色譜分析法導(dǎo)論課件

高效液相色譜法

HighPerformanceLiquidChromatography

高效液相色譜法

HighPerformanceLiqui高效液相色譜法（HPLC）概述

高效液相色譜法

■高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；吸附色譜(液固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。此外，還有親和色譜、平板色譜(薄層色譜)等。■早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑1~5cm,長(zhǎng)50~500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在150~200μm范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低(<1mL/min)，分析時(shí)間仍然很長(zhǎng)！高效液相色譜法（HPLC）概述高效液相色譜法高效液相色譜法（HPLC）概述

■當(dāng)加壓增加流速(真空或空氣泵)時(shí)，盡管分析時(shí)間減少，但柱塔板高度Hmin也相應(yīng)增加了！或者說(shuō)柱效下降了。

■為了解決分析時(shí)間及柱效問(wèn)題，人們認(rèn)識(shí)到：最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑（3~10μm）！

■直到60年代，由于在高壓下操作的液壓設(shè)備、高效固定相以及高靈敏檢測(cè)器的出現(xiàn)及發(fā)展，才徹底解決了分析時(shí)間及柱效的問(wèn)題。即所謂的高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛應(yīng)用。H=A+B/u+c·u高效液相色譜法（HPLC）概述■當(dāng)加壓增加流速(真空或空氣■高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。■高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離?！龈哽`敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測(cè)器——10-11g。高效液相色譜的特點(diǎn)■高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大大增加，分析速度極快■分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類(lèi)物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%?！隽鲃?dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用小；HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機(jī)會(huì)多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)分離?！霾僮鳒囟龋篏C需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。結(jié)論：從色譜分析的發(fā)展來(lái)看，HPLC比GC更為有用、更具發(fā)展前途！HPLC與GC的比較■分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而HPLC的應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域分析對(duì)象舉例環(huán)境常見(jiàn)無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、硝基化合物、有害重金屬及其形態(tài)、除草劑、農(nóng)藥、酸沉降成分。農(nóng)業(yè)土壤礦物成分、肥料、飼料添加劑、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中無(wú)機(jī)和有機(jī)成分。石油烴類(lèi)族組成、石油中微量成分?；o(wú)機(jī)化工產(chǎn)品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料。材料液晶材料、合成高分子材料。食品無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、有機(jī)酸、氨基酸、糖、維生素、脂肪酸、香料、甜味劑、防腐劑、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烴、農(nóng)獸藥殘留。生物氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子。醫(yī)藥人體化學(xué)成分、各類(lèi)合成藥物成分、各種天然植物和動(dòng)物藥物化學(xué)成分。HPLC的應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域分析對(duì)象舉例環(huán)境常見(jiàn)無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、多環(huán)HPLC儀器包括：■

1.高壓輸液裝置;■

2.進(jìn)樣系統(tǒng);■

3.分離系統(tǒng);■

4.檢測(cè)系統(tǒng);此外還配有梯度洗脫、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)收集和數(shù)據(jù)處理裝置等。HPLC儀器HPLC儀器包括：HPLC儀器HPLC儀器HPLC儀器高壓輸液系統(tǒng)150～350×105Pa■貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器(Ni合金)，其孔徑約2μm，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去（氣泡會(huì)影響檢測(cè)）。高壓輸液系統(tǒng)150～350×105Pa■貯液器：1-2L的玻高壓泵：對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕?！鲚斠罕梅N類(lèi)：恒壓型和恒流型。

■恒壓泵(類(lèi)似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。

■恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無(wú)關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是往復(fù)式恒流泵。高壓輸液泵高壓泵：對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范往復(fù)式恒流泵往復(fù)式恒流泵在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。梯度洗脫■線性梯度：在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。

■階梯梯度：直接從某一低強(qiáng)度的流動(dòng)相改變?yōu)榱硪惠^高強(qiáng)度的流動(dòng)相。梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)，因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問(wèn)題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些■高壓梯度：一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的。高壓梯度系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是，只要通過(guò)梯度程序控制器控制每臺(tái)泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。其主要缺點(diǎn)是使用了兩臺(tái)高壓輸液泵，使儀器價(jià)格變得更昂貴，故障率也相對(duì)較高，而且只能實(shí)現(xiàn)二元梯度操作。高壓梯度■高壓梯度：一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的低壓梯度■低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。多元梯度泵的流路可以部分空置。低壓梯度■低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對(duì)要小些。即，HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器的死體積。進(jìn)樣裝置包括兩種。■1）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。■2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。進(jìn)樣系統(tǒng)與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生色譜柱色譜柱的構(gòu)成色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。

