第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件

第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種

轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標，從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運載進入受體作物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達的遺傳工程體，并經(jīng)過田間試驗與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標1它涉及目的基因的分離與改造、載體的構(gòu)建及其與目的基因的連接等DNA重組技術(shù)；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍轟擊等方法使重組體進入受體細胞或組織以及轉(zhuǎn)化體的篩選、鑒定等遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和相配套的組織培養(yǎng)技術(shù)；獲得攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因植株(遺傳工程體)；遺傳工程體在有控條件下的安全性評價以及大田育種研究直至育成品種。它涉及目的基因的分離與改造、載體的構(gòu)建及其與目的基因的連接等2與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢。主要體現(xiàn)在：(1)轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)體系的建立使可利用的基因資源大大拓寬。實踐表明，從動物、植物、微生物中分離克隆的基因，通過轉(zhuǎn)基因的方法可使其在三者之間相互轉(zhuǎn)移利用。(2)轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗，適應(yīng)各種不良環(huán)境條件的優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑。這既可大大減少殺蟲劑、殺菌劑的使用，有利于環(huán)境保護，也可以提高作物的生產(chǎn)能力、擴大作物品種的適應(yīng)性和種植區(qū)域。

與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，3(3)利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)可以對植物的目標性狀進行定向變異和定向選擇，同時隨著對基因認識的不斷深入和轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段的完善，對多個基因進行定向操作也將成為可能，這在常規(guī)育種中是難以想象的。(4)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以大大提高選擇效率，加快育種進程。此外，通過轉(zhuǎn)基因的方法，還可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等生物制品。正是由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種具有上述強大的優(yōu)勢，使得轉(zhuǎn)基因技術(shù)從發(fā)現(xiàn)到如今僅僅30年的歷史就得到了快速的發(fā)展。(3)利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)可以對植物的目標性狀進行定向變異和定4第一節(jié)

作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀(一)國際轉(zhuǎn)基因植物研究與現(xiàn)狀自從20世紀70年代重組DNA技術(shù)創(chuàng)建到1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，至今已有35個科120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。先后有30多個國家批準了3000多例田間試驗，涉及的植物種類有40多種，2000年已有13個國家種植了商品化的轉(zhuǎn)基因植物。2019—2019年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積增加很快(圖16—1)。到2019年全世界已種植轉(zhuǎn)基因作物5260萬hm2。第一節(jié)

作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀5第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件6目前所種植的轉(zhuǎn)基因作物主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，其中以轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積最大。轉(zhuǎn)基因作物的主要目標集中在培育具有抗除草劑特性的農(nóng)作物優(yōu)良品種,其次為培育抗蟲和毒病新品種上。

目前所種植的轉(zhuǎn)基因作物主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，其中以7(二)我國轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況我國是世界上第一個商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國家。自行培育的雙價轉(zhuǎn)基因煙草的抗病蟲性達到60％，產(chǎn)量比對照增加15％，產(chǎn)值增加20％，1992年每畝增產(chǎn)200元，遺憾的是由于市場的原因現(xiàn)已不推廣。(二)我國轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況8據(jù)農(nóng)業(yè)部資料，到2019年我國已批準進行中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項，包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物；主要目標性狀是抗蟲、抗病、耐鹽、抗凍、耐儲藏和抗衰老等。已批準環(huán)境釋放的有49項，包括水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹、煙草等10種。據(jù)農(nóng)業(yè)部資料，到2019年我國已批準進行中試的轉(zhuǎn)基因作物有49目前經(jīng)農(nóng)業(yè)部審查并經(jīng)全國基因工程安全委員會批準商品化生產(chǎn)的作物已有我國自行研制開發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花、美國Monsanto公司開發(fā)的Bt抗蟲棉、延遲成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄、抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因番茄、抗CMV轉(zhuǎn)基因甜椒及轉(zhuǎn)查爾酮合酶(CHS)反義RNA基因矮牽牛。但是除了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉已經(jīng)大面積生產(chǎn)外，后幾種作物的種植面積僅在1hm2左右。目前經(jīng)農(nóng)業(yè)部審查并經(jīng)全國基因工程安全委員會批準商品化生產(chǎn)的作10第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件11第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件12

二、轉(zhuǎn)基因育種的程序利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行作物育種的基本過程可分為：目的基因或DNA的獲得；含有目的基因或者DNA的重組質(zhì)粒的構(gòu)建；受體材料的選擇和再生系統(tǒng)的建立；轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定；轉(zhuǎn)基因植株的育種利用。二、轉(zhuǎn)基因育種的程序13

(一)目的基因的獲得目的基因的獲得是利用作物轉(zhuǎn)基因育種的第一步。根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：根據(jù)基因表達的產(chǎn)物——蛋白進行基因克??；從基因組DNA或mRNA序列克隆基因。(一)目的基因的獲得14

(二)目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過上述方法克隆得到目的基因只是為利用外源基因提供了基礎(chǔ)，要將外源基因轉(zhuǎn)移到受體植株還必須對目的基因進行體外重組。質(zhì)粒重組的基本步驟包括：從原核生物中獲取目的基因的載體并進行改造；利用限制性內(nèi)切酶將載體切開，并用連接酶把目的基因連接到載體上，獲得DNA重組體。(二)目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建15已經(jīng)分離的目的基因一般都保存在大腸桿菌內(nèi)的一類輔助質(zhì)粒中，常用的有pBR322系列、pUC以及pBluescriptK+(—)系列等。在進行外源基因轉(zhuǎn)移前還必須將外源基因重組到合適的載體上，具體采用哪種載體要根據(jù)轉(zhuǎn)基因的方法和目的而定。Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的結(jié)構(gòu)見圖16—6、16—7。已經(jīng)分離的目的基因一般都保存在大腸桿菌內(nèi)的一類輔助質(zhì)粒中，常16第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件17第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件18(三)受體材料的選擇受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。能否建立穩(wěn)定、高效、易于再生的受體系統(tǒng)是植物轉(zhuǎn)基因操作的關(guān)鍵技術(shù)之一。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：①高效穩(wěn)定的再生能力；②受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；③具有穩(wěn)定的外植體來源，即用于轉(zhuǎn)化的受體要易于得到而且可以大量供應(yīng)，如胚和其他器官等；④對篩選劑敏感，即當轉(zhuǎn)化體篩選培養(yǎng)基中篩選劑濃度達到一定值時，能夠抑制非轉(zhuǎn)化植株細胞的生長、發(fā)育和分化，而轉(zhuǎn)化細胞、植株能正常生長、發(fā)育和分化形成完整的植株。(三)受體材料的選擇19雖然對植物組織培養(yǎng)的研究已有幾十年的歷史，對于許多重要的農(nóng)作物已經(jīng)建立起比較成熟的再生系統(tǒng)，但是建立一個良好的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)與現(xiàn)有的組織培養(yǎng)獲得再生植株水平之間還有很大的差距。目前受體材料系統(tǒng)存在的主要問題是：再生率低，基因型依賴性強，再生細胞部位與轉(zhuǎn)化部位不一致等，常用的受體材料有以下幾大類型。雖然對植物組織培養(yǎng)的研究已有幾十年的歷史，對于許多重要的農(nóng)作20

