生物化學與分子生物學實驗(終版)課件

生物化學實驗技術生物技術專業(yè)實驗室實驗內(nèi)容生物化學實驗基本操作實驗一雙縮脲法測定血清蛋白質含量實驗二血清丙氨酸氨基轉移酶的測定1、掌握刻度吸量管及分光光度計的使用方法。2、掌握分光光度法測定物質含量的方法。3、熟悉實驗室規(guī)則，實驗報告的書寫要求。4、了解分光光度法的基本原理和溶液的混勻方法。一、[實驗目的]生物化學實驗基本操作要愛護儀器，使用貴重精密儀器應嚴格遵守操作規(guī)程。實驗完畢及時在儀器記錄本上登記，如儀器發(fā)生故障應立即報告指導老師，未經(jīng)許可不得自己隨意檢修。實驗完畢后，個人必須整理自己的實驗臺面。值日生負責做好實驗室的衛(wèi)生，檢查并關好水、電、門、窗。（二）實驗報告要求及格式

實驗X實驗名稱【實驗目的】【實驗原理】【實驗步驟】【實驗結果】【結果分析與討論】（三）刻度吸管的使用1、規(guī)格：0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0（ml）2、使用方法：左手拿球，右手拿管，食指控制液體量，吸液，吸管稍傾斜，抹管尖后調(diào)整液體量。食指輕輕旋轉，放出液體。3、使用注意事項（1）選管：所用吸管規(guī)格最好應稍大于或等于所吸的液體量。（2）抹管尖：在吸血清、標準液時，應用濾紙抹去管外多余的液體。（3）吹管：刻度吸量管注明“吹”字的應吹出殘液。（4）讀數(shù)：液體彎液面的最低點、刻度線上緣與視線在同一水平上。（5）洗管：吸血清的吸管，應及時洗清。（五）分光光度計是運用分光光度法（即比色法）測定物質含量的一種裝置。分光光度法：是根據(jù)物質對光的選擇性吸收及光的吸收定律，對物質進行定性、定量的分析方法。它的理論依據(jù)是Lambert-beer定律（2）光的吸收定律――Lambert－Beer定律A=KCL定義：一束單色光通過介質溶液后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。A：為吸光度C：為溶液濃度L：為溶液層厚度K：為吸光系數(shù)（2）標準對比法（三管法）A樣＝K樣·c樣·L樣A標＝K標·c標·L標同臺儀器，相同厚度吸收池及同一波長測定，故K樣＝K標，L樣＝L標，所以：光的互補示意圖3、選用何種單色光通過溶液?互補色光：兩種適當顏色的單色光按一定強度比例混合可成為白光，這兩種單色光稱為互補色光4、分光光度計的基本結構：光源單色器吸收池檢測器指示器分光光度計的基本結構圖5、722型分光光度計的操作方法接電源，開開關，預熱30分鐘（打開暗盒）；選波長，選擇開關置于“T”，“調(diào)0”點；盛空白，裝樣品，關暗盒，調(diào)“100%”；將選擇開關置于“A”，拉動拉桿，記讀數(shù)；取出比色杯，關上暗盒及開關，拔掉電源；6、注意事項（1）為了防止光電管疲勞，不測定時必須將比色槽暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長電管使用壽命。（2）手拿比色杯粗面，裝液量一般占比色杯體積的2/3～3/4；（3）本型儀器A值在0.1～0.8之間誤差較小，準確度較高。一、實驗目的1、掌握雙縮脲法測定蛋白質的原理及操作方法2、了解血清總蛋白測定的臨床意義二、實驗原理什么是肽鍵？什么是雙縮脲？O2NH2-C-NH2H2N-CO-NH-CO-NH2+NH2尿素雙縮脲（-CO-NH-）三、實驗步驟1、“三管法”，取中號試管3支，按下表加入試劑：加入物（mL）管號測定管標準管空白管待測溶液0.05——蛋白標準液—0.6—0.9%NaCl2.952.43.0雙縮脲試劑3.03.03.037℃保溫10分鐘，722-分光光度計540nm波長以空白管調(diào)節(jié)零點比色，記錄各管吸光度。2、待測溶液蛋白含量計算：例如，已知蛋白標準液蛋白質含量為5mg/mL，則（標準管）蛋白含量為1mg/mL，計算待測溶液蛋白含量為：×1mg/mL×60（稀釋倍數(shù)）=mg/mL五、臨床意義正常成人血清總蛋白含量為：60-80g/L。血清總蛋白增高：（1）血液濃縮，導致總蛋白濃度相對增高；（2）血漿蛋白質合成增加：主要見于球蛋白合成增加，如多發(fā)性骨髓瘤患者。血清總蛋白降低：（1）血液稀釋，導致總蛋白濃度相對降低；（2）消耗增加：如甲狀腺功能亢進，惡性腫瘤等。（3）蛋白質丟失：如腎病綜合征病人大量蛋白從尿液中丟失。六、思考題蛋白質測定的方法有哪些？請簡述其原理？實驗二血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定——賴氏法P148ALT測定方法速率法手工法賴氏法（30min）金氏法（60min）穆氏法（60min）三種方法的測定原理、操作、試劑和采用溫度等方面均完全相同，只是酶與底物反應的時間與正常參考范圍不同。二、實驗原理丙氨酸-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸1、轉氨基作用2、顯色反應=505nm加入物(ml)測定空白管測定管血清0.10.1基質緩沖液－0.5混勻后，置37℃保溫30min2,4二硝基苯肼溶液0.50.5基質緩沖液0.5－混勻后，置37℃保溫20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.01、測定管及測定空白管的制備三、實驗步驟加入物(ml)試劑空白管標準管0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.10.12.0mmol/L丙酮酸標準液00.05基質緩沖液0.500.452,4-二硝基苯肼溶液0.50.5混勻，37℃水浴20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.02、標準管及試劑空白管的制備3、室溫放置5min，在波長505nm處以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。四、實驗結果【參考范圍】5～25卡門氏單位。

測定管吸光度測定空白管吸光度標準管吸光度試劑空白管吸光度=28（卡門氏單位）酶活力計算：不做標準曲線時，可以做28卡門氏單位的標準管，按下式計算：五、注意事項1、吸血清、標準液的量要準確。2、充分混勻使反應充分。3、酶促反應的時間要把控好。4、嚴重脂血癥、黃疸及溶血血清可增加測定的吸光度，應作血清標本對照管六、臨床意義A