發(fā)酵工程技術制藥

關于發(fā)酵工程技術制藥第一頁，共六十九頁，2022年，8月28日一、發(fā)酵生產過程生產用菌種--------原始材料--------培養(yǎng)基------程序-------生產細則-------以青霉素為例講解第二頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）青霉素（penicillin）所用菌種---黃青霉菌原始材料---α-氨基已二酸、半胱氨酸、纈氨酸。發(fā)酵方法----加前體物質的深層發(fā)酵法。青霉素發(fā)現者弗萊明第三頁，共六十九頁，2022年，8月28日沙土管菌種↓轉移到固體瓊脂斜面培養(yǎng)基上，24℃培養(yǎng)5-6天，獲得芽孢↓芽孢懸浮于無菌水中，進行搖瓶培養(yǎng)↓進入移種瓶培養(yǎng)↓進種子罐，接種量為5%-10%↓進繁殖罐，28℃培養(yǎng)48-96小時↓進入發(fā)酵罐，開始生產?！氖竭^濾↓第一次萃取器↓純化柱↓第二次萃取器↓第三次萃取器↓真空結晶釜↓瓷過濾器↓結晶洗滌釜↓真空干燥器（結束）程序第四頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）使用消沫劑，由于發(fā)酵過程中產生大量的CO2，會產生大量泡沫?？刹捎弥参镉汀⒍褂?、合成消沫劑進行消沫處理。（2）溫度控制在24-30℃、PH值控制在6.8--7.2。（3）應該注意控制殘?zhí)橇?、還原糖量、PH值、氨、氮、溶解氧量。（4）發(fā)酵過程中要注意通氣攪拌，所通入的空氣必須是無菌的。（5）發(fā)酵罐必須保持正壓（20-30kPa），以防罐外不潔凈的空氣流入。（6）目前國際上青霉素發(fā)酵的水平已經達到8萬多單位/ml，相當于50g/L。生產細則第五頁，共六十九頁，2022年，8月28日二、滅菌技術滅菌操作是為了保證雜菌不進入工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)。（一）滅菌項目（二）滅菌方法（三）滅菌的矛盾之處（四）具體的滅菌技術第六頁，共六十九頁，2022年，8月28日（一）滅菌項目1、在投入生產之前，必須對設備、管道進行徹底清洗、和嚴格滅菌。2、對通入的培養(yǎng)基、通入的空氣進行先行滅菌。

第七頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）滅菌方法

2、化學法1、加熱法3、輻射法4、過濾法第八頁，共六十九頁，2022年，8月28日（三）滅菌的矛盾之處對殺滅細菌的同時1、培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也隨之遭到分解和破壞。

2、殺死雜菌的同時也殺死了工程細菌。

第九頁，共六十九頁，2022年，8月28日（四）具體的滅菌技術可分為6種技術：1、間歇滅菌法2、加熱滅菌法3、連續(xù)滅菌法4、空氣加熱滅菌法5、空氣過濾滅菌法6、營養(yǎng)物質瞬時高溫殺菌法第十頁，共六十九頁，2022年，8月28日1：間歇滅菌法又稱為分批滅菌，是指將培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐內，然后連罐加熱到規(guī)定的滅菌溫度。

（1）滅菌方法（2）注意事項（3）間歇滅菌法的優(yōu)點第十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）滅菌方法間歇滅菌的操作過程分為3個過程：加熱----保溫維持----冷卻。這些不同的階段，均能夠起到滅菌的作用。然而，在滅菌過程中，保溫殺菌的作用是主要的，冷卻殺菌的作用最小。第十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）注意事項應當避免過長的加熱時間，否則常常會破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質。系統(tǒng)經過滅菌操作之后，必須達到不留1個雜菌，否則，只要經過1晝夜的增殖，1個雜菌就會增加到272個雜菌，最后會導致整批發(fā)酵液的失敗。

第十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日（3）間歇滅菌法的優(yōu)點設備造價低廉。便于進行手動操作。

