高效液相色譜培訓課件

高效液相色譜培訓2022/12/22高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓2022/12/19高效液相色譜培訓1基本原理和特點液相色譜儀器部件實驗操作與應(yīng)用日常維護高效液相色譜培訓基本原理和特點高效液相色譜培訓2基本原理和特點

基本原理：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時,由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附,分配,離子吸引,排阻,親和)的大小,強弱不同,在固定相中滯留時間不同,從而先后從固定相中流出.特點：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動化。高效液相色譜培訓基本原理和特點

基本原理：溶于流動相(mobilephas3一些商品化儀器脫氣裝置四元泵檢測器柱溫箱樣品盤控溫箱流動相高效液相色譜培訓一些商品化儀器脫氣裝置四元泵檢測器柱溫箱樣品盤控溫4啟動液相色譜儀器的流程開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源打開泵、自動進樣器、檢測器電源，待設(shè)備通過自檢后，打開計算機啟動色譜管理軟件準備流動相過濾，脫氣色譜泵排氣用新配制的流動相灌注泵高效液相色譜培訓啟動液相色譜儀器的流程開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源高效液5高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)高效液相色譜培訓高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)高效液相色譜培訓6溶劑色譜泵自動進樣器

HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜流程圖高效液相色譜培訓溶劑色譜泵自動進樣器HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)7高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓8液相色譜的流動相高效液相色譜培訓液相色譜的流動相高效液相色譜培訓9液相柱---保留值與pH的關(guān)系pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：ZorbaxStableBondC184.6*250mm,5um流動相：27%甲醇：73%磷酸pH：2.5&2.6溫度：50℃流速：1.0mL/min.高效液相色譜培訓液相柱---保留值與pH的關(guān)系pH變化值RS變化值1.6色102.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分按極性分：極性、弱極性、非極性按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫

高效液相色譜培訓2.流動相類別按流動相組成分：單組分和多11對溶劑的要求水：去離子水自動純水儀純凈水商品瓶裝水溶劑:

色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇）試劑:分析純高效液相色譜培訓對溶劑的要求水：高效液相色譜培訓12不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間越短。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。

高效液相色譜培訓不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間13過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對測定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積

2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形

3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動

過濾與脫氣高效液相色譜培訓過濾：0.45um或更小孔徑濾膜過濾與脫氣高效液相色譜培訓14高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓15高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓16流動相的保存有機溶劑流動相：室溫下密封，避光保存緩沖鹽流動相：當日現(xiàn)配現(xiàn)用：低溫下密封保存，一般不超過3天防止微生物生長有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相：低溫密封保存防止有機相的揮發(fā)選用適宜的容器高效液相色譜培訓流動相的保存有機溶劑流動相：高效液相色譜培訓171．梯度洗脫的特點（1）改善分離,加快分析速度；（2）改善峰形,減少拖尾,有利于痕量組分的檢測；（3）增加峰容量；（4）強烈滯留的組分不容易殘留在柱上,保持柱性能長期良好；（5）下次分析時,流動相需要一段平衡時間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異,可能會引起基線漂移高效液相色譜培訓1．梯度洗脫的特點（1）改善分離,加快分析速度；高效液相色182．梯度洗脫的主要條件①A流動相/弱溶劑組成；②B流動相/強溶劑組成；③梯度時間；④梯度曲線：線性、凸型或凹型等。強溶劑

A%time125高效液相色譜培訓2．梯度洗脫的主要條件①A流動相/弱溶劑組成；強溶劑19梯度洗脫123高效液相色譜培訓梯度洗脫123高效液相色譜培訓20高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓21梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計不當，梯度的

準確性受影響滯后體積（系統(tǒng)

