醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件

人的差異在于業(yè)余時(shí)間15052醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)4核酸分離純化課件15052醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)4核酸分離純化課件人的差異在于業(yè)余時(shí)間15052醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)4核酸分離純化課件醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)

課堂作業(yè)（3）：

電泳結(jié)果圖比較分析M123456圖1基因組DNA電泳圖2質(zhì)粒DNA電泳圖3RNA電泳人的差異在于業(yè)余時(shí)間15052醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)4核酸分離純化1醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件2醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件3醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件4醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件5真核細(xì)胞的裂解方法包括超聲破碎法、勻漿法、低滲法等物理方法及蛋白酶K、去污劑溫和處理法，為獲得大分子量的DNA，一般多采用后者溫和裂解細(xì)胞。

1.真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化方法：

酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒纏繞法及各種快速方法。真核細(xì)胞的裂解方法包括超聲破碎法、勻漿法、低滲法等物理方法及6

酚抽提法1976年創(chuàng)立，經(jīng)改進(jìn)：以含EDTA、十二烷基磺酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）及無DNase的RNase裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K（proteinaseK）處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，乙醇沉淀，獲得DNA粗制品。去除蛋白質(zhì)、RNA酚抽提法1976年創(chuàng)立，經(jīng)改進(jìn)：去除蛋白質(zhì)、RNA7EDTA為二價(jià)金屬離子螯合劑，可抑制DNA酶的活性，同時(shí)還能降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；SDS為陰離子去污劑，能引起細(xì)胞膜降解，乳化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)并沉淀，同時(shí)還有降解DNA酶的作用；

無DNA酶的RNA酶，可有效水解RNA；蛋白酶K起水解蛋白質(zhì)的作用，可消化DNA酶、DNA上的蛋白質(zhì)，同時(shí)也有裂解細(xì)胞的作用。

酚抽提法：試劑作用（一）EDTA為二價(jià)金屬離子螯合劑，可抑制DNA酶的活性，同時(shí)還能8酚是很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，也可抑制DNA酶活性；氯仿能加速有機(jī)相和水相的分離；異戊醇則可減少在抽提過程中由于蛋白變性產(chǎn)生的大量氣泡。pH8.0的Tris可使DNA順利進(jìn)入水相，避免滯留于蛋白層。

70％乙醇洗滌（除去共沉淀的鹽和有機(jī)分子）

酚抽提法：試劑作用（二）酚是很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，也可抑制DNA酶活性；酚抽提法：試劑9基因組DNA的提取步驟：消化緩沖液（含蛋白酶和RNA酶）酚/氯仿/異戊醇（反復(fù)多次）無水乙醇/醋酸鈉（濃縮）TE液溶解保存（70－75）％乙醇洗滌沉淀和洗滌后的痕量乙醇必須去除干凈，否則影響隨后的DNA溶解以及酶學(xué)反應(yīng)?；蚪MDNA的提取步驟：消化緩沖液（含蛋白酶和RNA10

(1）使用注意酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。

Tris飽和酚(吸取下層溶液)(2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。酚使用注意事項(xiàng)(1）使用注意酚使用注意事項(xiàng)11基因組DNA片段的純化DNA粗制品實(shí)際上是分子量大小不等的DNA片段的混合物，難免還混有少量的RNA、蛋白質(zhì)和一些小分子雜質(zhì)。某些實(shí)驗(yàn)，如限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)、分子克隆、體外轉(zhuǎn)錄及基因組文庫的構(gòu)建等對DNA制品的純度及完整性要求較高，這就要求對粗制品進(jìn)一步純化。

基因組DNA片段的純化DNA粗制品實(shí)際上是分子量大小不等12基因組DNA片段的純化

純化方法有透析、層析、電泳及選擇性沉淀等。電泳法由于簡便、易于操作、分辨率高、靈敏度好、易于觀察及便于回收等優(yōu)點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳（AGE）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）。

基因組DNA片段的純化純化方法有透析、層析、電泳及選擇性沉13第一節(jié)核酸的化學(xué)組成第二節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第三節(jié)真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化第四節(jié)質(zhì)粒DNA的分離純化第五節(jié)真核細(xì)胞RNA的分離純化一、核酸的分離純化

DNA

RNA第一節(jié)核酸的化學(xué)組成一、核酸的分離純化DNA14獨(dú)立于染色體外，非宿主生長所必需，能進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。

質(zhì)粒與致病菌的毒力及耐藥性有關(guān)，又是基因工程的常用載體。第四節(jié)質(zhì)粒DNA的分離純化

質(zhì)粒（plasmid）存在于染色體外胞質(zhì)中，能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的小的核酸分子。獨(dú)立于染色體外，非宿主生長所必需，能進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺15第四節(jié)質(zhì)粒DNA的分離純化

與染色體DNA分離（質(zhì)粒較小，共價(jià)閉合環(huán)狀）

與蛋白質(zhì)、RNA分離

質(zhì)粒載體（plasmidvector）第四節(jié)質(zhì)粒DNA的分離純化與染色體DNA分離（質(zhì)粒較小16細(xì)菌中提純質(zhì)粒DNA的方法3個(gè)步驟：