1．愈傷組織再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)是指外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，再通過分化培養(yǎng)獲得再生植株的再生系統(tǒng)。愈傷組織受體再生系統(tǒng)具有外植體材料來源廣泛，繁殖迅速，易于接受外源基因，并且轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點；缺點是轉(zhuǎn)化的外源基因遺傳穩(wěn)定性差，容易出現(xiàn)嵌合體。1．愈傷組織再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)是指外植體材料經(jīng)過212．直接分化再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)是指外植體材料細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。此類再生系統(tǒng)的優(yōu)點是獲得再生系統(tǒng)的周期短、操作簡單，體細胞變異小，并且能夠保持受體材料的遺傳穩(wěn)定性；缺點是對于有些植物，尤其是包括玉米、小麥、水稻在內(nèi)的多數(shù)禾本科作物進行莖尖分生培養(yǎng)相當困難，遺傳轉(zhuǎn)化率要比愈傷組織再生系統(tǒng)低。2．直接分化再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)是指外植體材料細胞不223．原生質(zhì)體再生系統(tǒng)由于原生質(zhì)體具有全能性，能夠在適當培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出再生植株，也可以作為受體材料，事實上原生質(zhì)體受體系統(tǒng)是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。原生質(zhì)體受體再生系統(tǒng)的優(yōu)點是能夠直接高效、廣泛地攝取外源DNA或遺傳物質(zhì)，可以獲得基因型一致的克隆細胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，并適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點是不易制備、再生困難和變異程度高等。3．原生質(zhì)體再生系統(tǒng)由于原生質(zhì)體具有全能性，能夠在適當培23

4．胚狀體再生系統(tǒng)胚狀體是指具有胚胎性質(zhì)的個體。胚狀體作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體具有個體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因的能力強，轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生等優(yōu)點。不足之處是所需技術(shù)含量較高，多數(shù)禾本科作物在內(nèi)的許多種植物上不易獲得胚狀體，使胚狀體再生受體系統(tǒng)的應(yīng)用受到了很大的限制。4．胚狀體再生系統(tǒng)胚狀體是指具有胚胎性質(zhì)的個體。胚狀體24

5．生殖細胞受體系統(tǒng)利用植物自身的生殖過程，以生殖細胞如花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)被稱為生殖細胞受體系統(tǒng)。目前主要從兩個途徑利用生殖細胞進行基因轉(zhuǎn)化：一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)人法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。由于該受體系統(tǒng)與上述其他受體系統(tǒng)相比有許多優(yōu)點，因此近年來發(fā)展很快。5．生殖細胞受體系統(tǒng)利用植物自身的生殖過程，以生殖細胞25

(四)轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化選擇適宜的遺傳轉(zhuǎn)化方法是提高遺傳轉(zhuǎn)化率的重要環(huán)節(jié)之一。盡管轉(zhuǎn)基因的具體方法很多，但是概括起來說主要有兩類。第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。(四)轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化261．載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)載體法是目前為止最常見的一類轉(zhuǎn)基因方法。其基本原理是將外源基因重組進入適合的載體系統(tǒng)，通過載體攜帶將外源基因?qū)酥参锛毎⒄显诤巳旧w組中，并隨著核染色體一起復(fù)制和表達。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。采用載體介導(dǎo)進行基因轉(zhuǎn)移的具體方法包括：1．載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)載體法是目前為止最常見的一類轉(zhuǎn)基因方27

(1)葉盤法。葉盤法是雙子葉植物較為常用、簡單有效的方法。選取健康的無菌苗，用打孔器打出葉圓盤，將帶有新鮮傷口的葉圓盤與載有目的基因的農(nóng)桿菌液進行短期共培養(yǎng)，農(nóng)桿菌通過傷口感染將外源目的基因?qū)思毎麅?nèi)并整合到植物基因組中。

(1)葉盤法。葉盤法是雙子葉植物較為常用、簡單有效的方法。28

(2)真空滲入法。將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。這是一種簡便、快速、可靠而且不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉(zhuǎn)化植株的基因轉(zhuǎn)移方法，具有良好的研究與應(yīng)用前景。(2)真空滲入法。將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源29(3)原生質(zhì)體共培養(yǎng)法。原生質(zhì)體法是指在原生質(zhì)培養(yǎng)的早期，將攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體共同培養(yǎng)，農(nóng)桿菌的Ti或Ri上攜帶有目的基因的T—DNA區(qū)段就會隨著外源信號分子的誘導(dǎo)而導(dǎo)入原生質(zhì)體的核內(nèi)，并整合到受體基因組上。(3)原生質(zhì)體共培養(yǎng)法。原生質(zhì)體法是指在原生質(zhì)培養(yǎng)的早期，將30

2．外源基因直接導(dǎo)入法外源基因直接導(dǎo)人技術(shù)是一種不需借助載體介導(dǎo)，直接利用理化因素進行外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法，主要包括化學刺激法、基因槍轟擊法等。2．外源基因直接導(dǎo)入法外源基因直接導(dǎo)人技術(shù)是一種不需借31

(1)化學刺激法。化學刺激法是借助于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或者多聚—L—鳥苷酸(PLO)等細胞融合劑的作用，使細胞膜表面電荷發(fā)生紊亂，干擾細胞間的識別，使細胞膜之間、DNA／RNA與細胞膜之間形成分子橋，促使細胞膜間的相互融合(接觸和粘連)和外源DNA／RNA進入原生質(zhì)體。(1)化學刺激法。化學刺激法是借助于聚乙二醇(PEG)、聚32