體積）設(shè)計合理高效液相色譜培訓梯度：低壓混合低壓梯度高效液相色譜培訓22梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意∶滯后體積包括進樣器、阻尼器、混合器及其管路比例閥檢測器進樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器高效液相色譜培訓梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯23梯度滯后大小的影響滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為2~4ml高效液相色譜培訓梯度滯后大小的影響滯后體積太大會引起梯度變化的延遲高效液相色24滯后體積變化的影響設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)高效液相色譜培訓滯后體積變化的影響設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化25液相色譜的色譜柱高效液相色譜培訓液相色譜的色譜柱高效液相色譜培訓26高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓27色譜柱的連接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積高效液相色譜培訓色譜柱的連接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積28錐箍錐度不合適造成滲漏色譜柱的連接高效液相色譜培訓錐箍錐度不合適造成滲漏色譜柱的連接高效液相色譜培訓29除去柱上端固定相變色部分(約3mm左右)，再補充新的固定相。色譜柱吸附未被洗脫成分時，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進行洗凈。采用梯度洗脫時，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生?？赡芴岣咧У姆椒ǜ咝б合嗌V培訓除去柱上端固定相變色部分(約3mm左右)，再補充新的固定相30HPLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進這種關(guān)系高效液相色譜培訓HPLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號高效液31理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性高效液相色譜培訓理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音高效液相色譜培32靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N=2~4定量限（LOQ）：S/N=8~10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性 6:1NS高效液相色譜培訓靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比33吸光度（AbsorbanceUV/Vis）檢測目前實驗室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測器是吸光度檢測器（其中50%是多波長，25%是PDA）測量通過溶液后的紫外或可見光光強度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大高效液相色譜培訓吸光度（AbsorbanceUV/Vis）檢測目前實驗室中34吸光度檢測器（UV/Vis）－優(yōu)點這種檢測器簡單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實驗并且是非破壞性的大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm高效液相色譜培訓吸光度檢測器（UV/Vis）－優(yōu)點這種檢測器簡單、可靠AU35吸光度檢測器（UV/Vis）－缺點由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器對某些化合物的檢測靈敏度不及其他檢測器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長受流動相組成的影響：用截止波長以上至少5～10nm作為工作波長緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響高效液相色譜培訓吸光度檢測器（UV/Vis）－缺點由于不是所有化合物都有吸36背景吸收對紫外檢測器噪音的影響UVSpectrumofEluentswith0.1%TFAAgainstHPLCGradeH2OBlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20with0.1%TFA50%ACNwith0.1%TFA高效液相色譜培訓背景吸收對紫外檢測器噪音的影響UVSpectrumof37溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱：

C18,

5μm,3.9x150mmat35oC.流動相：

A:0.1%TFAinWater. B:0.1%TFAinAcetonitrile.梯度：5-40%Bin35min.流速：1.0mL/min.樣品：水（10μLinj.vol.）檢測：214nm

圖1；好的梯度系統(tǒng)

圖2；一般的二元梯度系統(tǒng)

圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)高效液相色譜培訓溶劑混合的基線噪音色譜條件圖1；好的梯度系統(tǒng)圖2；一38為何如此重要？五個小肽的5ng進樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個峰則消失在基線噪音中。高效液相色譜培訓為何如此重要？五個小肽的5ng進樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別39基線噪音對積分的影響1.2241.1831.183Caffeine@271nm高效液相色譜培訓基線噪音對積分的影響1.2241.1831.183Caffe40維護流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器進樣器檢測器高效液相色譜培訓維護流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器進樣器檢測器高效液41吸濾頭－－定期清洗，更換溶劑時單向閥－－定期清洗，壓力波動大時泵－－自動清洗在線過濾器－壓力大時清洗高效液相色譜培訓吸濾頭－－定期清洗，更換溶劑時高效液相色譜培訓42材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成措施：用5％稀硝酸，超聲波清洗，再用蒸餾水清洗吸濾頭高效液相色譜培訓材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um吸濾頭高效液相色譜培訓43高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓44高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓45故障：寶石球或塑料墊片受污導致密封不好表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大措施：打開排液閥，以異丙醇為流動相輸液拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波清洗單向閥高效液相色譜培訓故障：寶石球或塑料墊片受污導致密封不好單向閥高效液相色譜培訓46故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力偏高措施：5％稀硝酸，超聲波清洗判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力>3kgf/cm2，則堵塞。線路過濾器排液閥壓力傳感器線路過濾器流動相高效液相色譜培訓故障：堵塞線路過濾器排液閥壓力傳感器線路過濾器流動相高效液相47泵的保養(yǎng)：使用流動相盡量要清潔；進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相交換時要防止沉淀；避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染；高效液相色譜培訓泵的保養(yǎng)：使用流動相盡量要清潔；高效液相色譜培訓48柱的保養(yǎng)：柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；當柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；進樣樣品要提純；嚴格控制進樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結(jié)束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗?；若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當有機溶劑保存并封閉；高效液相色譜培訓柱的保養(yǎng)：柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；高效液相49色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時間單次樣品運行時間=分析時間+色譜柱平衡時間色譜柱平衡時間=10倍柱內(nèi)體積÷流速