細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(質(zhì)粒擴(kuò)增）

細(xì)菌的收獲（離心）和裂解

質(zhì)粒DNA的純化

細(xì)菌中提純質(zhì)粒DNA的方法3個(gè)步驟：17細(xì)菌培養(yǎng)

細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600）時(shí)提取質(zhì)粒DNA。

減少細(xì)菌量，降低后續(xù)操作中裂解物的復(fù)雜性和粘稠度。

細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600）時(shí)提取質(zhì)18細(xì)菌裂解可采用離心的方法來收集細(xì)菌，由于細(xì)菌生長中產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，為提高質(zhì)粒DNA的純度，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水漂洗1～2次。細(xì)菌的裂解可采用多種方法進(jìn)行，如SDS裂解法、有機(jī)溶劑法、堿裂解法、煮沸裂解法、溶菌酶法和超聲處理等。

細(xì)菌裂解可采用離心的方法來收集細(xì)菌，由于細(xì)菌生長中產(chǎn)生了大量19取決于３個(gè)因素

質(zhì)粒的大小菌株種類裂解后純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)細(xì)菌裂解方法的選擇大于15kb的質(zhì)粒易受損，應(yīng)采用溫和裂解法，如SDS裂解法，將細(xì)菌懸浮于10％蔗糖溶液中可減輕裂解時(shí)對DNA造成的機(jī)械剪切力。取決于３個(gè)因素細(xì)菌裂解方法的選擇大于15kb的質(zhì)粒易受20一些大腸桿菌菌株（如HB101、TG1等）含較多糖類，用SDS或煮沸裂解時(shí)會(huì)大量釋放出來，若隨后用CsCl-EB梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)，糖類會(huì)很難與質(zhì)粒DNA區(qū)分開來，而糖類也可抑制多種限制酶的活性。HB101等菌株能表達(dá)核酸內(nèi)切酶A，且煮沸不能完全滅活，在Mg2+條件下可以降解質(zhì)粒DNA，不建議使用煮沸法。若一定要使用煮沸法提取該類菌株中的質(zhì)粒DNA，可采用酚/氯仿反復(fù)抽提，以除去該酶。細(xì)菌裂解方法的選擇細(xì)菌裂解方法的選擇21

強(qiáng)堿破壞堿基配對，使線狀染色體DNA解鏈，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配對，重新形成完全天然的超螺旋分子。堿裂解法:利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的強(qiáng)堿破壞堿基配對，使線狀染色體DNA解鏈，但閉環(huán)22在NaOH（pH12.0－12.6）下，用EDTA和SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。細(xì)胞被裂解后，細(xì)胞壁及膜的碎片與變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成纏連的、不溶性的網(wǎng)狀、大的復(fù)合物，在高鹽條件下可有效沉淀；當(dāng)pH調(diào)至中性時(shí)，質(zhì)粒DNA就可重新恢復(fù)天然的超螺旋，保留在上清液中，經(jīng)離心可與染色體DNA分離。使用預(yù)冷無水乙醇沉淀上清液中的質(zhì)粒DNA，再用70%的乙醇洗滌。堿裂解法:在NaOH（pH12.0－12.6）下，用EDTA和SDS23堿裂解法操作步驟:溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris?Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ⅱ（NaOH，SDS）溶液Ⅲ（乙酸/乙酸鉀）酚/氯仿/異戊醇無水乙醇沉淀TE液溶解

OD260/280=1.6－1.8;>2.0表示含有RNA，<1.6表示有蛋白質(zhì)等堿裂解法操作步驟:溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，2524堿裂解法

操作簡單、重復(fù)性好、成本低廉。用于高拷貝質(zhì)粒（如Xf3或pUC）的制備其產(chǎn)量一般約為3～5μg/ml菌液；制備量可大可小，是使用最廣泛的方法；制備的質(zhì)粒DNA可用于DNA重組、常規(guī)亞克隆、探針標(biāo)記、限制性酶切圖譜繪制以及細(xì)菌轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。沉淀和洗滌后的痕量乙醇必須去除干凈，否則影響隨后的DNA溶解以及酶學(xué)反應(yīng)。堿裂解法操作簡單、重復(fù)性好、成本低廉。25

煮沸裂解法將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶能破壞細(xì)胞膜，再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈，當(dāng)溫度下降后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清液中的質(zhì)粒DNA。條件劇烈，只適于小質(zhì)粒DNA（<15kb）的提取。煮沸裂解法將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌26SDS裂解法

將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，再用SDS裂解去壁細(xì)胞，從而溫和地釋放質(zhì)粒到等滲液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA。條件溫和，該法特別適用于大質(zhì)粒DNA（>15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。SDS裂解法將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和E27一.堿裂解法利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的,最廣泛使用,適用于所有菌株。二.煮沸裂解法三.SDS裂解法

