PDX模型的建立-分析和應(yīng)用課件

人源腫瘤異種移植(PDX)模型的建立、

分析和應(yīng)用FeiZhou人源腫瘤異種移植(PDX)模型的建立、

分析和應(yīng)用FeiZ腫瘤研究模型多樣化的腫瘤研究模型病人腫瘤組織/原代腫瘤細(xì)胞永生化的腫瘤細(xì)胞系2D和3D的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法（增殖/存活）來(lái)源于腫瘤細(xì)胞系的移植模型

來(lái)源于病人腫瘤組織的移植(PDX)模型

PatientDerivedTumorXenograft新1腫瘤研究模型多樣化的腫瘤研究模型新1傳統(tǒng)模型：腫瘤細(xì)胞系可以很方便的在體外進(jìn)行培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn)：在培養(yǎng)和傳代過(guò)程中進(jìn)行“篩選”，腫瘤細(xì)胞逐漸適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境而失去原有特性缺乏腫瘤相關(guān)的生長(zhǎng)環(huán)境支持性的非腫瘤基質(zhì)血液細(xì)胞，免疫系統(tǒng)的交互其他腫瘤微環(huán)境因子2傳統(tǒng)模型：腫瘤細(xì)胞系可以很方便的在體外進(jìn)行培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)2腫瘤研究模型使用傳統(tǒng)的腫瘤研究模型沒(méi)能取得臨床上的成功！腫瘤的多樣化和異質(zhì)性研究模型與臨床病人缺乏相關(guān)性3腫瘤研究模型使用傳統(tǒng)的腫瘤研究模型沒(méi)能取得臨床上的成功！3PDX模型技術(shù)流程圖ModifiedFigfromOncodesignBiotechnology4PDX模型技術(shù)流程圖ModifiedFigfromOn為什么使用PDX模型？?jī)?yōu)勢(shì)沒(méi)有體外培養(yǎng)的過(guò)程對(duì)腫瘤進(jìn)行“篩選”能搞保持腫瘤原有特性和異質(zhì)性在傳代過(guò)程中能夠保持分子生物學(xué)水平的穩(wěn)定保留了原有的非腫瘤基質(zhì)和微環(huán)境可以對(duì)多種狀態(tài)下病人來(lái)源的腫瘤進(jìn)行研究PDX模型和腫瘤病人有更好的對(duì)應(yīng)性！5為什么使用PDX模型？?jī)?yōu)勢(shì)PDX模型和腫瘤病人有更好的對(duì)應(yīng)性使用PDX模型劣勢(shì)仍然不能模擬腫瘤與免疫系統(tǒng)的交互可以在NSG小鼠模型中部分重建人源免疫系統(tǒng)在傳代過(guò)程中模型的非腫瘤基質(zhì)會(huì)被鼠源的基質(zhì)逐漸取代使用較低代數(shù)的PDX模型進(jìn)行研究需要相對(duì)便捷的臨床腫瘤樣本來(lái)源技術(shù)水平上有挑戰(zhàn)性移植+分析（包括生物信息學(xué)平臺(tái)）建立和維持的成本較高

