蒼術揮發(fā)油化學成分及其抗菌活性的研究

時珍國醫(yī)國藥2011年第22卷第3期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL．22NO．3［8］KlschH，LütjohannD，LudwigM，etal．Polymorphisminthecho-lesterol24S－h(huán)ydroxylasegeneisassociatedwithAlzheimer＇sdisease．MolPsychiatry．2002，7（8）：899．［9］BorroniB，ArchettiS，AgostiC，etal．IntronicCYP46polymorphismalongwithApoEgenotypeinsporadicAlzheimerDisease：fromriskfac-2004，25（6）：747．torstodiseasemodulators［J］．NeurobiolAging，［10］LaunerLJ，WhiteLR，PetrovitchH，etal．Cholesterolandneuro-pathologicmarkersofAD：apopulation－basedautopsystudy［J］．Neurology，2001，23（8）：1447．［11］RefoloLM，PappollaMA，LaFrancoisJ，etal．Acholesterol－loweringdrugreducesbeta－amyloidpathologyinatransgenicmousemodelofJ］．NeurobiolDis，2001，8（5）：890．Alzheimer＇sdisease［［12］SimonsM，KellerP，DeStrooperB，etal．Cholesteroldepletioninhib-itsthegenerationofbeta－amyloidinhippocampalneurons［J］．ProcNatlAcadSciUSA，1998，26（11）：6460．［13］FrearsER，StephensDJ，WaltersCE，etal．Theroleofcholesterolinthebiosynthesisofbeta－amyloid．Neuroreport，1999，3；10（8）：1699．［14］WolozinB．Cholesterol，statinsanddementia［J］．CurrOpinLipidol，2004，15（6）：667．［15］王懷星，賴世隆，孫景波．補腎益智方治療老年性癡呆模型大鼠J］．中國中西醫(yī)結合雜志，2000，20（10）：771．的行為學測試［［16］耿勁松，周愛玲，茅家慧，等．腦益康對AD大鼠學習記憶及海馬NGF－TrkAmRNA表達的影響［J］．中國老年學雜志，2009，29（2）：152．［17］余銳，肖飛，李曉光，等．去癡靈脂溶性提取物血清抑制M146L細胞分泌β淀粉樣蛋白［J］．中國新藥雜志，2006，15（13）：1061．［18］張建民，胡愉，王紅，等．中藥復方CHPⅡ?qū)DAPPV717Ⅰ轉．解剖學報，2004，35（6）：622．基因小鼠腦組織病變的影響［J］［19］張婷，董克禮．益智健腦顆粒對阿爾茨海默病患者腦脊液β淀．中國老年學雜志，2007，27（6）：粉樣蛋白含量的影響［J］1080．著降低（P＜0．01）（表5，圖1，圖2），免疫印跡法顯示大鼠腦海馬區(qū)Aβ的IOD值及AβIOD/β－actinIOD比值均顯著降低（P＜0．01）（圖3，表6，圖4），說明腦益康中藥復方通過抑制膽固醇原降低了大鼠血脂水平，使大鼠腦海馬區(qū)Aβ合成減少，從位合成，而顯著改善高膽固醇血癥大鼠學習記憶能力。因此，降低膽固醇可以作為減少Aβ生成治療AD的新靶點，腦益康中藥復方的應用對于改善阿爾茨海默病行為學損害、降低減少紅細胞聚集性及改善血液粘度、減少血清CHO及LDL－C、腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ沉積具有較好的治療作用，具有進一步研究、開發(fā)和應用的前景。參考文獻：［1］Kivipelto，M．，HelkalaE．L．，LaaksoM．P．，etal．