條件溫和，特別適用于大質(zhì)粒DNA（>15kb）的提取。缺點(diǎn)是產(chǎn)率不高。條件劇烈，只適于小質(zhì)粒DNA（<15kb）的制備。有些菌株不適用。質(zhì)粒DNA提取方法的比較一.堿裂解法利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA的變性與復(fù)性28常規(guī)小量或中量制備的質(zhì)粒DNA可用于酶切回收、探針標(biāo)記、重組或轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)操作。有些實(shí)驗(yàn)對質(zhì)粒的純度要求更高，如哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等實(shí)驗(yàn)，對質(zhì)粒DNA的閉合環(huán)狀構(gòu)型要求較高，因此需要對提取的質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步的純化。無論用何種方法提取的質(zhì)粒DNA，都會(huì)有不等量的染色體DNA和較多RNA、蛋白質(zhì)殘留其中。制備的質(zhì)粒也有三種不同構(gòu)型，即：共價(jià)閉合環(huán)狀、線性和半開環(huán)。質(zhì)粒DNA的純化常規(guī)小量或中量制備的質(zhì)粒DNA可用于酶切回收、探針標(biāo)記、重組29去除蛋白質(zhì)、染色體DNA和RNA；分離質(zhì)粒的不同構(gòu)型；

質(zhì)粒DNA純化目的利用質(zhì)粒DNA相對較小及共價(jià)閉合環(huán)狀兩個(gè)性質(zhì)去除蛋白質(zhì)、染色體DNA和RNA；質(zhì)粒DNA純化目的利用質(zhì)粒30質(zhì)粒DNA的純化方法氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心；離子交換層析、凝膠過濾層析；聚乙二醇沉淀法；質(zhì)粒DNA的純化方法31氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心利用溴化乙錠同線性和閉合環(huán)狀DNA分子的結(jié)合量不同，導(dǎo)致不同構(gòu)型DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫梯度中的浮力密度有所差異，從而達(dá)到分離純化的目的。適于純化：①容易帶上切口的特大質(zhì)粒；②用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的閉環(huán)質(zhì)粒；③用于生物物理學(xué)測定的質(zhì)粒。是大量制備質(zhì)粒的首選方法

。

缺點(diǎn)：昂貴且費(fèi)時(shí)

氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心利用溴化乙錠同線性和閉合環(huán)狀DN32聚乙二醇沉淀法

利用質(zhì)粒相對較小和共價(jià)閉環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分級沉淀的純化方法。1）用LiCl（強(qiáng)脫水劑，能降低RNA的溶解度，使蛋白質(zhì)從染色質(zhì)上脫離）沉淀粗制品中的大分子RNA和蛋白質(zhì)，并用RNase消化小分子RNA；2）含有聚乙二醇（PEG）的高鹽溶液選擇性地沉淀大的質(zhì)粒DNA，使小分子RNA和染色體DNA片段留在上清液中；3）沉淀的質(zhì)粒DNA進(jìn)一步用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀而得到純化。聚乙二醇沉淀法利用質(zhì)粒相對較小和共價(jià)閉環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分級33小分子RNA與DNA片段的去除小分子RNA與DNA片段的污染，能夠提供相當(dāng)多的5’與3’末端。利用DNA末端的酶促反應(yīng)（如末端轉(zhuǎn)移酶、T4DNA連接酶）和測序反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)很關(guān)鍵。用分子篩層析或RNase消化等方法去除污染。小分子RNA與DNA片段的去除小分子RNA與DNA片段的污染34第一節(jié)核酸的化學(xué)組成第二節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第三節(jié)真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化第四節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化第五節(jié)真核細(xì)胞RNA的分離純化一、核酸的分離純化

第一節(jié)核酸的化學(xué)組成一、核酸的分離純化35哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNA分布

rRNA的數(shù)量最多，占80％～85％（主要分為28S、18S、5.8S和5S四種）；低分子量RNA如tRNA、snRNA等占15％～20％；mRNA僅占1％～5％;

第五節(jié)真核細(xì)胞RNA的分離純化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNA分布rRNA的數(shù)量最多，占80％～8536RNA許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)如Northernblot、cDNA合成以及體外翻譯等都以RNA為材料和研究對象，因此從細(xì)胞中分離出足夠數(shù)量、純度和完整性的RNA是至關(guān)重要的，它直接影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。RNA許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)如Northernblot、cDN37RNA化學(xué)性質(zhì)更為活躍：與DNA相比，核糖殘基在2’，3’位帶有羥基。主要為單鏈結(jié)構(gòu)。易受RNA酶（RNase）的切割。RNA化學(xué)性質(zhì)更為活躍：與DNA相比，核糖殘基在2’，3’位38

RNA制備的條件與環(huán)境RNA極易被RNase水解！

RNase

廣泛存在于人的細(xì)胞內(nèi)、皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中；分子結(jié)構(gòu)中二硫鍵的存在使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，煮沸及一般變性劑不能使其完全滅活，待變性劑去除后，活性又可恢復(fù)。