相對(duì)的建成之后的使用價(jià)值也非常高6使用PDX模型劣勢(shì)6PDX模型的建立PDX模型的分析PDX模型的應(yīng)用7PDX模型的建立7PDX模型的建立關(guān)鍵點(diǎn)腫瘤宿主腫瘤接種腫瘤的凍存和復(fù)蘇8PDX模型的建立關(guān)鍵點(diǎn)8宿主品系小鼠品系免疫缺陷NudeT淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺失SCIDSevereCombinedImmunodeficiencyT淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞缺失NOD-SCIDNon-obeseDiabeticSCID與普通SCID相比NK細(xì)胞活性低，更低的免疫恢復(fù)幾率NSGNOD-SCID-IL2Rγ-/-缺失T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞9宿主品系小鼠品系免疫缺陷NudeT淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺失SCIDT宿主品系目前并沒(méi)有針對(duì)不同品系宿主的完整比較移植瘤生長(zhǎng)時(shí)間接種成功率移植瘤遺傳學(xué)特性移植瘤組織學(xué)特性移植瘤傳代的穩(wěn)定性模型建立情況與腫瘤類型相關(guān)荷瘤小鼠的飼養(yǎng)設(shè)施要求（常規(guī)為SPF級(jí)IVC飼養(yǎng)）完善的IACUC政策10宿主品系目前并沒(méi)有針對(duì)不同品系宿主的完整比較10腫瘤接種皮下接種NormanE.SharplessandRonaldA.DePinho,etal.NatureReviewDrugDiscovery200611腫瘤接種皮下接種NormanE.Sharplessan腫瘤接種使用套針(Trochar)進(jìn)行皮下腫瘤接種XiaomeiZhang,etal.CurrentProtocolsinMouseBiology201312腫瘤接種使用套針(Trochar)進(jìn)行皮下腫瘤接種Xiaom腫瘤接種原位接種常用途徑：腎包膜下接種(Sub-RenalCapsule,SRC)PeterEirew,etal.NatureProtocols201013腫瘤接種原位接種PeterEirew,etal.Na腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇凍存液胎牛血清+10%DMSO保存條件-80oC：6周液氮：長(zhǎng)期保存從凍存條件下復(fù)蘇37oC水浴快速解凍14腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇凍存液14腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇通過(guò)凍存和復(fù)蘇可以：在獲得患者知情同意書之前保存樣本保有備份樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)15腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇通過(guò)凍存和復(fù)蘇可以：15PDX模型的建立PDX模型的分析PDX模型的應(yīng)用16PDX模型的建立16PDX模型的分析目的說(shuō)明移植瘤與原瘤的相似性確認(rèn)移植瘤在傳代過(guò)程中的生物學(xué)穩(wěn)定為PDX模型的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐17PDX模型的分析目的17需要保存的材料基因組DNA使用代表性的腫瘤組織區(qū)域進(jìn)行DNA提取如：排除壞死區(qū)域等冷凍保存總RNA避免RNA酶污染，一般用試劑盒小心提取，冷凍保存包含mRNA和miRNA蛋白樣本（組織裂解液）處理時(shí)包含蛋白酶和磷酸酶抑制劑冷凍保存生物樣本庫(kù)18需要保存的材料基因組DNA生物樣本庫(kù)18分析內(nèi)容–常規(guī)臨床背景患者年齡/性別；腫瘤類別，原位瘤/轉(zhuǎn)移瘤；治療史移植瘤分析生長(zhǎng)曲線；藥理學(xué)特性針對(duì)特定藥物處理的反應(yīng)組織學(xué)和分子生物學(xué)分析原瘤vs.移植瘤19分析內(nèi)容–常規(guī)臨床背景19分析內(nèi)容–組織學(xué)病理學(xué)染色（HE染色）確認(rèn)腫瘤組織結(jié)構(gòu)頭頸癌PDX模型維持了原瘤的組織學(xué)特性Pengetal.JournalofTranslationalMedicine201320分析內(nèi)容–組織學(xué)病理學(xué)染色（HE染色）頭頸癌PDX模型維分析內(nèi)容–組織學(xué)免疫組織化學(xué)染色

（IHC）常規(guī)標(biāo)記（如細(xì)胞增殖、凋亡）移植的生物標(biāo)記物（Her2,EGFR,KRAS等蛋白）研究者感興趣的蛋白DongLin,etal.CancerRes2013神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌PDX模型維持了原瘤的蛋白標(biāo)記21分析內(nèi)容–組織學(xué)免疫組織化學(xué)染色（IHC）DongL分析內(nèi)容–組織學(xué)組織芯片(TissueMicro-Array,TMA)GuidoSauter,etal.NatureReviewDrugDiscovery200322分析內(nèi)容–組織學(xué)組織芯片(TissueMicro-Ar分析內(nèi)容–分子水平DNA基因序列