MidlifevascularriskfactorsandAlzheimer＇sdiseaseinlaterlife：longitudinal，popula-．BMJ，2001，16；322（7300）：1447．tionbasedstudy［J］［2］PuglielliL，TanziRE，KovacsDM．Alzheimer＇sdisease：thecholester-．NatNeurosci，2003，6（4）：345．olconnection［J］［3］KivipeltoM，SolomonA．CholesterolasariskfactorforAlzheimer＇sdis-ease－epidemiologicalevidence［J］．ActaNeurolScandSuppl，2006，185：50．［4］SchneiderA，Schulz－SchaefferW，HartmannT，etal．Cholesteroldepletionreducesaggregationofamyloid－betapeptideinhippocampalneurons［J］．NeurobiolDis．2006，23（3）：573．［5］王躍春．Y型電迷宮在大鼠學習記憶功能測試中的合理應用［J］．2005，14：69．中國行為醫(yī)學科學，［6］SparksDL，ScheffSW，HunsakerJC3mletal．InductionofAlzheimer－likebeta－amyloidimmunoreactivityinthebrainsofrabbitswithdi-．ExpNeurol，1994，126（1）：88．etarycholesterol［J］［7］RefoloLM，MalesterB，LaFrancoisJ，etal．Hypercholesterolemiaac-celeratestheAlzheimer＇samyloidpathologyinatransgenicmousemodel［J］．NeurobiolDis，2000，7（4）：321．蒼術揮發(fā)油化學成分及其抗菌活性的研究郭金鵬，王萍，孫如寶，史云，劉雪林*（中國人民解放軍疾病預防控制所，北京100071）摘要：目的研究蒼術揮發(fā)油的化學成分及抗菌活性。方法運用水蒸氣蒸餾法從蒼術根莖中提取揮發(fā)油，用氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）聯(lián)用技術對其揮發(fā)油組分進行分離和鑒定，運用氣相色譜面積歸一化法確定各組分的相對含量；對蒼術的揮發(fā)油做了抗菌試驗。結果蒼術的揮發(fā)油中主要成分為β－胺葉油醇（24%）、二苯基－4－甲醛（18%）、β－胺葉烯、α－胺葉油醇和茅術醇等。其揮發(fā)油對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、銅綠假單胞等病原菌有顯著地抑制和滅活作用。結論實驗結果為綜合開發(fā)利用蒼術醫(yī)藥資源提供了理論依據(jù)。關鍵詞：蒼術；揮發(fā)油；氣相色譜－質(zhì)譜法；抗菌活性DOI標識：doi：10．3969/j．issn．1008-0805．2011．03．0200805（2011）03-0566-02中圖分類號：R285．5文獻標識碼：B文章編號：1008-蒼術（RhizomaAtractylodis）又名赤術，為菊科蒼術屬植物茅蒼術Atractylodeslancea（Thunb．）DC．或北蒼術Atractylodeschinensis（DC．）Koidz．的干燥根莖，南蒼術又稱茅蒼術。早在漢。明代李時珍在《本草綱代，張仲景就說蒼術“能避一切惡氣”“能除惡氣，目》中也記載蒼術古今病疫及歲旦，入家往往燒蒼術。近代張山雷《本草正義》以辟邪氣，故時疫之病多用之”記載：“芳香辟穢，蒼術勝四時不正之氣，故時疫之病多用之。最能驅(qū)。用蒼除穢濁惡氣。陰霾之域，久曠之屋，宜焚此物而后居人”術熏蒸空氣，具有解郁避穢的作用，其主要殺菌活性成分為揮發(fā)油。蒼術煙熏消毒應用于病房、產(chǎn)房、手術室等取得滿意效［1，2］，果但對其活性成分、殺菌機制、應用劑型等缺乏深入研究。本實驗通過對蒼術有效成分的提取并進行實驗室抗菌性能研究，05-26；修訂日期：2010-10-12收稿日期：2010-基金項目：北京市自然科學基金項目（No．