RNA制備的條件與環(huán)境RNA極易被RNase水解！39RNase污染的防止RNA制備中最關(guān)鍵的因素是嚴(yán)格控制制備的條件和環(huán)境，防止RNase的污染??！排除RNase的存在,強(qiáng)有力地抑制其活性一是避免外源性RNase的污染，它主要來源于試劑、實(shí)驗(yàn)器皿和操作者本身；二是抑制內(nèi)源性RNase的活性，它主要來源于樣品中的組織細(xì)胞。RNase污染的防止RNA制備中最關(guān)鍵的因素是嚴(yán)格控制制備的40

RNase的變性劑酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類RNase的特異抑制劑

RNasin（酸性蛋白質(zhì)，能與多種RNase非共價(jià)結(jié)合形成等摩爾復(fù)合物，從而抑制RNase的活力）與DEPC等

β-疏基乙醇（mercaptoethanol）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）等還原劑可還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。RNase的變性劑41

DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。

作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA時(shí)，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）劇毒。DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOO42試劑的聯(lián)合使用在RNA的制備過程中，RNase抑制劑常常和蛋白質(zhì)變性劑和陰離子去污劑等物質(zhì)聯(lián)用，加強(qiáng)對RNase活力的抑制。鹽酸胍或硫氰酸胍溶液是蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白也由于其二級結(jié)構(gòu)被破壞而從核酸上解離下來。同時(shí)，RNase活性能被4mol/L硫氰酸胍和β－巰基乙醇等所滅活。試劑的聯(lián)合使用在RNA的制備過程中，RNase抑制43總RNA的制備方法

一是用有機(jī)溶劑分級提取RNA；二是利用差速離心沉淀將高分子量RNA和其他類型核酸分離開來。

總RNA的制備方法一是用有機(jī)溶劑分級提取RNA；44

商品化的單相裂解試劑法分離RNA

改進(jìn)方案以異硫氰酸胍-酚的單相裂解液裂解細(xì)胞，再加入氯仿后形成兩相。變性的DNA與蛋白質(zhì)介于兩相的交界面，保留于上層水相的RNA，通過異丙醇沉淀與75%乙醇洗滌而制備。位于界面的DNA與蛋白質(zhì)可使用乙醇和異丙醇分級沉淀出來。同時(shí)制備的DNA片段約20kb，可作PCR反應(yīng)的模板，蛋白樣品則主要用于WesternBlot。

Trizol試劑（非柱式）

商品化的單相裂解試劑法分離RNA改進(jìn)方案Trizo45RNaseTrizol試劑protocolRNaseTrizol試劑protocol46InstructionsforRNAisolationInstructionsforRNAisolation47HomogenizationHomogenization48Optional：Optional：49RNAprecipitation，RNAwash，redissolvingtheRNARNAprecipitation，RNAwash，re50RNAIsolationnotesRNAIsolationnotes51醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件52去除DNA和蛋白質(zhì)組織或細(xì)胞勻漿室溫靜置，促進(jìn)核酸與蛋白解離氯仿促進(jìn)有機(jī)相與水相分層，異丙醇沉淀RNADEPC水（焦碳酸二乙酯）溶解RNA,-80℃保存RNA提取步驟：去除DNA和蛋白質(zhì)組織或細(xì)胞勻漿室溫靜置，促進(jìn)核酸與蛋53

mRNA的分離純化mRNA在真核細(xì)胞中含量少，種類多，分子量大小不一且核苷酸序列各不相同，長度可從幾百堿基到幾千堿基不等。除血紅蛋白及組蛋白等的mRNA外，絕大多數(shù)mRNA在其3′末端帶有長短不同的poly（A）尾。依據(jù)mRNA的結(jié)構(gòu)特征，利用堿基配對原則，通過oligo（dT）-纖維素或poly（U）-瓊脂糖凝膠的親和層析，從總RNA制品中分離純化mRNA。mRNA的分離純化mRNA在真核細(xì)胞中含量少，種類多54oligo（dT）-纖維素柱層析法

回收量可達(dá)總RNA的1％～10％，但分離速度較慢、層析柱易阻塞，不適合同時(shí)處理多個(gè)標(biāo)本和少量的RNA樣本。

oligo（dT）-纖維素柱離心法

通過離心分離柱達(dá)到快速提取mRNA的目的，產(chǎn)物具有產(chǎn)量高、質(zhì)量好的特點(diǎn)。oligo（dT）-纖維素液相結(jié)合離心法

從多個(gè)或少量RNA樣品中分離出RNA。

oligo（dT）-纖維素柱層析法55

磁珠分離法聯(lián)合利用了oligo（dT）與poly（A）的互補(bǔ)配對、生物素（biotin）與鏈親和素（streptavidin）的結(jié)合特異性以及磁性分離原理，可對poly（A）+RNA進(jìn)行高效、靈敏及快捷的分離。1h內(nèi)從總RNA總分離得到mRNA。提取的mRNA能用于幾乎所有的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如cDNA合成、PCR分析、Northern雜交和體外翻譯等，且其產(chǎn)量比常規(guī)方法高出兩倍。最大的缺點(diǎn)是它對組織或細(xì)胞的最大處理量每次不超過1g（總RNA量為1mg），且磁珠價(jià)格昂貴、需要專門的磁性分離架。磁珠分離法聯(lián)合利用了oligo（dT）與poly（A）565′m7GAAAAAAAAAAAA3′3′TTTTTTTTTTTT-Biotin5′+總RNA中的poly(A)+RNA分子退火形成雜交體