第二代測(cè)序平臺(tái)：IlluminaHiSeq等基因突變SequenomOncoCarta?PanelsV1-3V1：涵蓋19個(gè)常規(guī)癌基因的238個(gè)突變位點(diǎn)V2：涵蓋18個(gè)癌基因或癌抑制基因的152個(gè)突變位點(diǎn)V3:：涵蓋22個(gè)癌基因的105個(gè)突變位點(diǎn)整理過(guò)的基因突變數(shù)據(jù)23分析內(nèi)容–分子水平DNA23分析內(nèi)容–分子水平外顯子組測(cè)序外顯子捕獲RocheSeqCapEZAgilentSureSelectIlluminaTruSeq使用第二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行外顯子組測(cè)序需要有整合的生物信息學(xué)分析平臺(tái)針對(duì)PDX模型對(duì)二代測(cè)序結(jié)果分析進(jìn)行優(yōu)化對(duì)識(shí)別變體的方法進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證根據(jù)需要開(kāi)發(fā)個(gè)性化的數(shù)據(jù)分析方法24分析內(nèi)容–分子水平外顯子組測(cè)序24分析內(nèi)容–分子水平外顯子組測(cè)序右圖為Oncotest公司使用外顯子組測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析方法整理出的23個(gè)PDX模型中507個(gè)癌癥相關(guān)基因的突變頻率。每一個(gè)扇區(qū)代表了一種腫瘤類型；熱度圖指示了該腫瘤類型中某個(gè)基因的突變頻率。Krzywinsky,M.etal.Circos:anInformationAestheticforComparativeGenomics,GenomeRes(2009)19:1639-164525分析內(nèi)容–分子水平外顯子組測(cè)序右圖為Oncote分析內(nèi)容–分子水平RNA基因表達(dá)譜

AffymetrixHG-U133plus2.0

Array單核苷酸多態(tài)性(SNP)和拷貝數(shù)變異分析

AffymetrixGenome-WideHumanSNPArrayV6.0miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)

miRNAarray26分析內(nèi)容–分子水平RNA26分析內(nèi)容–分子水平蛋白表達(dá)（蛋白標(biāo)記）蛋白免疫印跡WesternBlot免疫組織化學(xué)染色I(xiàn)HC熒光原位雜交(FISH)肝癌PDX模型的蛋白表達(dá)分析。HungHuynh,etal.CancerRes200627分析內(nèi)容–分子水平蛋白表達(dá)（蛋白標(biāo)記）肝癌PDX模型的蛋PDX模型的建立PDX模型的分析PDX模型的應(yīng)用28PDX模型的建立28新藥開(kāi)發(fā)和篩選研究PDX模型對(duì)于藥物處理的反應(yīng)分子標(biāo)記物開(kāi)發(fā)(Biomarker)藥物反應(yīng)

分子生物學(xué)機(jī)制個(gè)性化治療分子生物學(xué)機(jī)制

針對(duì)性的治療方案PDX模型的應(yīng)用29新藥開(kāi)發(fā)和篩選PDX模型的應(yīng)用29PDX模型的應(yīng)用建立PDX模型進(jìn)行生物標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)來(lái)實(shí)驗(yàn)個(gè)性化治療

Tentler,J.J.etal.Nat.Rev.Clin.Oncol.(2012)30PDX模型的應(yīng)用建立PDX模型進(jìn)行生物標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)來(lái)實(shí)驗(yàn)個(gè)性PDX模型的應(yīng)用分子標(biāo)記物(Biomarker)的開(kāi)發(fā)流程31PDX模型的應(yīng)用分子標(biāo)記物(Biomarker)的開(kāi)發(fā)流程3PDX模型的應(yīng)用

Tentler,J.J.etal.Nat.Rev.Clin.Oncol.(2012)32PDX模型的應(yīng)用Tentler,J.J.etal.謝謝！33謝謝！33人源腫瘤異種移植(PDX)模型的建立、

分析和應(yīng)用FeiZhou人源腫瘤異種移植(PDX)模型的建立、

分析和應(yīng)用FeiZ腫瘤研究模型多樣化的腫瘤研究模型病人腫瘤組織/原代腫瘤細(xì)胞永生化的腫瘤細(xì)胞系2D和3D的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法（增殖/存活）來(lái)源于腫瘤細(xì)胞系的移植模型