(2)基因槍轟擊法?；驑屴Z擊法也稱為微彈轟擊技術(shù)和粒子槍法，其基本原理是將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，然后借助高壓動力射人受體細胞或組織，當微粒上的DNA進入細胞后將整合到植物基因組中并得以表達。按照動力來源可將基因槍分為火藥動力基因槍、高壓氣體動力基因槍和高壓放電動力基因槍。(2)基因槍轟擊法?；驑屴Z擊法也稱為微彈轟擊技術(shù)和粒子槍33由于基因槍法的操作對象可以是完整的細胞或組織，這就克服了受體材料的限制，而且不必制備原生質(zhì)體，因此實驗步驟簡單易行，具有相當廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為研究植物細胞轉(zhuǎn)化和創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因植物的最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。由于基因槍法的操作對象可以是完整的細胞或組織，這就克服了受體34(3)高壓電穿孔法。又稱為電擊法，是利用高壓電流脈沖在細胞質(zhì)膜上形成瞬間微孔，使DNA直接通過微孔或者作為微孔閉合時伴隨發(fā)生的膜組分重新分布進入細胞質(zhì)并整合到宿主細胞中。與原生質(zhì)體融合和磷酸鈣沉淀法相比，通過高壓電穿孔法獲得的轉(zhuǎn)化植株外源DNA整合拷貝數(shù)較低，對受體細胞的選擇性不強，但是要獲得對特定的宿主細胞的最佳轉(zhuǎn)化條件(如電場強度、電擊時間等)需要大量的前期工作。(3)高壓電穿孔法。又稱為電擊法，是利用高壓電流脈沖在細胞質(zhì)35(4)微注射法。此法是利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細胞固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進入受體細胞。所用受體一般是原生質(zhì)體或生殖細胞，對于具有較大子房或胚囊的植株則無須進行細胞固定，在田間就可以進行活體操作，被稱為“子房注射法”或“花粉管通道法”。微注射法的優(yōu)點是可以進行活體操作，不影響植物體正常的發(fā)育進程。田間子房注射操作簡便、成本低。但只對子房比較大的植物有效，對于種子很小的植物操作要求精度高，需要顯微操作，轉(zhuǎn)化率也相對較低，而且轉(zhuǎn)基因后代容易出現(xiàn)嵌合體。(4)微注射法。此法是利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸36(5)其他直接轉(zhuǎn)化方法。隨著科技的不斷前進，人們先后又發(fā)明了多種直接轉(zhuǎn)化方法，如超聲波介導(dǎo)法、脈沖電泳法和離子束介導(dǎo)等方法，但是由于上述方法技術(shù)還不成熟、轉(zhuǎn)化率低，有的原理不清楚或者是所需設(shè)備太昂貴，因此在實際中的應(yīng)用受到了限制。(5)其他直接轉(zhuǎn)化方法。隨著科技的不斷前進，人們先后又發(fā)明了37

(五)轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1．轉(zhuǎn)化體的篩選外源目的基因在植物受體細胞中的轉(zhuǎn)化頻率往往是相當?shù)偷?，在?shù)量龐大的受體細胞群體中，通常只有為數(shù)不多的一小部分獲得了外源DNA，而其中目的基因已被整合到核基因組并實現(xiàn)表達的轉(zhuǎn)化細胞則更加稀少。為了有效地選擇出這些真正的轉(zhuǎn)化細胞，必要使用特異性的選擇標記基因進行標記。(五)轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定38常用選擇標記基因包括抗生素抗性基因及除草劑抗性基因兩大類，如卡那霉素抗性基因NPTⅡ和潮霉素抗性基因hpt，除草劑抗性基因bar基因和Glyphosate抗性基因epsps等。在實際工作中，是將選擇標記基因與適當啟動子構(gòu)成嵌合基因并克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時進行轉(zhuǎn)化。當標記基因被導(dǎo)入受體細胞之后，就會使轉(zhuǎn)化細胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力，抑制、殺死非轉(zhuǎn)化細胞，轉(zhuǎn)化細胞則能夠存活下來。由于目的基因和標記基因同時整合進入受體細胞的比率相當高，因此在具有上述抗性的轉(zhuǎn)化細胞中將有很高比率的轉(zhuǎn)化細胞同時含有上述兩類基因。常用選擇標記基因包括抗生素抗性基因及除草劑抗性基因兩大類，如392．轉(zhuǎn)化體的鑒定通過選擇壓篩選得到的再生植株只能初步證明標記基因已經(jīng)整合進入受體細胞，至于目的基因是否整合、表達還一無所知，因此還必須對抗性植株進一步檢測。根據(jù)檢測水平的不同可以分為DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的鑒定。2．轉(zhuǎn)化體的鑒定通過選擇壓篩選得到的再生植株只能初步證明40

(六)轉(zhuǎn)化體的安全性評價和育種利用通過上述鑒定證實攜帶目的基因的轉(zhuǎn)化體，還必須根據(jù)有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理規(guī)定、在可控制的條件下進行安全性評價和大田育種利用研究。從目前的植物基因工程育種實踐來看，利用轉(zhuǎn)基因方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株，常常存在外源基因失活、純合致死、花粉致死效應(yīng)，以及目標性狀明確的基因?qū)胫参锖笥捎诓迦胛稽c的原因可能導(dǎo)致其他性狀的變化等現(xiàn)象；有些轉(zhuǎn)基因植株可能會由于組織培養(yǎng)方面的原因造成結(jié)實率降低。因而，通過轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得理想的品種(系)，一般在獲得轉(zhuǎn)化體后，應(yīng)結(jié)合利用雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。(六)轉(zhuǎn)化體的安全性評價和育種利用41第二節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點

隨著轉(zhuǎn)基因應(yīng)用實踐的增多，越來越多的實驗發(fā)現(xiàn)，外源基因在受體中的命運受到一系列生理生化過程的作用并以復(fù)雜的遺傳方式表現(xiàn)出來。這主要是由于外源基因進入宿主細胞后，將會受到宿主基因組的監(jiān)控，一般要發(fā)生DNA片段丟失、重排、異常重組，加之外源基因在宿主基因組內(nèi)整合的隨機性和多拷貝的影響，使外源基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中的遺傳規(guī)律變得非常復(fù)雜，對其了解還處于初始階段。第二節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點隨著轉(zhuǎn)基因應(yīng)用實踐的增多，越42一、外源基因整合的機制從現(xiàn)有研究結(jié)果來看，外源基因主要是通過同源重組、位點特異性重組、轉(zhuǎn)座作用和異常重組幾種整合方式進入受體基因組。一、外源基因整合的機制43

(一)同源重組整合同源重組是外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生交換替代，并整合到受體染色體組上的一種重組方式。同源重組現(xiàn)象廣泛發(fā)生在生物體內(nèi)，例如真核生物姊妹、非姊妹染色子體之間的交換，細菌以及某些低等真核生物的轉(zhuǎn)化，細菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合，噬菌體的重組等都屬于這種類型?，F(xiàn)有研究表明在轉(zhuǎn)基因過程中，外源基因可以通過同源重組的方式整合到受體染色體組中，實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。(一)同源重組整合同源重組是外源DNA與受體細胞染44