第十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日2：加熱滅菌法隧道滅菌箱設備第十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日3：連續(xù)滅菌法（1）定義（2）技術分類（3）連續(xù)滅菌法的優(yōu)點（4）連續(xù)滅菌法的不足第十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）定義連續(xù)滅菌法是指滅菌的操作的加熱、保溫維持、冷卻這三個過程，在同一時間內進行。因此，在連續(xù)滅菌系統(tǒng)中，需要分別設置加熱設備、保溫維持設備、冷卻設備。第十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）技術分類連續(xù)滅菌法可以分為2種：（1）加熱、冷卻緩慢交替進行方法。（2）迅速升溫+閃急冷卻方法-----這種方法稱為HTST方法，這對于保證營養(yǎng)物質極為有利。第十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日（3）連續(xù)滅菌法的優(yōu)點（1）可減少培養(yǎng)劑中營養(yǎng)物質的損失、提高產物收率。（2）由于操作條件恒定，可以獲得穩(wěn)定的滅菌質量。（3）容易實現自控操作。（4）能夠避免系統(tǒng)的反復加熱和冷卻，可提高熱利用率。是目前很多制藥廠經常采用的方法。第十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日（4）連續(xù)滅菌法的不足（1）投資較大，

（2）需要同時設置加熱、冷卻裝置。

第二十頁，共六十九頁，2022年，8月28日4：空氣加熱滅菌法利用空氣壓縮時產生的高溫，使得微生物體內的蛋白質變性，而達到殺菌目的，這種方法稱為空氣加熱滅菌法。

不同溫度下的空氣細菌存活時間：

200℃/15.1s，250℃/5.1s，

300℃/2.1s，350℃/1.05s。干熱殺菌的流程通常是：先采用廢熱，將空氣預熱到60-70℃，然后進入壓縮機壓縮，并在200℃以上的溫度維持一段時間。以便殺死雜菌，然后再進入發(fā)酵罐之中。第二十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日5：空氣過濾滅菌法是指讓空氣通過過濾介質，以阻截空氣中所含的微生物，取得無菌空氣的目的。

空氣過濾分為2種：（1）絕對過濾（2）深層過濾陶瓷過濾機第二十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）絕對過濾如超濾膜過濾就屬于絕對過濾是指所用濾膜的孔徑小于空氣中的固體顆粒。從而把顆粒截留。第二十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）深層過濾是憑借濾層內的曲折通道，而將顆粒截留的方法。它不要求濾膜的孔徑小于空氣中的固體顆粒。這是目前發(fā)酵工業(yè)常用的過濾除菌方法。深層過濾所用的過濾介質-------棉花、活性碳、玻璃纖維、合成纖維、各種有機或無機的燒結材料（燒結金屬、燒結陶瓷、燒結塑料、蒙乃爾合金粉燒結板）、超細玻璃纖維、超細玻璃纖維過濾紙，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA過濾板、PVA燒結板等已經在日本的發(fā)酵工業(yè)中廣泛應用）。第二十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日6：營養(yǎng)物質瞬時高溫殺菌法一般來說，當溫度升高時，微生物死亡速率的增加>>營養(yǎng)物質遭到破壞的速率。因此，對于瞬時的高溫，細菌常常被殺死，而營養(yǎng)物質則破壞得不多。根據這一原理，可以采用營養(yǎng)物質瞬時高溫殺菌法進行殺菌操作。第二十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日三、分離純化技術微生物的發(fā)酵產物是一種混合物，里面除了含有主要產物以外，還含有未能轉化的基質和底物、殘余的原料、大量的水、微生物細胞、各種雜質。因此，必須對發(fā)酵產物進行分離和純化。

分離和純化過程被稱作“下游加工過程”，需要經過以下這幾個階段：

（一）固體物質的去除，

（二）初步分離，

（三）產品提純，

（四）產品的最終分離。第二十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日（一）固體物質的去除1、目的2、常用的方法有3、常用的設備

4、固體物質的前期預處理技術第二十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日1、目的（1）分離出完整的細胞。（2）將細胞進行溶菌處理，提取細胞內的生物產品。（3）除去細胞有殘留碎片。（4）除去沒有轉化的不溶性基質。（5）一部分細胞返回到反應器內，進行再循環(huán)操作。第二十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日2、常用的方法（1）過濾法------分批過濾、連續(xù)真空過濾、錯流流動過濾。