來(lái)源于病人腫瘤組織的移植(PDX)模型

PatientDerivedTumorXenograft新35腫瘤研究模型多樣化的腫瘤研究模型新1傳統(tǒng)模型：腫瘤細(xì)胞系可以很方便的在體外進(jìn)行培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn)：在培養(yǎng)和傳代過(guò)程中進(jìn)行“篩選”，腫瘤細(xì)胞逐漸適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境而失去原有特性缺乏腫瘤相關(guān)的生長(zhǎng)環(huán)境支持性的非腫瘤基質(zhì)血液細(xì)胞，免疫系統(tǒng)的交互其他腫瘤微環(huán)境因子36傳統(tǒng)模型：腫瘤細(xì)胞系可以很方便的在體外進(jìn)行培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)2腫瘤研究模型使用傳統(tǒng)的腫瘤研究模型沒(méi)能取得臨床上的成功！腫瘤的多樣化和異質(zhì)性研究模型與臨床病人缺乏相關(guān)性37腫瘤研究模型使用傳統(tǒng)的腫瘤研究模型沒(méi)能取得臨床上的成功！3PDX模型技術(shù)流程圖ModifiedFigfromOncodesignBiotechnology38PDX模型技術(shù)流程圖ModifiedFigfromOn為什么使用PDX模型？?jī)?yōu)勢(shì)沒(méi)有體外培養(yǎng)的過(guò)程對(duì)腫瘤進(jìn)行“篩選”能搞保持腫瘤原有特性和異質(zhì)性在傳代過(guò)程中能夠保持分子生物學(xué)水平的穩(wěn)定保留了原有的非腫瘤基質(zhì)和微環(huán)境可以對(duì)多種狀態(tài)下病人來(lái)源的腫瘤進(jìn)行研究PDX模型和腫瘤病人有更好的對(duì)應(yīng)性！39為什么使用PDX模型？?jī)?yōu)勢(shì)PDX模型和腫瘤病人有更好的對(duì)應(yīng)性使用PDX模型劣勢(shì)仍然不能模擬腫瘤與免疫系統(tǒng)的交互可以在NSG小鼠模型中部分重建人源免疫系統(tǒng)在傳代過(guò)程中模型的非腫瘤基質(zhì)會(huì)被鼠源的基質(zhì)逐漸取代使用較低代數(shù)的PDX模型進(jìn)行研究需要相對(duì)便捷的臨床腫瘤樣本來(lái)源技術(shù)水平上有挑戰(zhàn)性移植+分析（包括生物信息學(xué)平臺(tái)）建立和維持的成本較高

相對(duì)的建成之后的使用價(jià)值也非常高40使用PDX模型劣勢(shì)6PDX模型的建立PDX模型的分析PDX模型的應(yīng)用41PDX模型的建立7PDX模型的建立關(guān)鍵點(diǎn)腫瘤宿主腫瘤接種腫瘤的凍存和復(fù)蘇42PDX模型的建立關(guān)鍵點(diǎn)8宿主品系小鼠品系免疫缺陷NudeT淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺失SCIDSevereCombinedImmunodeficiencyT淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞缺失NOD-SCIDNon-obeseDiabeticSCID與普通SCID相比NK細(xì)胞活性低，更低的免疫恢復(fù)幾率NSGNOD-SCID-IL2Rγ-/-缺失T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞43宿主品系小鼠品系免疫缺陷NudeT淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺失SCIDT宿主品系目前并沒(méi)有針對(duì)不同品系宿主的完整比較移植瘤生長(zhǎng)時(shí)間接種成功率移植瘤遺傳學(xué)特性移植瘤組織學(xué)特性移植瘤傳代的穩(wěn)定性模型建立情況與腫瘤類型相關(guān)荷瘤小鼠的飼養(yǎng)設(shè)施要求（常規(guī)為SPF級(jí)IVC飼養(yǎng)）完善的IACUC政策44宿主品系目前并沒(méi)有針對(duì)不同品系宿主的完整比較10腫瘤接種皮下接種NormanE.SharplessandRonaldA.DePinho,etal.NatureReviewDrugDiscovery200645腫瘤接種皮下接種NormanE.Sharplessan腫瘤接種使用套針(Trochar)進(jìn)行皮下腫瘤接種XiaomeiZhang,etal.CurrentProtocolsinMouseBiology201346腫瘤接種使用套針(Trochar)進(jìn)行皮下腫瘤接種Xiaom腫瘤接種原位接種常用途徑：腎包膜下接種(Sub-RenalCapsule,SRC)PeterEirew,etal.NatureProtocols201047腫瘤接種原位接種PeterEirew,etal.Na腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇凍存液胎牛血清+10%DMSO保存條件-80oC：6周液氮：長(zhǎng)期保存從凍存條件下復(fù)蘇37oC水浴快速解凍48腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇凍存液14腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇通過(guò)凍存和復(fù)蘇可以：在獲得患者知情同意書之前保存樣本保有備份樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)49腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇通過(guò)凍存和復(fù)蘇可以：15PDX模型的建立PDX模型的分析PDX模型的應(yīng)用50PDX模型的建立16PDX模型的分析目的說(shuō)明移植瘤與原瘤的相似性確認(rèn)移植瘤在傳代過(guò)程中的生物學(xué)穩(wěn)定為PDX模型的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐51PDX模型的分析目的17需要保存的材料基因組DNA使用代表性的腫瘤組織區(qū)域進(jìn)行DNA提取如：排除壞死區(qū)域等冷凍保存總RNA避免RNA酶污染，一般用試劑盒小心提取，冷凍保存包含mRNA和miRNA蛋白樣本（組織裂解液）處理時(shí)包含蛋白酶和磷酸酶抑制劑冷凍保存生物樣本庫(kù)52需要保存的材料基因組DNA生物樣本庫(kù)18分析內(nèi)容–常規(guī)臨床背景患者年齡/性別；腫瘤類別，原位瘤/轉(zhuǎn)移瘤；治療史移植瘤分析生長(zhǎng)曲線；藥理學(xué)特性針對(duì)特定藥物處理的反應(yīng)組織學(xué)和分子生物學(xué)分析原瘤vs.移植瘤53分析內(nèi)容–常規(guī)臨床背景19分析內(nèi)容–組織學(xué)病理學(xué)染色（HE染色）確認(rèn)腫瘤組織結(jié)構(gòu)頭頸癌PDX模型維持了原瘤的組織學(xué)特性Pengetal.JournalofTranslationalMedicine201354分析內(nèi)容–組織學(xué)病理學(xué)染色（HE染色）頭頸癌PDX模型維分析內(nèi)容–組織學(xué)免疫組織化學(xué)染色