7063088）），作者簡介：郭金鵬（1977-男（漢族），山東陵縣人，現(xiàn)任中國人民解放軍疾病預防控制所助理研究員，博士學位，主要從事病原微生物和抗微生物天然產(chǎn)物研究工作．），通訊作者簡介：劉雪林（1963-男（漢族），河南輝縣人，現(xiàn)任中國人民解放軍疾病預防控制所研究員，博士學位，主要從事疾病預防控制工作．*·566·LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL．22NO．3時珍國醫(yī)國藥2011年第22卷第3期為其臨床應用和新劑型的開發(fā)提供實驗基礎。1材料與儀器1．1材料藥材產(chǎn)地：北蒼術，北京市燕北飲片廠，批號為040916。1．2試劑無水硫酸鈉、乙醚、氯化鈉（均為分析純，北京化學試水為蒸餾水。MH肉湯，肉湯培養(yǎng)基，普通瓊脂平板培養(yǎng)劑廠），基。抗菌活性實驗所用標準菌株凍干品購自中國疾病預防控制北京藥品生藥制品鑒定所、中國醫(yī)學細菌保藏中心，并由我中心、中心實驗室保存。1．3儀器Finnigan－TraceDSQ型GC/MS儀（美國熱電公司），GC（美國安捷倫科技有限公司，AgilentGC6890N，F(xiàn)ID），打漿機，96孔培養(yǎng)板，水蒸氣蒸餾裝置，普通培養(yǎng)箱。2方法2．1蒼術揮發(fā)油的提取水蒸氣蒸餾器提取法：將北蒼術根莖粉碎成干粉，稱量500g蒼術干粉，裝入10000ml水蒸氣蒸餾提取器中，加人6000ml蒸餾水提取，溫度控制在100℃附近，待提取器約6h，即停止提取。用分液漏斗去支管中流下的液體為無色時，除下部蒸餾水即得油狀粗提物，密封后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取率?）=油狀液體體積/樣品重量×100%。2．2GC－MS工作條件Finnigan－TraceDSQ型GC/MS儀，色譜柱型號：ThermoTR－5－MS毛細管質(zhì)譜柱（30m×0．25mm×0．33μm），色譜條件：載氣為高純氦氣，流量1．0ml/min進樣口3min，5℃/min升至80℃，柱溫60℃，保持1min，溫度150℃，10℃/min升至180℃，保持3min，15℃/min升至250℃，保持5min，掃描模式：全掃描，質(zhì)量范圍30～350amu，電離方式EI，電子能量70eV，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃。定量定性方法：各色譜峰對應的質(zhì)譜圖經(jīng)聯(lián)用儀的計算機譜庫檢索進行定性，質(zhì)譜數(shù)據(jù)為NIST譜庫。各組分的相對含量是根據(jù)總離子流是相對檢出量而言。圖由計算機采用峰面積歸一法計算而得，2．3抗菌實驗抗菌實驗菌株為大腸埃希菌等。實驗菌液配置24h培養(yǎng)，方法：將細菌接種于MH肉湯，置普通培養(yǎng)箱37℃，比6培養(yǎng)基使用肉湯濁法進行計數(shù)。用培養(yǎng)液調(diào)配成10CFU/ml，培養(yǎng)基和普通瓊脂平板培養(yǎng)基，采用微量二倍連續(xù)梯度稀釋法測［3］定MIC，平板轉種法測定MBC。MIC的測定：將蒼術揮發(fā)油溶于含5%Tween80的肉湯，并進行二倍連續(xù)梯度稀釋，將各濃度樣品液分別加到96孔培養(yǎng)板，0．15ml/孔。再依次加入濃度為106CFU/ml的實驗菌液50μl/24h孔。同時設立細菌對照。放置于濕盒內(nèi)于普通培養(yǎng)箱37℃，培養(yǎng)，觀察，無細菌生長孔的最小藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC）。MBC的測定：依次將細菌未生長孔（≥MIC）的培養(yǎng)物用無菌生理鹽水稀釋20倍，分別吸取0．05ml點種于瓊脂平板，置普24h培養(yǎng)，無細菌生長接種區(qū)域所對應的最小藥通培養(yǎng)箱37℃，物濃度為最小殺菌濃度（MBC）。3結果3．