錯流流動過濾法------使液體平等于過濾膜的表面進行流動，這樣能夠不斷地移去在濾膜表面積累的細胞物質，從而獲得近似于恒定的過濾速率。（2）離心分離法------垂直式離心、水平式離心。（3）沉降法------與一般的自由沉降不同，工業(yè)生產過程的沉降都屬于干擾式沉降。第二十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日3、常用的設備（1）過濾設備------板框過濾機、回轉真空過濾機（2）離心設備-------轉籃式離心過濾機（三足式離心過濾機）、刮刀卸料式離心過濾機、沉降式離心過濾機、噴霧離心過濾機、間斷排料式離心過濾機、傾析式離心過濾機。（3）沉降設備------管式離心沉降機。第三十頁，共六十九頁，2022年，8月28日4、固體物質的前期預處理技術由于生物反應液的粘度很大，直接分離往往比較困難，因此，常常對其進行預先的前期處理，來提高分離效果。常見的預處理技術有：

（1）使細胞老化凝聚成團，

（2）加熱，

（3）改變PH值，

（4）添加化學物質促進凝聚，如加入高分子電解質、氯化鈣、膠態(tài)粘士。第三十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）初步分離進一步把已經分離的溶液濃縮，提高目的產物濃度的方法，稱為初步分離。初步分離的具體方法可以分為：1、蒸發(fā)2、萃取3、沉淀4、膜分離第三十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日1、蒸發(fā)蒸發(fā)是通過加熱，使溶液中的水經過汽化除去要提高溶質濃度、為溶質的析出創(chuàng)造條件的一種操作方法。各種代謝物，如氨基酸、抗生素、酶都可以進行蒸發(fā)操作。由于生物產品大多數是熱敏性物質，所以物料在蒸發(fā)器內的停留時間必須盡可能短，同時，還應該晝避免局部液體過熱。第三十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日LG系列離心式刮板薄膜蒸發(fā)器示意圖蒸發(fā)設備

（1）連續(xù)流動膜式蒸發(fā)器，

（2）長管膜式蒸發(fā)器，

（3）強制膜式蒸發(fā)器，

（4）離心膜蒸發(fā)器。第三十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日2、萃取萃取是通過物質在2種溶液之間不同的溶解度，來實現分離的操作方法。萃取的分類（1）有機溶劑萃?。?）雙水相萃取第三十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）有機溶劑萃取許多抗生素都能夠溶解在有機溶劑之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通過萃取，可使得抗生素從水相進入有機相之中，從而實現分離。由于抗生素在有機溶劑之中極不穩(wěn)定，因此，在保證萃取效率的前提條件下，必須盡量縮短操作時間。有機溶劑萃取設備可使用Podbielniak離心萃取機。第三十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日SFT-150超臨界萃取反應儀利用萃取法來提取抗生素，具有質量好、收率高、速度快的優(yōu)點。雙水相萃取法，目前用于進行酶、和蛋白質的提取工藝。第三十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）雙水相萃取使用2種互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分別將它們溶于水中形成雙水相，利用目的產物在雙水相中不同的分配系數而實現分離的方法，稱為雙水相萃取。萃取之后的目的產物可以通過超濾法進行提純。雙水相萃取材料--------（1）PEG--葡聚糖萃取系統(tǒng)，（2）PEG—磷酸鉀萃取系統(tǒng)。第三十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日3、沉淀蛋白質在溶液中具有“等電點”的特性，而且其等電點與溶液PH值有關，PH值大，蛋白質呈負電，PH值小，蛋白質呈正電，當PH=pI（等電點）時，蛋白質不帶電荷。蛋白質在PI時的溶解度最小。這是因為蛋白質在水中有均勻分布是由于同性電荷相斥的緣故，當PH=pI時，由于蛋白質分子不帶電荷，于是開始相互凝聚、產生沉淀。第三十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日NSG-630濃縮分離機ZHN系列真空濃縮罐第四十頁，共六十九頁，2022年，8月28日沉淀和鹽折的結合由于沉淀常常導致蛋白質變性而失效。而利用鹽溶液就能避免蛋白質的變性，這種方法就稱為------鹽析法。在不同的鹽溶液之中，蛋白質有鹽析效應有所不同。按下列順序遞減：

（1）陰離子------檸檬酸鹽-3、酒石酸鹽-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸鹽-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。