(二)位點特異性重組位點特異性重組發(fā)生在兩條DNA的特異位點上，在位點特異性重組酶的作用下，通過對DNA的特異性切割實現(xiàn)外源基因的整合。(二)位點特異性重組位點特異性重組發(fā)生在兩條DNA45

(三)轉(zhuǎn)座作用所謂轉(zhuǎn)座成分是指在生物基因組內(nèi)存在的能在不同區(qū)域之間發(fā)生轉(zhuǎn)移的控制成分，這些轉(zhuǎn)座成分現(xiàn)在一般稱為轉(zhuǎn)座單元，簡稱轉(zhuǎn)座元、或轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座元的轉(zhuǎn)移過程叫做轉(zhuǎn)座。一般轉(zhuǎn)座過程包括轉(zhuǎn)座成分的復(fù)制和復(fù)制后轉(zhuǎn)座成分的插入。利用生物體自身的這種特點人們先后開發(fā)出多種用于外源基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。利用轉(zhuǎn)座系統(tǒng)進行基因轉(zhuǎn)移的基本原理是通過體外重組將外源基因插入到上述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，在上述攜帶有目的DNA片段的重組轉(zhuǎn)座成分復(fù)制并整合插入到染色體其他區(qū)域時實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。(三)轉(zhuǎn)座作用46

(四)異常重組異常重組整合是外源基因整合到植物基因組的最常見方式。正如異常重組的名稱一樣，目前對這種外源基因的整合機制幾乎是一無所知，一般認為異常重組不需要有DNA的同源序列、RecA蛋白質(zhì)，以及轉(zhuǎn)座酶的參與。但是有研究結(jié)果表明，即使是通過異常重組方式整合到受體染色體的外源基因，也是建立在具有少數(shù)幾個同源性堿基基礎(chǔ)上進行的。由于植物基因工程中所用的外源基因同植物基因組間無同源區(qū)或同源區(qū)段較短，故整合時出現(xiàn)這一方式；即使是一些同源區(qū)段較高的外源基因的整合，也通常以異常重組整合進行。(四)異常重組47二、整合后的外源基因在植株體內(nèi)的表現(xiàn)通過各種途徑整合進入植物基因組的外源基因中只有很少一部分能夠整合到基因組，而能夠穩(wěn)定遺傳的外源基因所占比例更是非常小。例如，利用轉(zhuǎn)化效率較高的農(nóng)桿菌對模式植物擬南芥進行外源基因轉(zhuǎn)移來看，外源基因整合進入基因組的平均比例為30％～80％，而能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株所占百分比例一般不超過10％，這主要是由于在轉(zhuǎn)基因后代中大多數(shù)外源基因都已經(jīng)丟失或者發(fā)生基因沉默所導(dǎo)致的。二、整合后的外源基因在植株體內(nèi)的表現(xiàn)48所謂基因沉默是指整合到基因組中的外源基因不能正常表達，而是處于一種失活狀態(tài)。所謂基因沉默是指整合到基因組中的外源基因不能正常表達，而是處49導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默的原因是十分復(fù)雜的，主要包括：順式失活是因為多拷貝的外源基因連在一起，發(fā)生甲基化作用而失活；反式失活是順式失活的一種復(fù)雜形式，順式失活的轉(zhuǎn)基因作為一個“沉默因子”而影響染色體上等位或非等位的基因甲基化，導(dǎo)致基因失活，而沉默因子本身不發(fā)生變化；共抑制發(fā)生在轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源同源基因之間或者轉(zhuǎn)基因純合體兩個位點之間的相互作用從而導(dǎo)致基因沉默。導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默的原因是十分復(fù)雜的，主要包括：50克服基因沉默的方式有去甲基化、降低拷貝數(shù)、添加增強子以及對外源基因的結(jié)構(gòu)進行改造等方法。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，重復(fù)序列是引起基因沉默的關(guān)鍵，因此如何降低外源基因在植物體內(nèi)整合的拷貝數(shù)是解決基因沉默的有效方式之一。這可以通過兩條途徑進行：一是在轉(zhuǎn)基因植株后代中選擇單拷貝植株；二是選用外源基因整合拷貝數(shù)低的轉(zhuǎn)基因方法。例如采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)移獲得的轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的整合拷貝數(shù)比通過基因槍轟擊方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的整合數(shù)目要低很多?？朔虺聊姆绞接腥ゼ谆?、降低拷貝數(shù)、添加增強子以及對外51三、外源基因在后代中的遺傳規(guī)律大量轉(zhuǎn)基因遺傳研究的結(jié)果表明，2／3以上轉(zhuǎn)化植株的外源基因呈現(xiàn)出單基因顯性的孟德爾式分離，自交后代表現(xiàn)3：1分離，與非轉(zhuǎn)化親本雜交后代表現(xiàn)1：1分離規(guī)律；有少部分表現(xiàn)出作為兩個不連鎖的顯性基因，在自交后代中表現(xiàn)出15：1的分離規(guī)律；或者呈現(xiàn)兩對以上顯性基因的分離規(guī)律。但是顯性個體比例顯著低于孟德爾比例的現(xiàn)象也普遍存在，這大多發(fā)生在早期世代；極少數(shù)轉(zhuǎn)化體還常常發(fā)生復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因分離，例如有的轉(zhuǎn)基因當代自交一代符合3：1的分離規(guī)律，自交二代卻不符合孟德爾規(guī)律。三、外源基因在后代中的遺傳規(guī)律52第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件53可能的原因有：外源基因的重排或者缺失，外源基因?qū)胝T發(fā)的隱性致死突變或轉(zhuǎn)基因純合致死，含轉(zhuǎn)基因的雄配子致死、非轉(zhuǎn)化體在早代逃避選擇等。進一步研究表明，轉(zhuǎn)基因分離方式的多樣性與轉(zhuǎn)基因的整合方式和拷貝數(shù)有關(guān)。多拷貝整合是常見的整合方式，在某些轉(zhuǎn)化事件中，轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)達到幾十個，它們有的串聯(lián)整合，有的獨立整合，有的串聯(lián)與獨立整合共存。這些轉(zhuǎn)基因拷貝在世代傳遞中的不穩(wěn)定性和相互位置的改變以及彼此間直接與(或)間接的互作，增加了外源基因分離與表達的復(fù)雜性?？赡艿脑蛴校和庠椿虻闹嘏呕蛘呷笔В庠椿?qū)胝T發(fā)的隱性54第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物品種的選育通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化植株很少直接作為品種進行推廣應(yīng)用，這是由于各類作物品種都具有一系列主要育種目標性狀，這些性狀又各有其組成因素及生理生化基礎(chǔ)，將外源基因?qū)耸荏w植株只能賦予該株具有特定的目標性狀，對于其他目標性狀是否符合生產(chǎn)的需要還不清楚。第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物品種的選育通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化植株很55雖然可以從受體材料的來源上對所獲得的轉(zhuǎn)基因植株的性狀加以推測，但是由于轉(zhuǎn)基因目標性狀是通過非常規(guī)手段方式獲得的，外源基因的插入很有可能對原有基因組的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，并對宿主基因的表達產(chǎn)生影響，這勢必影響甚至改變該作物品種的原有性狀。此外，轉(zhuǎn)基因植物的安全風險性也是一個值得考慮的問題。因此通過轉(zhuǎn)基因方式獲得的植株還必須通過常規(guī)的品種鑒定途徑才能用于生產(chǎn)。從現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因育種情況來看，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物主要用于為培育新的作物品種而創(chuàng)造育種資源。雖然可以從受體材料的來源上對所獲得的轉(zhuǎn)基因植株的性狀加以推測56如同傳統(tǒng)作物育種一樣，對轉(zhuǎn)基因作物品種進行選育時也要遵循一定的育種程序，同時兼顧轉(zhuǎn)基因育種的特殊性。從現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因育種的過程來看，主要的程序有以下步驟：轉(zhuǎn)基因作物育種目標的制訂；轉(zhuǎn)基因作物育種方法的確定及轉(zhuǎn)基因植物的獲得；轉(zhuǎn)基因作物品種的選育等。如同傳統(tǒng)作物育種一樣，對轉(zhuǎn)基因作物品種進行選育時也要遵循一定57一、轉(zhuǎn)基因作物育種目標的制訂1．依據(jù)市場經(jīng)濟的需要和生產(chǎn)發(fā)展前景2．依據(jù)不同的自然環(huán)境、栽培條件，抓主要矛盾3．落實具體性狀目標4．要考慮品種的搭配5．要充分考慮到轉(zhuǎn)基因作物，尤其是外源目的基因?qū)θ祟惤】岛铜h(huán)境安全的影響一、轉(zhuǎn)基因作物育種目標的制訂58二、轉(zhuǎn)基因方法的確定及轉(zhuǎn)基因植株的獲得由于不同的轉(zhuǎn)基因方法各有其優(yōu)缺點，因此在選擇具體的方法時應(yīng)該充分考慮到上述情況。例如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對于轉(zhuǎn)化雙子葉植物十分有效，因此在創(chuàng)造雙子葉轉(zhuǎn)基因植物時一般優(yōu)先選用此種方法。在前面所述的培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株時，多數(shù)采用的都是農(nóng)桿菌介導(dǎo)方式獲得的。受體品種的選擇在轉(zhuǎn)基因育種中是十分重要的。一般來說，如果轉(zhuǎn)化方法可行，那么，受體品種首選生產(chǎn)上正在大面積推廣或即將在生產(chǎn)上推廣的優(yōu)良品種。用它們轉(zhuǎn)化而成的轉(zhuǎn)基因植株易于快速地培育出新品種在生產(chǎn)上推廣利用。