1蒼術揮發(fā)油成分分析蒼術揮發(fā)油經(jīng)GC－MS分離分析的總離子流圖如圖1，分離出17個組分，各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后所得的質(zhì)譜圖，采用計算機譜庫檢索，人工譜圖解析，按個峰的質(zhì)譜碎片與文獻核對，對基峰、質(zhì)荷比和相對豐度等方面進行比較，分別對各峰加以確認，其中含量最多的是β－胺葉油醇（24%），依次為二苯基－4－甲醛、β胺葉烯、α－胺葉油醇和茅術醇等，未檢出蒼術酮和蒼術素。二苯基－4－甲醛是本實驗中檢出含量第二高的化合物，約占18%，該成分的檢出在多數(shù)文獻中未見報道，但與［4］［5］典靈輝、黃昌全的報道一致，該物質(zhì)的生物活性以及在蒼術抗菌殺菌過程中所起的作用還有待探討。蒼術揮發(fā)油提取的方法不同以及所選溶劑的不同，是影［6］響抽提成分的重要因素。賈春曉等利用蒸餾萃取法和索氏提取法分別進行了實驗，索氏提取法鑒定出22種化合物，蒸無水乙餾萃取法鑒定出了49種化合物；并分別用二氯甲烷、醚和正己烷做溶劑抽提，結果提取成分也各不相同。本次實主要集中在C15等倍半驗所用方法檢出有效成分近二十種，萜類成分，未檢出C10等小分子物質(zhì)，可能與提取方式以及MS的分離條件有關。圖1蒼術揮發(fā)油總離子流程圖3．2抗菌活性結果分析蒼術揮發(fā)油對8個標準菌株的MIC和MBC如表1，從表中結果可以看出蒼術揮發(fā)油對實驗所選用的8個實驗菌株均有明顯的抑制作用和滅活作用，能有效地抵抗常見致病菌的感染。蒼術揮發(fā)油對大腸埃希菌ATCC8099株的MIC值是0．78μl/ml，表明蒼術揮發(fā)油對此細菌有較明顯的抑制作用；蒼術揮發(fā)油對鼠傷寒沙門氏菌ATCC50013株、株腸炎沙門氏菌50040株、金黃色葡萄球菌ATCC25923株、銅綠假單胞菌ATCC27853株的MIC值均為1．56μl/ml，表明蒼術揮發(fā)油對這4種細菌也有明顯的抑制作用；蒼術揮發(fā)油對其它三種細菌的MIC值相對較大一些，但也表現(xiàn)出一定的抑菌活性。蒼術揮發(fā)油對實驗的8個菌株均有抑制作用。蒼術揮發(fā)油對大腸埃希菌的MBC值是1．56μl/ml，表明蒼術揮發(fā)油對此細菌有顯著的殺滅作用；蒼術揮發(fā)油對腸炎沙門菌株和金黃色葡萄球菌株的MBC值分別為3．13μl/ml，表明蒼術揮發(fā)油對這兩個細菌也有明顯的殺滅作用；蒼術揮發(fā)油對實驗的8個菌株均有殺滅作用。蒼術揮發(fā)油對大腸埃腸炎沙門菌株和金黃色葡萄球菌ATCC株的抑制作希菌株、用和滅活作用較為顯著。表1蒼術揮發(fā)油對標準菌株的MIC和MBC值μl·ml－1最小抑菌濃度MIC0．781．561．566．253．131．566．251．56最小殺菌濃度MBC1．566．253．1312．512．53．1312．56．25標準菌株大腸埃希菌ATCC8099株傷寒沙門氏菌ATCC50097株腸炎沙門氏菌ATCC50040株鼠傷寒沙門氏菌ATCC50013株福氏志賀菌ATCC51253株金黃色葡萄球菌ATCC25923株白色念珠菌ATCC10231株銅綠假單胞菌ATCC27853株4討論用水蒸氣蒸餾法提取蒼術中的揮發(fā)油，分析其揮發(fā)油成分和含量以及對其揮發(fā)油生物活性的初步實驗，為綜合利用和開發(fā)這一傳統(tǒng)醫(yī)藥資源提供了理論依據(jù)。通過對蒼術揮發(fā)油化學成分分析可知其成分復雜多樣，與文獻報道的菊屬其他植物揮發(fā)油化［7］以萜類為主，這進一步證學成分中的一些主要成分是一致的，明物種與其化學組成具有一定的相關性，其中的主要化學成分對該屬植物的鑒定有參考價值，但由于種類、地域和來源的不同揮發(fā)油化學組成會存在著一定的差異，這意味著揮發(fā)油的生物活性也存在著差異?？咕鷮嶒灲Y果表明蒼術揮發(fā)油對實驗所選用的8個實驗菌株均有明顯的抑制作用和滅活作用，這和蒼術作為空［8，9］，氣消毒劑具有廣譜抗菌作用的結果相一致這里僅對其揮發(fā)·567·時珍國醫(yī)國藥2011年第22卷第3期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL．22NO．32004，32（2）：32．化工，油的抗菌殺菌生物活性做了初步實驗，由于蒼術揮發(fā)油化學成分協(xié)正杰，張忠義，等．