（2）陽離子-------Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。從離子物性來看，硫酸銨并不是鹽析效應最強的鹽類，但是由于它在水中的溶解度極大，對鹽析十分有利，因此硫酸銨是目前最常用的鹽析劑。第四十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日4、膜分離膜分離技術是基于一種半透性薄膜，它能夠使得溶液中的某些組分通過，而阻止和截留其它組分的分離方法。膜分離的優(yōu)點

（1）由于膜分離是純粹物質粒度大小這一幾何特性來進行分離，它不必象萃取、沉淀法那樣需加入其它化學物質、也不必象蒸發(fā)那樣進行加熱。因此，產物的生物學特性能夠得到完好的保存，

（2）產物的損失量很少，有利于提高得率。膜分離的分類（1）反滲透法（2）超濾法第四十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）反滲透法根據物理化學的原理，當含有溶質A的溶液B與另一滲透液C之間被半透膜隔開的時候，由于系統(tǒng)滲透壓的作用，滲透液C便會進入到溶液B之中，這種現象稱為滲透現象。形成這種滲透的壓力就自然稱為滲透壓（π）如果在溶液B一方施加壓力（⊿P），發(fā)現滲透液C進入溶液B的速率就會減小。

當壓力（⊿P）=滲透壓（π）時，滲透現象就會停止。當壓力（⊿P）>滲透壓（π）時，就會看到溶液B開始反向進入滲透液C之中，這種現象就稱為反滲透現象。根據溶液所具有的反滲透特性，可以實現溶液的濃縮。第四十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）超濾法是指在反滲透的基礎之上，將隔離膜由原來的半透膜，改成帶有較大孔徑的薄膜。這樣一來，在反滲透操作過程中，不但是溶劑進入到滲透液之中，就連那些許多小分子的雜質也連帶一起進入到滲透液之中。

與反滲透法相比，超濾法明顯具有其優(yōu)點-------反滲透法只能起到濃縮作用，而超濾法在濃縮的同時，還具有純化作用。第四十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日反滲透法+超濾法的實際應用（1）主要用于蛋白質溶液的濃縮、脫鹽等步驟，

（2）在疫苗、血漿等生產中也常被使用。

膜分離裝置的分類

（1）中空纖維束，

（2）板-框膜分離裝置，

（3）螺旋狀膜分離裝置反滲透裝置第四十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日（三）產品提純層析法，是指在一根層析柱內，填充某種特殊的載體物質，稱為固定相。含有待分離產物的溶液則稱為流動相。當流動相流過固定相的時候，由于流動相中不同的物質與固定相之間產生了不同強度的結合力，因此各種物質在層析柱內停留的時間也各不相同，結果，它們將依次序的先后流出層析柱。層析法的分類

1、吸附層析法

2、離子交換層析法

3、凝膠層析法（分子篩）

4、親的層析法第四十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日1、吸附層析法吸附層析法是利用各種物質與固定相之間由于吸附力的差異、而產生不同的結合力的原理，所進行的層析操作。固定相對溶質產生結合力，這種結合力是以離子鍵、氫鍵、范德華力所產生的。而流動相的洗脫作用又對溶質和固定相之間產生脫離作用。這樣，吸附—脫離—再吸附—再脫離，導致溶質沿著洗脫液的方向移動。其移動速率取決于固定相對溶質的吸附能力，吸附力弱，移動就快，吸附力強，移動就慢。第四十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日2、離子交換層析法（1）基本原理（2）離子交換過程（3）常用的離子交換樹脂（4）離子交換層析法的應用第四十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）基本原理采用離子交換樹脂作為固定相，離子交換樹脂本身具有正離子基團和負離子基團，