二、轉(zhuǎn)基因方法的確定及轉(zhuǎn)基因植株的獲得59不管通過什么方法，都要對獲得的轉(zhuǎn)基因植株開展分子與遺傳分析，選擇單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因植株用于新品種的選育。在確定具體的轉(zhuǎn)基因方法和候選目的基因之后，就可以對按照具體的方法實行外源目的基因的轉(zhuǎn)移，在進行嚴格的轉(zhuǎn)基因鑒定之后獲得轉(zhuǎn)基因植株直接作為作物的新品種或者是育種新資源。不管通過什么方法，都要對獲得的轉(zhuǎn)基因植株開展分子與遺傳分析，60

三、轉(zhuǎn)基因作物品種的選育利用遺傳轉(zhuǎn)化途徑培育的轉(zhuǎn)基因植株從育種角度來看只是產(chǎn)生的一種種質(zhì)資源。要想在生產(chǎn)上加以利用，必須通過育種家的加工，培育出成型的品種后，才能推廣。(一)純系育種所謂轉(zhuǎn)基因作物選擇育種是指在現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因群體中，通過個體選擇或混合選擇等方式選優(yōu)去劣，育成新品種的方法。三、轉(zhuǎn)基因作物品種的選育611．出現(xiàn)變異的原因外源基因的導(dǎo)人、整合和表達，整合的目的基因的分離、一因多效、位置效應(yīng)以及克隆的體細胞無性系變異等都會引起變異。此外，還有多種因素可以引起變異。例如：轉(zhuǎn)基因植株在繁殖和種植過程中，由于隔離操作不嚴格而發(fā)生生物學混雜、機械混雜；由于環(huán)境條件的作用，導(dǎo)致的基因突變；或者由于生態(tài)條件差異較大，較易引起的自然突變等。這些性狀各異的轉(zhuǎn)基因植株都是培育新品種的寶貴資源，但是并非所有的個體都能夠符合生產(chǎn)需要的，其中只有極少部分植株能夠直接運用到生產(chǎn)中，因此還必須結(jié)合常規(guī)的育種途徑進行系統(tǒng)選育。1．出現(xiàn)變異的原因外源基因的導(dǎo)人、整合和表達，整合的目的62

2．選擇育種的方法如果轉(zhuǎn)基因植株的株型，農(nóng)藝性狀比較整齊一致，僅有整合的目的基因分離，那么可以采用改良混合選擇育種。如果通過農(nóng)桿菌或花粉管介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因原始品系的農(nóng)藝性狀、目的基因都有分離，那么就應(yīng)該按嚴格的選擇育種進行新品種的選育。對于可以采用無性繁殖的作物來說，通過這種方式獲得轉(zhuǎn)基因新品種更為有利，因為無性繁殖并不需要純合的基因型，但是表現(xiàn)型卻是一致的。在進行轉(zhuǎn)基因作物品種選育時可以對轉(zhuǎn)基因植株自交后代進行單株選育，再通過無性繁殖的方式對符合育種目標的單株進行擴繁，并推廣應(yīng)用到生產(chǎn)上。2．選擇育種的方法如果轉(zhuǎn)基因植株的株型，農(nóng)藝性狀比較整63