5′m7GAAAAAAAAAAAA3′3′TTTTTTTTTTTT-Biotin5′鏈親和素標(biāo)記的磁珠+Streptavidin-磁5′m7GAAAAAAAAAAAA3′3′TTTTTTTTTTTT-Biotin5′Streptavidin-磁生物素與鏈親和素的特異性結(jié)合磁性分離5′m7GAAAAAAAAAAAA3′磁鐵3′TTTTTTTTTTTT-Biotin5′Streptavidin-磁洗滌與洗脫水相(含純化的mRNA)固相生物素標(biāo)記的oligo(dT)磁鐵5′m7GAAAAAAAAAAAA3′3′TTTTTTTTTTTT-Biotin5′Streptavidin-磁磁珠分離法純化poly(A)+RNA的原理5′m7GAAAAAAAAAA57

避免RNA酶降解RNA(專門場所；耗材處理；實(shí)驗(yàn)者裝備；正確操作）

RNA提取注意事項(xiàng)：

避免DNA和蛋白質(zhì)污染（RNA的純化）

防止氣溶膠形成（啟蓋前震蕩離心管） 避免RNA酶降解RNARNA提取注意事項(xiàng)：5841、學(xué)問是異常珍貴的東西，從任何源泉吸收都不可恥?！⒉贰と铡しɡ?/p>

42、只有在人群中間，才能認(rèn)識(shí)自己?！聡?/p>

43、重復(fù)別人所說的話，只需要教育；而要挑戰(zhàn)別人所說的話，則需要頭腦?！旣悺づ宓俨┒鳌て諣?/p>

44、卓越的人一大優(yōu)點(diǎn)是：在不利與艱難的遭遇里百折不饒。——貝多芬

45、自己的飯量自己知道。——蘇聯(lián)41、學(xué)問是異常珍貴的東西，從任何源泉吸收都不可恥?！⒉?9人的差異在于業(yè)余時(shí)間15052醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)4核酸分離純化課件15052醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)4核酸分離純化課件人的差異在于業(yè)余時(shí)間15052醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)4核酸分離純化課件醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)

課堂作業(yè)（3）：

電泳結(jié)果圖比較分析M123456圖1基因組DNA電泳圖2質(zhì)粒DNA電泳圖3RNA電泳人的差異在于業(yè)余時(shí)間15052醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)4核酸分離純化60醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件61醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件62醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件63醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)核酸分離純化課件64真核細(xì)胞的裂解方法包括超聲破碎法、勻漿法、低滲法等物理方法及蛋白酶K、去污劑溫和處理法，為獲得大分子量的DNA，一般多采用后者溫和裂解細(xì)胞。

1.真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化方法：

酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒纏繞法及各種快速方法。真核細(xì)胞的裂解方法包括超聲破碎法、勻漿法、低滲法等物理方法及65

酚抽提法1976年創(chuàng)立，經(jīng)改進(jìn)：以含EDTA、十二烷基磺酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）及無DNase的RNase裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K（proteinaseK）處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，乙醇沉淀，獲得DNA粗制品。去除蛋白質(zhì)、RNA酚抽提法1976年創(chuàng)立，經(jīng)改進(jìn)：去除蛋白質(zhì)、RNA66EDTA為二價(jià)金屬離子螯合劑，可抑制DNA酶的活性，同時(shí)還能降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；SDS為陰離子去污劑，能引起細(xì)胞膜降解，乳化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)并沉淀，同時(shí)還有降解DNA酶的作用；

無DNA酶的RNA酶，可有效水解RNA；蛋白酶K起水解蛋白質(zhì)的作用，可消化DNA酶、DNA上的蛋白質(zhì)，同時(shí)也有裂解細(xì)胞的作用。

酚抽提法：試劑作用（一）EDTA為二價(jià)金屬離子螯合劑，可抑制DNA酶的活性，同時(shí)還能67酚是很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，也可抑制DNA酶活性；氯仿能加速有機(jī)相和水相的分離；異戊醇則可減少在抽提過程中由于蛋白變性產(chǎn)生的大量氣泡。pH8.0的Tris可使DNA順利進(jìn)入水相，避免滯留于蛋白層。

70％乙醇洗滌（除去共沉淀的鹽和有機(jī)分子）

酚抽提法：試劑作用（二）酚是很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，也可抑制DNA酶活性；酚抽提法：試劑68基因組DNA的提取步驟：消化緩沖液（含蛋白酶和RNA酶）酚/氯仿/異戊醇（反復(fù)多次）無水乙醇/醋酸鈉（濃縮）TE液溶解保存（70－75）％乙醇洗滌沉淀和洗滌后的痕量乙醇必須去除干凈，否則影響隨后的DNA溶解以及酶學(xué)反應(yīng)?；蚪MDNA的提取步驟：消化緩沖液（含蛋白酶和RNA69