酸性電離基團可以交換陽離子，稱為陽離子交換樹脂。

堿性電離基團可以交換陰離子，稱為陰離子交換樹脂。

離子交換樹脂同時具備極性基團和非極性基團。極性基團不斷地與溶液中的離子進行交換，而非極性基團則構成樹脂分子的骨架，起支撐作用。第四十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）離子交換過程是一個同時包含吸附+吸收+穿透+擴散+離子交換+離子親和，等等物理化學過程的綜合作用的結果。溶液中的溶質離子擴散到樹脂的表面溶質離子穿透樹脂的表面擴散到樹脂顆粒的內部溶質離子與樹脂離子發(fā)生交換樹脂離子穿透樹脂的表面樹脂離子擴散到溶液之中第五十頁，共六十九頁，2022年，8月28日（3）常用的離子交換樹脂（1）羧甲基纖維素陽離子交換樹脂（CM-纖維素）------當陽離子蛋白質流經交換樹脂時，由于靜電吸引的作用，蛋白質將與樹脂結合，然后用緩沖液進行沖洗交換柱，結合力最弱的蛋白質首先被洗脫下來。不同的緩沖液將各處洗脫“撿到”其中的某一蛋白質組分。（2）二乙氨乙基纖維素陰離子交換樹脂（DEAE-纖維素）--------原理與CM-纖維素交換原理相同。第五十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日（4）離子交換層析法的應用離子交換層析法具有收率高、質量好、周期短、成本低、設備簡單、適合工業(yè)化生產等優(yōu)點。目前已經普遍應用于生物化學制藥行業(yè)。離子交換柱第五十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日3、凝膠層析法（1）基本原理（2）常用的凝膠層析材料（3）凝膠層析的應用價值第五十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）基本原理凝膠層析也稱為凝膠過濾、分子篩層析、排陰層析、凝膠滲透層析等等。凝膠是一種具有多孔的、網狀結構的分子篩。每一個顆粒就相當于一個篩子。當樣品通過凝膠層析柱時，分子量較大的物質由于直徑大于凝膠網孔，它們沿著凝膠顆料的間隙流動，因此速度較快而首先流出層析柱。相反，分子量較小的物質可以自由地進出凝膠網孔，它們不斷地在凝膠顆粒之中來回流動，從而導致進出速度下降。第五十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）常用的凝膠層析材料（1）葡聚糖凝膠，

（2）聚丙烯酰胺凝膠。AM90-1型凝膠層析儀第五十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日（3）凝膠層析的應用價值（1）可用于分離和提純蛋白質、酶、多肽、激素、多糖、核酸等物質。能徹底分離分子量相差只有25%的二種蛋白質。

（2）凝膠層析具有設備簡單、分離迅速、不影響產物的分子生物學特性等優(yōu)點。第五十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日4、親和層析法是利用生物分子之間所具有的專一親和力而設計出的一種層析方法。（1）親和層析的原理（2）親和層析的例子

第五十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）親和層析的原理（1）載體活化------將載體在堿性條件下用溴化氫（CNBr）進行活化。

（2）通過偶聯反應制成親的吸附劑-------將某一種能夠與生物分子進行可逆性結合的物質（稱作配基）通過偶聯反應聯結到載體上，

（3）含有生物分子的樣品通過層析柱。

（4）生物分子與配基結合而被吸附，

（5）未能進行特異性結合的其它雜蛋白，通過洗滌而流出層析柱。第五十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）親和層析的例子層析目的----分離DNA解聚酶層析方法----以珠狀的瓊脂糖、或者聚丙烯酰胺作為載體，以DNA解聚酶的抑制物作為配基層析結果----

（1）DNA解聚酶被特異性地結合在層析柱上，

（2）其它物質全部流出

（3）最后用適當的洗脫液通過層析柱，可獲得純度極高的DNA解聚酶第五十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日四、干燥技術干燥操作往往是生物產品生產的最后一步，干燥的目的就在于除去物料中的水分，便于保藏和運輸。干燥注意事項--------由于生物產品多數為熱敏性物質，所以干燥過程必須注意使用那些干燥時間不太長、干燥溫度不過高的設備。干燥技術和設備---------（一）噴霧干燥（二）氣流干燥（三）沸騰干燥（四）鼓式干燥（五）冷凍干燥第六十頁，共六十九頁，2022年，8月28日（一）噴霧干燥噴霧干燥是利用不同的噴霧裝置，如噴嘴、或者轉盤，將濃縮液或者懸浮液噴成霧狀，使它們形成具有極大表面積的分散液滴，在干燥室內緩緩沉降，并與熱空氣流發(fā)生強烈的熱交換，在幾秒到幾十秒之內得到迅速干燥的方法。噴霧干燥由于干燥時間極短、避免了生物產品活性的破壞，適用于抗生素、酶制劑、熱不穩(wěn)定性蛋白質的干燥。高速離心噴霧干燥機第六十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）氣流干燥是利用顆粒在氣流中能夠自由流動的特性，使物料與氣流一起流經一段長的管