(二)回交育種由于基因型限制，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進行遺傳轉(zhuǎn)化所用的受體往往是生產(chǎn)上已經(jīng)淘汰的品種。因此，獲得轉(zhuǎn)基因植株后，還必須通過回交的方法將導(dǎo)人的目的基因轉(zhuǎn)入到生產(chǎn)正在推廣的或即將推廣的品種中?；亟挥N過程中，輪回親本應(yīng)選當前正在推廣的品種，最好選在區(qū)域試驗和生產(chǎn)試驗中表現(xiàn)優(yōu)異，有希望審定、推廣的品種；回交過程中，注意目的基因的選擇，避免丟失。(二)回交育種64

(三)雜交育種通過轉(zhuǎn)基因品種或品系間互交或與常規(guī)品種雜交、選擇，選出轉(zhuǎn)基因新品種的方法。這一育種方法可以在保持抗蟲性的基礎(chǔ)上，將兩個或更多個親本品種的理想基因結(jié)合于同一個雜種個體中，以便培育出具有多個親本的綜合優(yōu)良性狀的新品種。雜種后代一般采用系譜法選擇。由于基因分離，雜交育種一般需要時間較長。在雜交育種的早世代，在抗蟲性選擇的基礎(chǔ)上，對纖維品質(zhì)和農(nóng)藝性狀也同時進行選擇，尤其是加強衣分的選擇。(三)雜交育種65

(四)雜種品種轉(zhuǎn)基因雜交作物品種的培育與制種與常規(guī)雜種品種的培育和制種方法基本相同，不同的是所選用的親本中至少有一個是轉(zhuǎn)基因作物品種或品系。具體的雜交組合有以下幾種：親本之一為轉(zhuǎn)基因作物品種，另一親本為常規(guī)非轉(zhuǎn)基因品種(系)配制而成的雜交種；以不育系為母本，具有目標性狀的轉(zhuǎn)基因植株為父本配制雜交組合；父母本均為轉(zhuǎn)基因植物配制的雜交組合等。具體采用哪種方式要根據(jù)配制成的雜交種的產(chǎn)量和品質(zhì)優(yōu)勢表現(xiàn)情況確定，但是最好雙親均為含有目標性狀的轉(zhuǎn)基因材料，這樣在利用雜交二代時目標性狀不會出現(xiàn)分離。但是由于轉(zhuǎn)基因作物品種出現(xiàn)的時間較短，還沒有太多的材料可供利用。(四)雜種品種66第四節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品存在一定的風險，如轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品本身對人類的毒害作用，轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境的破壞性作用，包括轉(zhuǎn)入的外源基因在環(huán)境中的擴散、對物種多樣性的影響等，因此必須從保障人類健康、發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和維護生態(tài)平衡與社會安全的基礎(chǔ)出發(fā)，提出一系列具有指導(dǎo)意義的對應(yīng)策略和行之有效的具體措施。

第四節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品存在一定的風險671．加強轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性研究在研究與開發(fā)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的同時，必須加強其安全性防范的長期跟蹤研究。2．建立完善的檢測體系與質(zhì)量審批制度為確保轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進、出口的安全性，必須建立起一整套完善的、既符合國際標準又與我國國情相適應(yīng)的檢測體系，以及嚴格的質(zhì)量標準審批制度。有關(guān)審批機構(gòu)應(yīng)該相對獨立于研制與開發(fā)商之外，而且也不應(yīng)該受到過多的行政干預(yù)。1．加強轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性研究在研究與開發(fā)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的同68

3．不斷完善相關(guān)法規(guī)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性法規(guī)的建立與執(zhí)行應(yīng)該以嚴格的檢測手段為基準。同時應(yīng)培養(yǎng)一批既懂得生物技術(shù)專業(yè)知識，又能駕馭法律的專門人才。4．加強宏觀調(diào)控有關(guān)決策層應(yīng)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化及市場化速度進行有序的宏觀調(diào)控。任何轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性的防范措施都必須建立在對該項技術(shù)的發(fā)展進行適當調(diào)控的前提下，否則，在商業(yè)利益的驅(qū)動下只能是防不勝防。5．加強對公眾的宣傳和教育通過多渠道、多層次的科普宣傳教育，培養(yǎng)公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其安全性問題的客觀公正意識，從而培育對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品具有一定了解、認識和判斷能力的消費者群體。這對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品能否獲得市場的有力支撐是至關(guān)重要的。3．不斷完善相關(guān)法規(guī)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性法規(guī)的建立與執(zhí)行應(yīng)69

6．為公眾提供良好的咨詢服務(wù)應(yīng)該設(shè)立足夠數(shù)量的具有高度權(quán)威性的相關(guān)咨詢機構(gòu)，從而為那些因缺乏專業(yè)知識而難以對某些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品做出選擇的消費者提供有效的指導(dǎo)性幫助。7．規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品市場必須培育健康、規(guī)范的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品市場。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性決定其在市場中的發(fā)展?jié)摿?。因此，有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品質(zhì)量及其安全性的廣告宣傳，應(yīng)該具有科學性和真實性。一旦消費者因廣告宣傳而受誤導(dǎo)或因假冒產(chǎn)品而被欺騙，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品就會因消費者的望而生畏而失去市場。6．為公眾提供良好的咨詢服務(wù)應(yīng)該設(shè)立足夠數(shù)量的具有高度70第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種

轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標，從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運載進入受體作物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達的遺傳工程體，并經(jīng)過田間試驗與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標71它涉及目的基因的分離與改造、載體的構(gòu)建及其與目的基因的連接等DNA重組技術(shù)；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍轟擊等方法使重組體進入受體細胞或組織以及轉(zhuǎn)化體的篩選、鑒定等遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和相配套的組織培養(yǎng)技術(shù)；獲得攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因植株(遺傳工程體)；遺傳工程體在有控條件下的安全性評價以及大田育種研究直至育成品種。它涉及目的基因的分離與改造、載體的構(gòu)建及其與目的基因的連接等72與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢。主要體現(xiàn)在：(1)轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)體系的建立使可利用的基因資源大大拓寬。實踐表明，從動物、植物、微生物中分離克隆的基因，通過轉(zhuǎn)基因的方法可使其在三者之間相互轉(zhuǎn)移利用。(2)轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗，適應(yīng)各種不良環(huán)境條件的優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑。這既可大大減少殺蟲劑、殺菌劑的使用，有利于環(huán)境保護，也可以提高作物的生產(chǎn)能力、擴大作物品種的適應(yīng)性和種植區(qū)域。

