分子生物學實驗技術

分子生物學實驗技術目錄實驗一細菌的培養(yǎng) 2實驗二 質粒DNA的提取 3實驗三紫外吸收法測定核酸濃度與純度 4實驗四 水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA 5實驗五質粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定 7實驗六 植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析 8實驗七 聚合酶鏈反應（PCR）技術體外擴增DNA 9實驗八 RNA提取與純化 11實驗九 RT-PCR擴增目的基因cDNA 13DNA15實驗十一 感受態(tài)細胞的制備及轉化16實驗十二克隆的篩選和快速鑒定18實驗十三DNA分析——Southern雜交19—基本操作實驗一、細菌培養(yǎng)實驗二、質粒DNA提取實驗三、紫外吸收法測定核酸濃度與純度實驗五、質粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定DNARNA二、目的基因獲取實驗七、聚合酶鏈式反應（PCR）技術體外擴增DNA實驗九、RT-PCR擴增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表達DNA實驗十一、感受態(tài)細胞的制備及轉化實驗十二、克隆的篩選和快速鑒定實驗十三、DNA分析——Southern雜交實驗一細菌的培養(yǎng)一、目的學習細菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的配置。二、原理在基因工程實驗和分子生物學實驗中，細菌是不可缺少的實驗材料。質粒的保存、增殖和轉化；基因文庫的建立等都離不開細菌。特別是常用的大腸桿菌。3000kb20~30min1×109~2×109/mL。培養(yǎng)基。三、實驗材料、試劑與主要儀器（一）實驗材料大腸桿菌（二）試劑1、胰蛋白胨2、酵母提取物3、氯化鈉4、1mol/LNaOH5、瓊脂粉6、抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素等）（三）儀器1、培養(yǎng)皿2、帶帽試管3、涂布器4、滅菌鍋5、無菌操作臺（含酒精燈、接種環(huán)、滅菌牙簽等）6、恒溫搖床四、操作步驟（一）LB培養(yǎng)基的配制配制每升培養(yǎng)基，應在950m1去離子水中加入細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨 10g細菌培養(yǎng)用酵母提取物 5gNaCl 10g搖動容器直至溶質完全溶解，用1mol/LNaOH調節(jié)pH位至7.0。加入去離水至總體積為lL，在15 lbf／in2(1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min，即為LB液體培養(yǎng)基。LB固體培養(yǎng)基是在其液體培養(yǎng)基的基礎上另加瓊脂粉15g/L。（二）細菌的培養(yǎng)（１）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1、過夜培養(yǎng)⑴取5ml液體培養(yǎng)基加入一只無菌的試管中。⑵用接種環(huán)或滅菌牙簽挑一個單菌落，接種于培養(yǎng)液中。60r/min37℃２、大體積培養(yǎng)1∶1005⑵于37℃，約300r/min劇烈搖動培養(yǎng)。（２）在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 細菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)主要是為了獲得單落和短期保存。平板劃線法分離單菌落⑴采用無菌技術，用接種環(huán)將接種物從平板的一側開始劃線。⑵重新消毒接種環(huán)，從第一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復劃線直至覆蓋整個平板。⑶于37℃培養(yǎng)直至長出單菌落。實驗二 質粒DNA的提取目的原理質粒（plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，具有雙鏈閉環(huán)結構的DNA分子。它具有自主復制能力，能使子代細胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達它攜帶的遺傳信息。目前，質粒已廣泛用作基因工程中目的基因的運載工具——載體。DNADNADNADNADNADNADNADNADNApH=4.8pHDNADNADNARNA、蛋白質-SDS一起沉淀下來而被除去。試劑與器材一、試劑1、LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶解于1000mLNaOHpH7.520min。2、LB1000mLLB15g20min。3、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖,10mmol/LEDTA,25mmol/LTris-HCl(pH8.0)。4、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH,1%SDS。（必須現(xiàn)配）5、溶液Ⅲ：pH4.8（5mo1／L60mL，mL28.5mL）。6、TE緩沖液（pH8.0）：10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA。770%二、器材1、Eppendorf管、離心管架2、10，100，1000ul微量加樣器3、臺式高速離心機4、搖床、高壓滅菌鍋5DH5α（含質粒操作步驟一、培養(yǎng)細菌LB，37℃×24h，5mL，37℃×12h。二、提取步驟11.5ml離心管，8000rpm×1min，殘液。2100ul34ulRNase，室溫×2min。4200ul5min粘稠。5150ul預冷的溶液Ⅲ，溫和混勻（此時應有可見沉淀），min。6、12000rpm×5min。轉移上清液至另一1.5ml離心管中。7、上清液加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，-20℃×20min。8、12000rpm×5min，徹底除去殘液。9500ul70%DNA3000rpm×1min，徹底揮發(fā)除去乙醇。10、加入40ulddH2O溶解DNA，待用。（或用TE溶解，-20℃保存）。實驗三紫外吸收法測定核酸濃度與純度一、目的DNARNA二、原理核酸分子中的堿基集團含有共軛雙鍵，它們對紫外光有強烈的吸收。核酸的260nm230nm?？梢岳煤怂岬倪@一特性對其濃度260nm，A260=1DNA50μg/ml，單鏈DNA為33μg/ml，RNA40μg/ml，寡聚核苷酸為20～30μg/mlA260DNAA260/A280=1.8,純的RNAA260/A280=2.0.中含有蛋白或其它雜質會使其比值下降。三、試劑與儀器（一）試劑TE（二）儀器紫外分光光度計四、操作步驟1、開機，選擇波長20260nm2、選擇A檔，調零4AATETE3、測定樣品TEA2604、計算樣品的濃度DNA=50μg/ml×A260×DNA=33μg/ml×A260×RAN=40μg/ml×A260×核酸總量=樣品濃度×樣品體積（ml