蒼術超臨界CO2萃取物化學成分分析其揮發(fā)油主要成分抗菌生物活性實驗有待于進一［5］黃昌全，的復雜多樣性，［J］．中藥材，2001，24（10）：726．步深入研究。參考文獻：［1］陳小青，李慧靈，曾松芳，等．蒼術特劑型燃燒法空氣消毒的觀察［J］．護理學雜志，2002，17（2）：14．［2］毛又玲，陳學芹．四種室內(nèi)空氣消毒方法的效果觀察［J］．護士進修1997，12（6）：8．雜志，［3］徐小平，李卓成，肖建德，等．蒼術消毒劑殺菌性能的實驗觀察［J］．中華醫(yī)院感染學雜志，2003，13（9）：843．［4］典靈輝，梁勇，寧艷平．蒼術揮發(fā)油成分GC－MC分析［J］．廣州［6］賈春曉，毛多斌，張文葉，等．大別山野生蒼術揮發(fā)油化學成分研究［J］．中藥材，2004，27（8）：571．［7］李迎春．北蒼術超臨界CO2萃取產(chǎn)物的成分分析［J］．測試學報，2001，20（1）：46．［8］金詩風，王汝清，周光鑲，等．蒼術煙熏對空氣消毒效果的觀察［J］．2003，20（3）：198．中國消毒學雜志，［9］施綺云，薛廣波，胡世杰．蒼術復方消毒劑對空氣中微生物殺滅效J］．中國消毒學雜志，1995，12（2）：114．果的檢測［天麻素對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的保護作用*徐紀偉，陳旭東，劉喜民，康紅玉，孫丹華（漯河醫(yī)學高等專科學校，河南漯河462002）摘要：目的探討天麻素對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的影響。方法制作脊髓損傷模型，分為假手術組，生理鹽水治療組，天麻素治療組，每組25只。用Nissl染色檢測神經(jīng)元的活性，檢測動物術后BBB運動評分。結果天麻素治療組較生理鹽神經(jīng)元的尼氏體的含量較多，差異具有顯著性；天麻素治療組的BBB運動評分明顯優(yōu)于生理鹽水治療組。結水治療組，論天麻素能夠改善脊髓損傷區(qū)域的微環(huán)境，促進神經(jīng)元的生長。關鍵詞：天麻素；脊髓損傷；尼氏體DOI標識：doi：10．3969/j．issn．1008-0805．2011．03．0210805（2011）03-0568-02中圖分類號：R322．81文獻標識碼：B文章編號：1008-成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷后，往往造成災難性——脊髓損傷（spinalcordiniury，SCI）導致神經(jīng)功能不易的后果—大量恢復。這主要是因為損傷組織不能進行真正意義上的再生，的神經(jīng)元調(diào)亡，不能形成功能性突觸聯(lián)系，從而導致永久的神經(jīng)功能缺失。CNS再生困難主要是因為傷后為神經(jīng)元提供營養(yǎng)的微環(huán)境破壞，從而導致神經(jīng)元凋亡。本實驗通過注射天麻素（Gastrodin）來改善損傷區(qū)的微環(huán)境，觀察神經(jīng)元中尼氏體表達，采用BBB運動功能評分檢測動物機體恢復狀況，從而探討天麻素的神經(jīng)保護作用及可能機制。1材料1．1實驗動物及試劑SD雌性大鼠75只，體質(zhì)量250～300g。動物分為假手術組，生理鹽水治療組，天麻素治療組。每組于術3，7，14，21d各處死5只動物取材。后1，天麻素、焦油紫、乙醇、乙醚、氯仿、二甲苯。1．2動物模型制作損傷組（單純脊髓橫斷組/天麻素治療組）：以40mg/kg體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射戊巴妥鈉麻醉大鼠后，將大鼠俯臥位固定于實驗臺上，取后正中切開皮膚及皮下，顯露出T9至T10棘突及椎板，用手術刀完全切斷脊髓，沖洗傷口，縫合傷口，無菌敷料覆蓋，建立大鼠脊髓橫斷損傷模型。生理鹽水治療組：按照損傷組一樣進行手術，剪斷脊髓。假手術組：按照損傷組一樣進行手術，但不剪斷脊髓。天麻素治療組在傷后即刻在蛛網(wǎng)膜下注射5mg的天麻素；生理鹽水治療組給予等量生理鹽水；假手術組不給藥。以后每天l周后停藥。給同量藥1次，1．3組織固定、取材與切片術后規(guī)