4.6x50 0.5mL 5min 4.6x30 0.3mL 3min 4.6x15 0.15mL 1.5min 4.6x150 1.54mL 15min

2.1x50 0.10mL 5min 60sec 2.1x30 0.06mL 3min 36sec 2.1x15 0.03mL 1.5min 18sec

色譜柱 柱內(nèi)平衡時間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)1.0mL/min

色譜柱 柱內(nèi)平衡時間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)0.2mL/min1.0mL/min高效液相色譜培訓色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時間單次樣品運行時間=分析時間+50色譜柱清洗保存反相色譜柱：用20%甲醇溶液清洗10個柱體積，保存在90%的甲醇溶液中。分子篩色譜柱：用純水清洗10個柱體積，保存在5%疊氮化鈉水溶液中。離子色譜柱：用0.02M鹽，pH6.5溶液清洗10個柱體積，保存在含5%疊氮化鈉0.02M鹽，pH6.5溶液中。短期保存在低鹽的流動相中。高效液相色譜培訓色譜柱清洗保存高效液相色譜培訓51燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。樣品池要保養(yǎng)高效液相色譜培訓燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成52謝謝！高效液相色譜培訓謝謝！高效液相色譜培訓53演講完畢，謝謝聽講!再見，seeyouagain3rew2022/12/22高效液相色譜培訓演講完畢，謝謝聽講!再見，seeyouagain3rew54高效液相色譜培訓2022/12/22高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓2022/12/19高效液相色譜培訓55基本原理和特點液相色譜儀器部件實驗操作與應(yīng)用日常維護高效液相色譜培訓基本原理和特點高效液相色譜培訓56基本原理和特點

基本原理：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時,由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附,分配,離子吸引,排阻,親和)的大小,強弱不同,在固定相中滯留時間不同,從而先后從固定相中流出.特點：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動化。高效液相色譜培訓基本原理和特點

基本原理：溶于流動相(mobilephas57一些商品化儀器脫氣裝置四元泵檢測器柱溫箱樣品盤控溫箱流動相高效液相色譜培訓一些商品化儀器脫氣裝置四元泵檢測器柱溫箱樣品盤控溫58啟動液相色譜儀器的流程開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源打開泵、自動進樣器、檢測器電源，待設(shè)備通過自檢后，打開計算機啟動色譜管理軟件準備流動相過濾，脫氣色譜泵排氣用新配制的流動相灌注泵高效液相色譜培訓啟動液相色譜儀器的流程開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源高效液59高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)高效液相色譜培訓高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)高效液相色譜培訓60溶劑色譜泵自動進樣器

HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜流程圖高效液相色譜培訓溶劑色譜泵自動進樣器HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)61高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓62液相色譜的流動相高效液相色譜培訓液相色譜的流動相高效液相色譜培訓63液相柱---保留值與pH的關(guān)系pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：ZorbaxStableBondC184.6*250mm,5um流動相：27%甲醇：73%磷酸pH：2.5&2.6溫度：50℃流速：1.0mL/min.高效液相色譜培訓液相柱---保留值與pH的關(guān)系pH變化值RS變化值1.6色642.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分按極性分：極性、弱極性、非極性按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫

高效液相色譜培訓2.流動相類別按流動相組成分：單組分和多65對溶劑的要求水：去離子水自動純水儀純凈水商品瓶裝水溶劑:

色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇）試劑:分析純高效液相色譜培訓對溶劑的要求水：高效液相色譜培訓66不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間越短。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。

高效液相色譜培訓不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間67過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對測定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積

2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形

3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動

過濾與脫氣高效液相色譜培訓過濾：0.45um或更小孔徑濾膜過濾與脫氣高效液相色譜培訓68高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓69高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓70流動相的保存有機溶劑流動相：室溫下密封，避光保存緩沖鹽流動相：當日現(xiàn)配現(xiàn)用：低溫下密封保存，一般不超過3天防止微生物生長有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相：低溫密封保存防止有機相的揮發(fā)選用適宜的容器高效液相色譜培訓流動相的保存有機溶劑流動相：高效液相色譜培訓711．梯度洗脫的特點（1）改善分離,加快分析速度；（2）改善峰形,減少拖尾,有利于痕量組分的檢測；（3）增加峰容量；（4）強烈滯留的組分不容易殘留在柱上,保持柱性能長期良好；（5）下次分析時,流動相需要一段平衡時間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異,可能會引起基線漂移高效液相色譜培訓1．梯度洗脫的特點（1）改善分離,加快分析速度；高效液相色722．梯度洗脫的主要條件①A流動相/弱溶劑組成；②B流動相/強溶劑組成；③梯度時間；④梯度曲線：線性、凸型或凹型等。強溶劑