(1）使用注意酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。

Tris飽和酚(吸取下層溶液)(2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。酚使用注意事項(xiàng)(1）使用注意酚使用注意事項(xiàng)70基因組DNA片段的純化DNA粗制品實(shí)際上是分子量大小不等的DNA片段的混合物，難免還混有少量的RNA、蛋白質(zhì)和一些小分子雜質(zhì)。某些實(shí)驗(yàn)，如限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)、分子克隆、體外轉(zhuǎn)錄及基因組文庫的構(gòu)建等對DNA制品的純度及完整性要求較高，這就要求對粗制品進(jìn)一步純化。

基因組DNA片段的純化DNA粗制品實(shí)際上是分子量大小不等71基因組DNA片段的純化

純化方法有透析、層析、電泳及選擇性沉淀等。電泳法由于簡便、易于操作、分辨率高、靈敏度好、易于觀察及便于回收等優(yōu)點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳（AGE）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）。

基因組DNA片段的純化純化方法有透析、層析、電泳及選擇性沉72第一節(jié)核酸的化學(xué)組成第二節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第三節(jié)真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化第四節(jié)質(zhì)粒DNA的分離純化第五節(jié)真核細(xì)胞RNA的分離純化一、核酸的分離純化

DNA

RNA第一節(jié)核酸的化學(xué)組成一、核酸的分離純化DNA73獨(dú)立于染色體外，非宿主生長所必需，能進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。

質(zhì)粒與致病菌的毒力及耐藥性有關(guān)，又是基因工程的常用載體。第四節(jié)質(zhì)粒DNA的分離純化

質(zhì)粒（plasmid）存在于染色體外胞質(zhì)中，能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的小的核酸分子。獨(dú)立于染色體外，非宿主生長所必需，能進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺74第四節(jié)質(zhì)粒DNA的分離純化

與染色體DNA分離（質(zhì)粒較小，共價(jià)閉合環(huán)狀）

與蛋白質(zhì)、RNA分離

質(zhì)粒載體（plasmidvector）第四節(jié)質(zhì)粒DNA的分離純化與染色體DNA分離（質(zhì)粒較小75細(xì)菌中提純質(zhì)粒DNA的方法3個(gè)步驟：

細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(質(zhì)粒擴(kuò)增）

細(xì)菌的收獲（離心）和裂解

質(zhì)粒DNA的純化

細(xì)菌中提純質(zhì)粒DNA的方法3個(gè)步驟：76細(xì)菌培養(yǎng)

細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600）時(shí)提取質(zhì)粒DNA。

減少細(xì)菌量，降低后續(xù)操作中裂解物的復(fù)雜性和粘稠度。

細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600）時(shí)提取質(zhì)77細(xì)菌裂解可采用離心的方法來收集細(xì)菌，由于細(xì)菌生長中產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，為提高質(zhì)粒DNA的純度，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水漂洗1～2次。細(xì)菌的裂解可采用多種方法進(jìn)行，如SDS裂解法、有機(jī)溶劑法、堿裂解法、煮沸裂解法、溶菌酶法和超聲處理等。

細(xì)菌裂解可采用離心的方法來收集細(xì)菌，由于細(xì)菌生長中產(chǎn)生了大量78取決于３個(gè)因素

質(zhì)粒的大小菌株種類裂解后純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)細(xì)菌裂解方法的選擇大于15kb的質(zhì)粒易受損，應(yīng)采用溫和裂解法，如SDS裂解法，將細(xì)菌懸浮于10％蔗糖溶液中可減輕裂解時(shí)對DNA造成的機(jī)械剪切力。取決于３個(gè)因素細(xì)菌裂解方法的選擇大于15kb的質(zhì)粒易受79一些大腸桿菌菌株（如HB101、TG1等）含較多糖類，用SDS或煮沸裂解時(shí)會(huì)大量釋放出來，若隨后用CsCl-EB梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)，糖類會(huì)很難與質(zhì)粒DNA區(qū)分開來，而糖類也可抑制多種限制酶的活性。HB101等菌株能表達(dá)核酸內(nèi)切酶A，且煮沸不能完全滅活，在Mg2+條件下可以降解質(zhì)粒DNA，不建議使用煮沸法。若一定要使用煮沸法提取該類菌株中的質(zhì)粒DNA，可采用酚/氯仿反復(fù)抽提，以除去該酶。細(xì)菌裂解方法的選擇細(xì)菌裂解方法的選擇80