色譜填料：經(jīng)過(guò)制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。

色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm。

色譜柱：是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的,其結(jié)構(gòu)如圖所示。色譜柱色譜柱的構(gòu)成■紫外-可見(jiàn)光（UV-VIS）檢測(cè)器

原理：基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見(jiàn)光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。

很多有機(jī)分子都具紫外或可見(jiàn)光吸收基團(tuán)，有較強(qiáng)的紫外或可見(jiàn)光吸收能力，因此UV-VIS檢測(cè)器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對(duì)環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV-VIS檢測(cè)器。

用UV-VIS檢測(cè)時(shí)，為了得到高的靈敏度，常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長(zhǎng)作檢測(cè)波長(zhǎng)，但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長(zhǎng)，另外，應(yīng)盡可能選擇在檢測(cè)波長(zhǎng)下沒(méi)有背景吸收的流動(dòng)相。檢測(cè)器■紫外-可見(jiàn)光（UV-VIS）檢測(cè)器

原理：基于Lambe檢測(cè)器■二極管陣列檢測(cè)器（diode-arraydetector,DAD）：以光電二極管陣列作為檢測(cè)元件的UV-VIS檢測(cè)器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。檢測(cè)器■二極管陣列檢測(cè)器（diode-arraydetec■熒光檢測(cè)器許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。檢測(cè)器■熒光檢測(cè)器檢測(cè)器HPLC組成介紹HPLC組成介紹分配色譜■1.原理：根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過(guò)程。■2.流動(dòng)相:HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說(shuō)二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。高效液相色譜方法分配色譜高效液相色譜方法■3固定相原則上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：β,β’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撐二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鯊?fù)?SQ)。根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛。1）機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過(guò)機(jī)械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相。■3固定相2）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)理既不是簡(jiǎn)單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之?；瘜W(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對(duì)多數(shù)鍵合相來(lái)說(shuō)，以分配機(jī)理為主。通常，化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：2）化學(xué)鍵合固定相C18填料的合成C18填料的合成C18填料的合成C18填料的合成正相和反相鍵合色譜法正相和反相鍵合色譜法色譜分析法導(dǎo)論課件正相和反相鍵合色譜法正相和反相鍵合色譜法注意：“失浸潤(rùn)”現(xiàn)象注意：“失浸潤(rùn)”現(xiàn)象液相色譜分離模式的選擇液相色譜分離模式的選擇分析方法分析方法分析條件的選擇分析條件的選擇色譜分析法導(dǎo)論課件色譜分析法導(dǎo)論課件實(shí)例實(shí)例實(shí)例改變K’實(shí)例改變K’實(shí)例改變選擇性α實(shí)例改變選擇性α實(shí)例離子抑制：PH值的影響實(shí)例離子抑制：PH值的影響梯度梯度其它方面其它方面作業(yè)作業(yè)ThankYou!ThankYou!高效液相色譜法

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高效液相色譜法

■高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；吸附色譜(液固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。此外，還有親和色譜、平板色譜(薄層色譜)等?！鲈缙谝合嗌V，包括Tswett的工作，都是在直徑1~5cm,長(zhǎng)50~500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在150~200μm范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低(<1mL/min)，分析時(shí)間仍然很長(zhǎng)！高效液相色譜法（HPLC）概述高效液相色譜法高效液相色譜法（HPLC）概述

■當(dāng)加壓增加流速(真空或空氣泵)時(shí)，盡管分析時(shí)間減少，但柱塔板高度Hmin也相應(yīng)增加了！或者說(shuō)柱效下降了。

■為了解決分析時(shí)間及柱效問(wèn)題，人們認(rèn)識(shí)到：最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑（3~10μm）！