A%time125高效液相色譜培訓2．梯度洗脫的主要條件①A流動相/弱溶劑組成；強溶劑73梯度洗脫123高效液相色譜培訓梯度洗脫123高效液相色譜培訓74高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓75梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計不當，梯度的

準確性受影響滯后體積（系統(tǒng)

體積）設(shè)計合理高效液相色譜培訓梯度：低壓混合低壓梯度高效液相色譜培訓76梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意∶滯后體積包括進樣器、阻尼器、混合器及其管路比例閥檢測器進樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器高效液相色譜培訓梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯77梯度滯后大小的影響滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為2~4ml高效液相色譜培訓梯度滯后大小的影響滯后體積太大會引起梯度變化的延遲高效液相色78滯后體積變化的影響設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)高效液相色譜培訓滯后體積變化的影響設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化79液相色譜的色譜柱高效液相色譜培訓液相色譜的色譜柱高效液相色譜培訓80高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓81色譜柱的連接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積高效液相色譜培訓色譜柱的連接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積82錐箍錐度不合適造成滲漏色譜柱的連接高效液相色譜培訓錐箍錐度不合適造成滲漏色譜柱的連接高效液相色譜培訓83除去柱上端固定相變色部分(約3mm左右)，再補充新的固定相。色譜柱吸附未被洗脫成分時，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進行洗凈。采用梯度洗脫時，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生。可能提高柱效的方法高效液相色譜培訓除去柱上端固定相變色部分(約3mm左右)，再補充新的固定相84HPLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進這種關(guān)系高效液相色譜培訓HPLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號高效液85理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性高效液相色譜培訓理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音高效液相色譜培86靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N=2~4定量限（LOQ）：S/N=8~10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性 6:1NS高效液相色譜培訓靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比87吸光度（AbsorbanceUV/Vis）檢測目前實驗室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測器是吸光度檢測器（其中50%是多波長，25%是PDA）測量通過溶液后的紫外或可見光光強度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大高效液相色譜培訓吸光度（AbsorbanceUV/Vis）檢測目前實驗室中88吸光度檢測器（UV/Vis）－優(yōu)點這種檢測器簡單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實驗并且是非破壞性的大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm高效液相色譜培訓吸光度檢測器（UV/Vis）－優(yōu)點這種檢測器簡單、可靠AU89吸光度檢測器（UV/Vis）－缺點由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器對某些化合物的檢測靈敏度不及其他檢測器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長受流動相組成的影響：用截止波長以上至少5～10nm作為工作波長緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響高效液相色譜培訓吸光度檢測器（UV/Vis）－缺點由于不是所有化合物都有吸90背景吸收對紫外檢測器噪音的影響UVSpectrumofEluentswith0.1%TFAAgainstHPLCGradeH2OBlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20with0.1%TFA50%ACNwith0.1%TFA高效液相色譜培訓背景吸收對紫外檢測器噪音的影響UVSpectrumof91溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱：

C18,

5μm,3.9x150mmat35oC.流動相：

A:0.1%TFAinWater. B:0.1%TFAinAcetonitrile.梯度：5-40%Bin35min.流速：1.0mL/min.樣品：水（10μLinj.vol.）檢測：214nm

圖1；好的梯度系統(tǒng)

圖2；一般的二元梯度系統(tǒng)

圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)高效液相色譜培訓溶劑混合的基線噪音色譜條件圖1；好的梯度系統(tǒng)圖2；一92為何如此重要？五個小肽的5ng進樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個峰則消失在基線噪音中。高效液相色譜培訓為何如此重要？五個小肽的5ng進樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別93基線噪音對積分的影響1.2241.1831.183Caffeine@271nm高效液相色譜培訓基線噪音對積分的影響1.2241.1831.183Caffe94維護流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器進樣器檢測器高效液相色譜培訓維護流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器進樣器檢測器高效液95吸濾頭－－定期清洗，更換溶劑時單向閥－－定期清洗，壓力波動大時泵－－自動清洗在線過濾器－壓力大時清洗高效液相色譜培訓吸濾頭－－定期清洗，更換溶劑時高效液相色譜培訓96材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成措施：用5％稀硝酸，超聲波清洗，再用蒸餾水清洗吸濾頭高效液相色譜培訓材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um吸濾頭高效液相色譜培訓97高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓98高效液相色譜培訓高效液相色譜培訓99故障：寶石球或塑料墊片受污導致密封不好表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大措施：打開排液閥，以異丙醇為流動相輸液拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波清洗單向閥高效液相色譜培訓故障：寶石球或塑料墊片受污導致密封不好單向閥高效液相色譜培訓100故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力