與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，73(3)利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)可以對植物的目標性狀進行定向變異和定向選擇，同時隨著對基因認識的不斷深入和轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段的完善，對多個基因進行定向操作也將成為可能，這在常規(guī)育種中是難以想象的。(4)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以大大提高選擇效率，加快育種進程。此外，通過轉(zhuǎn)基因的方法，還可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等生物制品。正是由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種具有上述強大的優(yōu)勢，使得轉(zhuǎn)基因技術(shù)從發(fā)現(xiàn)到如今僅僅30年的歷史就得到了快速的發(fā)展。(3)利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)可以對植物的目標性狀進行定向變異和定74第一節(jié)

作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀(一)國際轉(zhuǎn)基因植物研究與現(xiàn)狀自從20世紀70年代重組DNA技術(shù)創(chuàng)建到1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，至今已有35個科120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。先后有30多個國家批準了3000多例田間試驗，涉及的植物種類有40多種，2000年已有13個國家種植了商品化的轉(zhuǎn)基因植物。2019—2019年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積增加很快(圖16—1)。到2019年全世界已種植轉(zhuǎn)基因作物5260萬hm2。第一節(jié)

作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀75第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件76目前所種植的轉(zhuǎn)基因作物主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，其中以轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積最大。轉(zhuǎn)基因作物的主要目標集中在培育具有抗除草劑特性的農(nóng)作物優(yōu)良品種,其次為培育抗蟲和毒病新品種上。

目前所種植的轉(zhuǎn)基因作物主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，其中以77(二)我國轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況我國是世界上第一個商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國家。自行培育的雙價轉(zhuǎn)基因煙草的抗病蟲性達到60％，產(chǎn)量比對照增加15％，產(chǎn)值增加20％，1992年每畝增產(chǎn)200元，遺憾的是由于市場的原因現(xiàn)已不推廣。(二)我國轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況78據(jù)農(nóng)業(yè)部資料，到2019年我國已批準進行中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項，包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物；主要目標性狀是抗蟲、抗病、耐鹽、抗凍、耐儲藏和抗衰老等。已批準環(huán)境釋放的有49項，包括水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹、煙草等10種。據(jù)農(nóng)業(yè)部資料，到2019年我國已批準進行中試的轉(zhuǎn)基因作物有479目前經(jīng)農(nóng)業(yè)部審查并經(jīng)全國基因工程安全委員會批準商品化生產(chǎn)的作物已有我國自行研制開發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花、美國Monsanto公司開發(fā)的Bt抗蟲棉、延遲成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄、抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因番茄、抗CMV轉(zhuǎn)基因甜椒及轉(zhuǎn)查爾酮合酶(CHS)反義RNA基因矮牽牛。但是除了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉已經(jīng)大面積生產(chǎn)外，后幾種作物的種植面積僅在1hm2左右。目前經(jīng)農(nóng)業(yè)部審查并經(jīng)全國基因工程安全委員會批準商品化生產(chǎn)的作80第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件81第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件82

二、轉(zhuǎn)基因育種的程序利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行作物育種的基本過程可分為：目的基因或DNA的獲得；含有目的基因或者DNA的重組質(zhì)粒的構(gòu)建；受體材料的選擇和再生系統(tǒng)的建立；轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定；轉(zhuǎn)基因植株的育種利用。二、轉(zhuǎn)基因育種的程序83

(一)目的基因的獲得目的基因的獲得是利用作物轉(zhuǎn)基因育種的第一步。根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：根據(jù)基因表達的產(chǎn)物——蛋白進行基因克??；從基因組DNA或mRNA序列克隆基因。(一)目的基因的獲得84

(二)目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過上述方法克隆得到目的基因只是為利用外源基因提供了基礎(chǔ)，要將外源基因轉(zhuǎn)移到受體植株還必須對目的基因進行體外重組。質(zhì)粒重組的基本步驟包括：從原核生物中獲取目的基因的載體并進行改造；利用限制性內(nèi)切酶將載體切開，并用連接酶把目的基因連接到載體上，獲得DNA重組體。(二)目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建85已經(jīng)分離的目的基因一般都保存在大腸桿菌內(nèi)的一類輔助質(zhì)粒中，常用的有pBR322系列、pUC以及pBluescriptK+(—)系列等。在進行外源基因轉(zhuǎn)移前還必須將外源基因重組到合適的載體上，具體采用哪種載體要根據(jù)轉(zhuǎn)基因的方法和目的而定。Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的結(jié)構(gòu)見圖16—6、16—7。已經(jīng)分離的目的基因一般都保存在大腸桿菌內(nèi)的一類輔助質(zhì)粒中，常86第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件87第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件88(三)受體材料的選擇受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。能否建立穩(wěn)定、高效、易于再生的受體系統(tǒng)是植物轉(zhuǎn)基因操作的關(guān)鍵技術(shù)之一。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：①高效穩(wěn)定的再生能力；②受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；③具有穩(wěn)定的外植體來源，即用于轉(zhuǎn)化的受體要易于得到而且可以大量供應(yīng)，如胚和其他器官等；④對篩選劑敏感，即當轉(zhuǎn)化體篩選培養(yǎng)基中篩選劑濃度達到一定值時，能夠抑制非轉(zhuǎn)化植株細胞的生長、發(fā)育和分化，而轉(zhuǎn)化細胞、植株能正常生長、發(fā)育和分化形成完整的植株。(三)受體材料的選擇89雖然對植物組織培養(yǎng)的研究已有幾十年的歷史，對于許多重要的農(nóng)作物已經(jīng)建立起比較成熟的再生系統(tǒng)，但是建立一個良好的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)與現(xiàn)有的組織培養(yǎng)獲得再生植株水平之間還有很大的差距。目前受體材料系統(tǒng)存在的主要問題是：再生率低，基因型依賴性強，再生細胞部位與轉(zhuǎn)化部位不一致等，常用的受體材料有以下幾大類型。雖然對植物組織培養(yǎng)的研究已有幾十年的歷史，對于許多重要的農(nóng)作90