強(qiáng)堿破壞堿基配對，使線狀染色體DNA解鏈，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配對，重新形成完全天然的超螺旋分子。堿裂解法:利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的強(qiáng)堿破壞堿基配對，使線狀染色體DNA解鏈，但閉環(huán)81在NaOH（pH12.0－12.6）下，用EDTA和SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。細(xì)胞被裂解后，細(xì)胞壁及膜的碎片與變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成纏連的、不溶性的網(wǎng)狀、大的復(fù)合物，在高鹽條件下可有效沉淀；當(dāng)pH調(diào)至中性時(shí)，質(zhì)粒DNA就可重新恢復(fù)天然的超螺旋，保留在上清液中，經(jīng)離心可與染色體DNA分離。使用預(yù)冷無水乙醇沉淀上清液中的質(zhì)粒DNA，再用70%的乙醇洗滌。堿裂解法:在NaOH（pH12.0－12.6）下，用EDTA和SDS82堿裂解法操作步驟:溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris?Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ⅱ（NaOH，SDS）溶液Ⅲ（乙酸/乙酸鉀）酚/氯仿/異戊醇無水乙醇沉淀TE液溶解

OD260/280=1.6－1.8;>2.0表示含有RNA，<1.6表示有蛋白質(zhì)等堿裂解法操作步驟:溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，2583堿裂解法

操作簡單、重復(fù)性好、成本低廉。用于高拷貝質(zhì)粒（如Xf3或pUC）的制備其產(chǎn)量一般約為3～5μg/ml菌液；制備量可大可小，是使用最廣泛的方法；制備的質(zhì)粒DNA可用于DNA重組、常規(guī)亞克隆、探針標(biāo)記、限制性酶切圖譜繪制以及細(xì)菌轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。沉淀和洗滌后的痕量乙醇必須去除干凈，否則影響隨后的DNA溶解以及酶學(xué)反應(yīng)。堿裂解法操作簡單、重復(fù)性好、成本低廉。84

煮沸裂解法將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶能破壞細(xì)胞膜，再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈，當(dāng)溫度下降后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清液中的質(zhì)粒DNA。條件劇烈，只適于小質(zhì)粒DNA（<15kb）的提取。煮沸裂解法將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌85SDS裂解法

將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，再用SDS裂解去壁細(xì)胞，從而溫和地釋放質(zhì)粒到等滲液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA。條件溫和，該法特別適用于大質(zhì)粒DNA（>15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。SDS裂解法將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和E86一.堿裂解法利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的,最廣泛使用,適用于所有菌株。二.煮沸裂解法三.SDS裂解法

條件溫和，特別適用于大質(zhì)粒DNA（>15kb）的提取。缺點(diǎn)是產(chǎn)率不高。條件劇烈，只適于小質(zhì)粒DNA（<15kb）的制備。有些菌株不適用。質(zhì)粒DNA提取方法的比較一.堿裂解法利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA的變性與復(fù)性87常規(guī)小量或中量制備的質(zhì)粒DNA可用于酶切回收、探針標(biāo)記、重組或轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)操作。有些實(shí)驗(yàn)對質(zhì)粒的純度要求更高，如哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等實(shí)驗(yàn)，對質(zhì)粒DNA的閉合環(huán)狀構(gòu)型要求較高，因此需要對提取的質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步的純化。無論用何種方法提取的質(zhì)粒DNA，都會(huì)有不等量的染色體DNA和較多RNA、蛋白質(zhì)殘留其中。制備的質(zhì)粒也有三種不同構(gòu)型，即：共價(jià)閉合環(huán)狀、線性和半開環(huán)。質(zhì)粒DNA的純化常規(guī)小量或中量制備的質(zhì)粒DNA可用于酶切回收、探針標(biāo)記、重組88去除蛋白質(zhì)、染色體DNA和RNA；分離質(zhì)粒的不同構(gòu)型；

質(zhì)粒DNA純化目的利用質(zhì)粒DNA相對較小及共價(jià)閉合環(huán)狀兩個(gè)性質(zhì)去除蛋白質(zhì)、染色體DNA和RNA；質(zhì)粒DNA純化目的利用質(zhì)粒89質(zhì)粒DNA的純化方法氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心；離子交換層析、凝膠過濾層析；聚乙二醇沉淀法；質(zhì)粒DNA的純化方法90氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心利用溴化乙錠同線性和閉合環(huán)狀DNA分子的結(jié)合量不同，導(dǎo)致不同構(gòu)型DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫梯度中的浮力密度有所差異，從而達(dá)到分離純化的目的。適于純化：①容易帶上切口的特大質(zhì)粒；②用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的閉環(huán)質(zhì)粒；③用于生物物理學(xué)測定的質(zhì)粒。是大量制備質(zhì)粒的首選方法

。

缺點(diǎn)：昂貴且費(fèi)時(shí)

氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心利用溴化乙錠同線性和閉合環(huán)狀DN91聚乙二醇沉淀法