■直到60年代，由于在高壓下操作的液壓設(shè)備、高效固定相以及高靈敏檢測(cè)器的出現(xiàn)及發(fā)展，才徹底解決了分析時(shí)間及柱效的問(wèn)題。即所謂的高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛應(yīng)用。H=A+B/u+c·u高效液相色譜法（HPLC）概述■當(dāng)加壓增加流速(真空或空氣■高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)?！龈咝В禾畛湮镱w粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離?！龈哽`敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測(cè)器——10-11g。高效液相色譜的特點(diǎn)■高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大大增加，分析速度極快■分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類(lèi)物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。■流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用??；HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機(jī)會(huì)多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)分離。■操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。結(jié)論：從色譜分析的發(fā)展來(lái)看，HPLC比GC更為有用、更具發(fā)展前途！HPLC與GC的比較■分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而HPLC的應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域分析對(duì)象舉例環(huán)境常見(jiàn)無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、硝基化合物、有害重金屬及其形態(tài)、除草劑、農(nóng)藥、酸沉降成分。農(nóng)業(yè)土壤礦物成分、肥料、飼料添加劑、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中無(wú)機(jī)和有機(jī)成分。石油烴類(lèi)族組成、石油中微量成分?；o(wú)機(jī)化工產(chǎn)品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料。材料液晶材料、合成高分子材料。食品無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、有機(jī)酸、氨基酸、糖、維生素、脂肪酸、香料、甜味劑、防腐劑、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烴、農(nóng)獸藥殘留。生物氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子。醫(yī)藥人體化學(xué)成分、各類(lèi)合成藥物成分、各種天然植物和動(dòng)物藥物化學(xué)成分。HPLC的應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域分析對(duì)象舉例環(huán)境常見(jiàn)無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、多環(huán)HPLC儀器包括：■

1.高壓輸液裝置;■

2.進(jìn)樣系統(tǒng);■

3.分離系統(tǒng);■

4.檢測(cè)系統(tǒng);此外還配有梯度洗脫、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)收集和數(shù)據(jù)處理裝置等。HPLC儀器HPLC儀器包括：HPLC儀器HPLC儀器HPLC儀器高壓輸液系統(tǒng)150～350×105Pa■貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器(Ni合金)，其孔徑約2μm，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去（氣泡會(huì)影響檢測(cè)）。高壓輸液系統(tǒng)150～350×105Pa■貯液器：1-2L的玻高壓泵：對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。■輸液泵種類(lèi)：恒壓型和恒流型。

■恒壓泵(類(lèi)似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。

■恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無(wú)關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是往復(fù)式恒流泵。高壓輸液泵高壓泵：對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范往復(fù)式恒流泵往復(fù)式恒流泵在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。梯度洗脫■線性梯度：在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。

■階梯梯度：直接從某一低強(qiáng)度的流動(dòng)相改變?yōu)榱硪惠^高強(qiáng)度的流動(dòng)相。梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)，因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問(wèn)題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些■高壓梯度：一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的。高壓梯度系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是，只要通過(guò)梯度程序控制器控制每臺(tái)泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。其主要缺點(diǎn)是使用了兩臺(tái)高壓輸液泵，使儀器價(jià)格變得更昂貴，故障率也相對(duì)較高，而且只能實(shí)現(xiàn)二元梯度操作。高壓梯度■高壓梯度：一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的低壓梯度■低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。多元梯度泵的流路可以部分空置。低壓梯度■低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對(duì)要小些。即，HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器的死體積。進(jìn)樣裝置包括兩種?！?）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。■2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。進(jìn)樣系統(tǒng)與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生色譜柱色譜柱的構(gòu)成色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。

色譜填料：經(jīng)過(guò)制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。

色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm。

色譜柱：是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的,其結(jié)構(gòu)如圖所示。色譜柱色譜柱的構(gòu)成■紫外-可見(jiàn)光（UV-VIS）檢測(cè)器

原理：基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見(jiàn)光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。

很多有機(jī)分子都具紫外或可見(jiàn)光吸收基團(tuán)，有較強(qiáng)的紫外或可見(jiàn)光吸收能力，因此UV-VIS檢測(cè)器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對(duì)環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV-VIS檢測(cè)器。

用UV-VIS檢測(cè)時(shí)，為了得到高的靈敏度，常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長(zhǎng)作檢測(cè)波長(zhǎng)，但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長(zhǎng)，另外，應(yīng)盡可能選擇在檢測(cè)波長(zhǎng)下沒(méi)有背景吸收的流動(dòng)相。檢測(cè)器■紫外-可見(jiàn)光（UV-VIS）檢測(cè)器

原理：基于Lambe檢測(cè)器■二極管陣列檢測(cè)器（diode-arraydetector,DAD）：以光電二極管陣列作為檢測(cè)元件的UV-VIS檢測(cè)器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。檢測(cè)器■二極管陣列檢測(cè)器（diode-arraydetec■熒光檢測(cè)器許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。檢測(cè)器■熒光檢測(cè)器檢測(cè)器HPLC組成介紹HPLC組成介紹分配色譜■1.原理：根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的