（IHC）常規(guī)標(biāo)記（如細(xì)胞增殖、凋亡）移植的生物標(biāo)記物（Her2,EGFR,KRAS等蛋白）研究者感興趣的蛋白DongLin,etal.CancerRes2013神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌PDX模型維持了原瘤的蛋白標(biāo)記55分析內(nèi)容–組織學(xué)免疫組織化學(xué)染色（IHC）DongL分析內(nèi)容–組織學(xué)組織芯片(TissueMicro-Array,TMA)GuidoSauter,etal.NatureReviewDrugDiscovery200356分析內(nèi)容–組織學(xué)組織芯片(TissueMicro-Ar分析內(nèi)容–分子水平DNA基因序列

第二代測(cè)序平臺(tái)：IlluminaHiSeq等基因突變SequenomOncoCarta?PanelsV1-3V1：涵蓋19個(gè)常規(guī)癌基因的238個(gè)突變位點(diǎn)V2：涵蓋18個(gè)癌基因或癌抑制基因的152個(gè)突變位點(diǎn)V3:：涵蓋22個(gè)癌基因的105個(gè)突變位點(diǎn)整理過(guò)的基因突變數(shù)據(jù)57分析內(nèi)容–分子水平DNA23分析內(nèi)容–分子水平外顯子組測(cè)序外顯子捕獲RocheSeqCapEZAgilentSureSelectIlluminaTruSeq使用第二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行外顯子組測(cè)序需要有整合的生物信息學(xué)分析平臺(tái)針對(duì)PDX模型對(duì)二代測(cè)序結(jié)果分析進(jìn)行優(yōu)化對(duì)識(shí)別變體的方法進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證根據(jù)需要開(kāi)發(fā)個(gè)性化的數(shù)據(jù)分析方法58分析內(nèi)容–分子水平外顯子組測(cè)序24分析內(nèi)容–分子水平外顯子組測(cè)序右圖為Oncotest公司使用外顯子組測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析方法整理出的23個(gè)PDX模型中507個(gè)癌癥相關(guān)基因的突變頻率。每一個(gè)扇區(qū)代表了一種腫瘤類型；熱度圖指示了該腫瘤類型中某個(gè)基因的突變頻率。Krzywinsky,M.etal.Circos:anInformationAestheticforComparativeGenomics,GenomeRes(2009)