利用質(zhì)粒相對較小和共價(jià)閉環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分級沉淀的純化方法。1）用LiCl（強(qiáng)脫水劑，能降低RNA的溶解度，使蛋白質(zhì)從染色質(zhì)上脫離）沉淀粗制品中的大分子RNA和蛋白質(zhì)，并用RNase消化小分子RNA；2）含有聚乙二醇（PEG）的高鹽溶液選擇性地沉淀大的質(zhì)粒DNA，使小分子RNA和染色體DNA片段留在上清液中；3）沉淀的質(zhì)粒DNA進(jìn)一步用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀而得到純化。聚乙二醇沉淀法利用質(zhì)粒相對較小和共價(jià)閉環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分級92小分子RNA與DNA片段的去除小分子RNA與DNA片段的污染，能夠提供相當(dāng)多的5’與3’末端。利用DNA末端的酶促反應(yīng)（如末端轉(zhuǎn)移酶、T4DNA連接酶）和測序反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)很關(guān)鍵。用分子篩層析或RNase消化等方法去除污染。小分子RNA與DNA片段的去除小分子RNA與DNA片段的污染93第一節(jié)核酸的化學(xué)組成第二節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第三節(jié)真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化第四節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化第五節(jié)真核細(xì)胞RNA的分離純化一、核酸的分離純化

第一節(jié)核酸的化學(xué)組成一、核酸的分離純化94哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNA分布

rRNA的數(shù)量最多，占80％～85％（主要分為28S、18S、5.8S和5S四種）；低分子量RNA如tRNA、snRNA等占15％～20％；mRNA僅占1％～5％;

第五節(jié)真核細(xì)胞RNA的分離純化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNA分布rRNA的數(shù)量最多，占80％～8595RNA許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)如Northernblot、cDNA合成以及體外翻譯等都以RNA為材料和研究對象，因此從細(xì)胞中分離出足夠數(shù)量、純度和完整性的RNA是至關(guān)重要的，它直接影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。RNA許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)如Northernblot、cDN96RNA化學(xué)性質(zhì)更為活躍：與DNA相比，核糖殘基在2’，3’位帶有羥基。主要為單鏈結(jié)構(gòu)。易受RNA酶（RNase）的切割。RNA化學(xué)性質(zhì)更為活躍：與DNA相比，核糖殘基在2’，3’位97

RNA制備的條件與環(huán)境RNA極易被RNase水解！

RNase

廣泛存在于人的細(xì)胞內(nèi)、皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中；分子結(jié)構(gòu)中二硫鍵的存在使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，煮沸及一般變性劑不能使其完全滅活，待變性劑去除后，活性又可恢復(fù)。

RNA制備的條件與環(huán)境RNA極易被RNase水解！98RNase污染的防止RNA制備中最關(guān)鍵的因素是嚴(yán)格控制制備的條件和環(huán)境，防止RNase的污染??！排除RNase的存在,強(qiáng)有力地抑制其活性一是避免外源性RNase的污染，它主要來源于試劑、實(shí)驗(yàn)器皿和操作者本身；二是抑制內(nèi)源性RNase的活性，它主要來源于樣品中的組織細(xì)胞。RNase污染的防止RNA制備中最關(guān)鍵的因素是嚴(yán)格控制制備的99

RNase的變性劑酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類RNase的特異抑制劑

RNasin（酸性蛋白質(zhì)，能與多種RNase非共價(jià)結(jié)合形成等摩爾復(fù)合物，從而抑制RNase的活力）與DEPC等

β-疏基乙醇（mercaptoethanol）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）等還原劑可還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。RNase的變性劑100

DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。

作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA時(shí)，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）劇毒。DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOO101試劑的聯(lián)合使用在RNA的制備過程中，RNase抑制劑常常和蛋白質(zhì)變性劑和陰離子去污劑等物質(zhì)聯(lián)用，加強(qiáng)對RNase活力的抑制。鹽酸胍或硫氰酸胍溶液是蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白也由于其二級結(jié)構(gòu)被破壞而從核酸上解離下來。同時(shí)，RNase活性能被4mol/L硫氰酸胍和β－巰基乙醇等所滅活。試劑的聯(lián)合使用在RNA的制備過程中，RNase抑制102總RNA的制備方法

一是用有機(jī)溶劑分級提取RNA；二是利用差速離心沉淀將高分子量RNA和其他類型核酸分離開來。

總RNA的制備方法一是用有機(jī)溶劑分級提取RNA；103

商品化的單相裂解試劑法分離RNA

改進(jìn)方案以異硫氰酸胍-酚的單相裂解液裂解細(xì)胞，再加入氯仿后形成兩相。變性的DNA與蛋白質(zhì)介于兩相的交界面，保留于上層水相的RNA，通過異丙醇沉淀與75%乙醇洗滌而制備。位于界面的DNA與蛋白質(zhì)可使用乙醇和異丙醇分級沉淀出來。同時(shí)制備的DNA片段約20kb，可作PCR反應(yīng)的模板，蛋白樣品則主要用于WesternBlot。

Trizol試劑（非柱式）

商品化的單相裂解試劑法分離RNA改進(jìn)方案Trizo104RNaseTrizol試劑protocolRNaseTrizol試劑protocol105InstructionsforRNAisolationInstructionsforRNAisolation106HomogenizationHomogenization107Optional：Optional：108RNAprecipitation，RNAwash，redissolvingtheRNARNAprecipitation，RNAwash，re109RNAIsolatio