（yeastintegrationplasmid，YIp）指不含酵母自助復(fù)制序列，不能獨立復(fù)制的載體，但含有整合介導(dǎo)區(qū)，可通過同源重組整合入酵母基因組并隨同酵母染色體一起復(fù)制。第5頁/共31頁2、整合載體第5頁/共31頁38三、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)

釀酒酵母是目前了解最完全的真核生物，1996年完成全基因組測序，是一種真核生物模式菌，被FDA認(rèn)定為安全性生物。1、常用的啟動子1）糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的啟動子：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PGK、乙醇脫氫酶基因ADH；2）半乳糖激酶啟動子：GAL1；3）

pho4TS-PHO5啟動子。第6頁/共31頁三、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)第6頁/共31頁392、釀酒酵母分泌系統(tǒng)1）信號肽結(jié)構(gòu)：2）常用分泌信號肽：①性結(jié)合因子---MF-α；②酸性磷酸酯酶---PHO5；③蔗糖酶---SUC2；④

殺手毒素因子KIL。3）信號肽特點：

①保守性低；②大多異源宿主系統(tǒng)的信號肽不能互用；第7頁/共31頁2、釀酒酵母分泌系統(tǒng)第7頁/共31頁404）MF-α信號肽：①由88個AA組成；②分泌效率高；③在酵母系統(tǒng)具有通用性。第8頁/共31頁4）MF-α信號肽：第8頁/共31頁413、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)1）糖基化位點：

Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）2）糖基化類型：

①N-型糖基化：天門冬酰氨酸殘基上的酰胺氮進(jìn)行糖基化，對蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。

②O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進(jìn)行糖基化。3）糖基化特點：過糖基化（超糖基化修飾）第9頁/共31頁3、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)第9頁/共31頁424、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)缺點：1）對產(chǎn)物的翻譯后修飾與高等真核生物不同，常發(fā)生超糖基化（N-糖基鏈上出現(xiàn)>100個甘露糖，是正常的十幾倍）；2）不易進(jìn)行高密度發(fā)酵，表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量低；3）分泌效率低，>30KDa的蛋白幾乎不分泌；4）表達(dá)的蛋白C端易被截斷；第10頁/共31頁4、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)缺點：第10頁/共31頁43四、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母，是80年代開發(fā)和研制的一種外源蛋白高效表達(dá)系統(tǒng)。1、特點●含醇氧化酶基因（AOX）強啟動子，用甲醇可嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá)；●外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定；●自身分泌的背景蛋白少；●表達(dá)水平高，即可胞內(nèi)表達(dá)又能胞外表達(dá)；●具有翻譯后修飾系統(tǒng)（糖基化、磷酸化、脂?；?；●使用簡單，成本低廉；●可高密度發(fā)酵，且發(fā)酵工藝成熟，易放大；第11頁/共31頁四、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)第11頁/共31頁442、宿主細(xì)胞目前廣泛應(yīng)用于外源基因表達(dá)和研究的畢赤酵母宿主菌有兩種主要類型：營養(yǎng)缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌。1）營養(yǎng)缺陷型菌株第12頁/共31頁2、宿主細(xì)胞第12頁/共31頁452）蛋白酶缺陷型菌株第13頁/共31頁2）蛋白酶缺陷型菌株第13頁/共31頁463、表達(dá)載體由于畢赤酵母沒有穩(wěn)定的游離型載體，故應(yīng)用整合型載體，通過同源重組整合到酵母染色體來實現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。分泌表達(dá)型載體pPICZαAEcoRI、XbaI、KpnI……HIS4α-Factor，Zeoncin第14頁/共31頁3、表達(dá)載體分泌表達(dá)型載體pPICZαAEco47胞內(nèi)表達(dá)型載體第15頁/共31頁胞內(nèi)表達(dá)型載體第15頁/共31頁48常用啟動子第16頁/共31頁常用啟動子第16頁/共31頁494、轉(zhuǎn)化及篩選鑒定①表達(dá)載體的線性化②感受態(tài)細(xì)胞的制備③轉(zhuǎn)化④營養(yǎng)缺陷篩選（His）⑤抗性篩選（G418）⑥鑒定（菌落PCR或表達(dá)）第17頁/共31頁4、轉(zhuǎn)化及篩選鑒定①表達(dá)載體的線性化②感受態(tài)細(xì)胞的制備③轉(zhuǎn)化50（1）表達(dá)載體的線性化

未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，故需使用特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理。處理的目的：1）防止隨機插入重組時質(zhì)粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達(dá)失活；2）讓同源重組以指定的方式發(fā)生。第18頁/共31頁（1）表達(dá)載體的線性化第18頁/共31頁51（2）轉(zhuǎn)化方式第19頁/共31頁（2）轉(zhuǎn)化方式第19頁/共31頁52（3）目的基因的整合方式1）基因插入AOX1或aox1::AGR4位點第20頁/共31頁（3）目的基因的整合方式第20頁/共31頁532）基因替換AOXI位點第21頁/共31頁2）基因替換AOXI位點第21頁/共31頁543）基因插入HIS4位點第22頁/共31頁3）基因插入HIS4位點第22頁/共31頁554）多拷貝插入第23頁/共31頁4）多拷貝插入第23頁/共31頁56（4）篩選1）組氨酸缺陷平板初篩

畢赤酵母菌GS115及KM117在組氨酸脫氫酶位點（His4）有突變，因而不能合成組氨酸。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒含HIS4基因可與宿主互補，通過MD篩選培養(yǎng)基即可選擇轉(zhuǎn)化子。2）G418平板篩選多拷貝

質(zhì)粒上含有細(xì)菌的Kana基因（其與表達(dá)盒之間有遺傳連鎖），賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性。遺傳霉素抗性水平主要依賴整合的kana基因的數(shù)目；每個單拷貝的基因賦予畢赤酵母約0.25mg/ml的遺傳霉素抗性水平。第24頁/共31頁（4）篩選第24頁/共31頁57五、外源基因表達(dá)優(yōu)化1、基因拷貝數(shù)（基因劑量）：

目的基因的拷貝數(shù)對表達(dá)量影響極大，不同的基因?qū)截悢?shù)的要求不同。因此，實驗時要對不同拷貝的菌株進(jìn)行表達(dá)量篩選。2、基因序列組成：①A+T含量高的基因在酵母中由于提前終止而不能有效的轉(zhuǎn)錄[序列TAAATAAA/G是酵母的poly（A）識別信號]。因此控制其含量在30%~55%之間是切實可行的方法。②mRNA的5‘-UTR長度及其核苷酸序列對外源基因在酵母中的表達(dá)影響很大。因此目的基因的5’-UTR與AOX1基因的（114個AA，AT含量為73%）必須保持盡可能的接近，最好完全符合。第25頁/共31頁五、外源基因表達(dá)優(yōu)化1、基因拷貝數(shù)（基因劑量）：第25頁/共583、密碼子優(yōu)化：

各物種