1．愈傷組織再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)是指外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，再通過分化培養(yǎng)獲得再生植株的再生系統(tǒng)。愈傷組織受體再生系統(tǒng)具有外植體材料來源廣泛，繁殖迅速，易于接受外源基因，并且轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點；缺點是轉(zhuǎn)化的外源基因遺傳穩(wěn)定性差，容易出現(xiàn)嵌合體。1．愈傷組織再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)是指外植體材料經(jīng)過912．直接分化再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)是指外植體材料細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。此類再生系統(tǒng)的優(yōu)點是獲得再生系統(tǒng)的周期短、操作簡單，體細胞變異小，并且能夠保持受體材料的遺傳穩(wěn)定性；缺點是對于有些植物，尤其是包括玉米、小麥、水稻在內(nèi)的多數(shù)禾本科作物進行莖尖分生培養(yǎng)相當困難，遺傳轉(zhuǎn)化率要比愈傷組織再生系統(tǒng)低。2．直接分化再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)是指外植體材料細胞不923．原生質(zhì)體再生系統(tǒng)由于原生質(zhì)體具有全能性，能夠在適當培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出再生植株，也可以作為受體材料，事實上原生質(zhì)體受體系統(tǒng)是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。原生質(zhì)體受體再生系統(tǒng)的優(yōu)點是能夠直接高效、廣泛地攝取外源DNA或遺傳物質(zhì)，可以獲得基因型一致的克隆細胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，并適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點是不易制備、再生困難和變異程度高等。3．原生質(zhì)體再生系統(tǒng)由于原生質(zhì)體具有全能性，能夠在適當培93

4．胚狀體再生系統(tǒng)胚狀體是指具有胚胎性質(zhì)的個體。胚狀體作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體具有個體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因的能力強，轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生等優(yōu)點。不足之處是所需技術(shù)含量較高，多數(shù)禾本科作物在內(nèi)的許多種植物上不易獲得胚狀體，使胚狀體再生受體系統(tǒng)的應(yīng)用受到了很大的限制。4．胚狀體再生系統(tǒng)胚狀體是指具有胚胎性質(zhì)的個體。胚狀體94

5．生殖細胞受體系統(tǒng)利用植物自身的生殖過程，以生殖細胞如花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)被稱為生殖細胞受體系統(tǒng)。目前主要從兩個途徑利用生殖細胞進行基因轉(zhuǎn)化：一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)人法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。由于該受體系統(tǒng)與上述其他受體系統(tǒng)相比有許多優(yōu)點，因此近年來發(fā)展很快。5．生殖細胞受體系統(tǒng)利用植物自身的生殖過程，以生殖細胞95

(四)轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化選擇適宜的遺傳轉(zhuǎn)化方法是提高遺傳轉(zhuǎn)化率的重要環(huán)節(jié)之一。盡管轉(zhuǎn)基因的具體方法很多，但是概括起來說主要有兩類。第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。(四)轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化961．載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)載體法是目前為止最常見的一類轉(zhuǎn)基因方法。其基本原理是將外源基因重組進入適合的載體系統(tǒng)，通過載體攜帶將外源基因?qū)酥参锛毎⒄显诤巳旧w組中，并隨著核染色體一起復(fù)制和表達。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。采用載體介導(dǎo)進行基因轉(zhuǎn)移的具體方法包括：1．載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)載體法是目前為止最常見的一類轉(zhuǎn)基因方97

(1)葉盤法。葉盤法是雙子葉植物較為常用、簡單有效的方法。選取健康的無菌苗，用打孔器打出葉圓盤，將帶有新鮮傷口的葉圓盤與載有目的基因的農(nóng)桿菌液進行短期共培養(yǎng)，農(nóng)桿菌通過傷口感染將外源目的基因?qū)思毎麅?nèi)并整合到植物基因組中。

(1)葉盤法。葉盤法是雙子葉植物較為常用、簡單有效的方法。98

(2)真空滲入法。將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。這是一種簡便、快速、可靠而且不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉(zhuǎn)化植株的基因轉(zhuǎn)移方法，具有良好的研究與應(yīng)用前景。(2)真空滲入法。將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源99(3)原生質(zhì)體共培養(yǎng)法。原生質(zhì)體法是指在原生質(zhì)培養(yǎng)的早期，將攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體共同培養(yǎng)，農(nóng)桿菌的Ti或Ri上攜帶有目的基因的T—DNA區(qū)段就會隨著外源信號分子的誘導(dǎo)而導(dǎo)入原生質(zhì)體的核內(nèi)，并整合到受體基因組上。(3)原生質(zhì)體共培養(yǎng)法。原生質(zhì)體法是指在原生質(zhì)培養(yǎng)的早期，將100

2．外源基因直接導(dǎo)入法外源基因直接導(dǎo)人技術(shù)是一種不需借助載體介導(dǎo)，直接利用理化因素進行外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法，主要包括化學刺激法、基因槍轟擊法等。2．外源基因直接導(dǎo)入法外源基因直接導(dǎo)人技術(shù)是一種不需借101

(1)化學刺激法?；瘜W刺激法是借助于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或者多聚—L—鳥苷酸(PLO)等細胞融合劑的作用，使細胞膜表面電荷發(fā)生紊亂，干擾細胞間的識別，使細胞膜之間、DNA／RNA與細胞膜之間形成分子橋，促使細胞膜間的相互融合(接觸和粘連)和外源DNA／RNA進入原生質(zhì)體。(1)化學刺激法?；瘜W刺激法是借助于聚乙二醇(PEG)、聚102

(2)基因槍轟擊法?；驑屴Z擊法也稱為微彈轟擊技術(shù)和粒子槍法，其基本原理是將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，然后借助高壓動力射人受體細胞或組織，當微粒上的DNA進入細胞后將整合到植物基因組中并得以表達。按照動力來源可將基因槍分為火藥動力基因槍、高壓氣體動力基因槍和高壓放電動力基因槍。(2)基因槍轟擊法?；驑屴Z擊法也稱為微彈轟擊技術(shù)和粒子槍103由于基因槍法的操作對象可以是完整的細胞或組織，這就克服了受體材料的限制，而且不必制備原生質(zhì)體，因此實驗步驟簡單易行，具有相當廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為研究植物細胞轉(zhuǎn)化和創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因植物的最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。由于基因槍法的操作對象可以是完整的細胞或組織，這就克服了受體104(3)高壓電穿孔法。又稱為電擊法，是利用高壓電流脈沖在細胞質(zhì)膜上形成瞬間微孔，使DNA直接通過微孔或者作為微孔閉合時伴隨發(fā)生的膜組分重新分布進入細胞質(zhì)并整合到宿主細胞中。與原生質(zhì)體融合和磷酸鈣沉淀法相比，通過高壓電穿孔法獲得的轉(zhuǎn)化植株外源DNA整合拷貝數(shù)較低，對受體細胞的選擇性不強，但是要獲得對特定的宿主細胞的最佳轉(zhuǎn)化條件(如電場強度、電擊時間等)需要大量的前期工作。(3)高壓電穿孔法。又稱為電擊法，是利用高壓電流脈沖在細胞質(zhì)105(4)微注射法。此法是利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細胞固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進入受體細胞。所用受體一般是原生質(zhì)體或生殖細胞，對于具有較大子房或胚囊的植株則無須進行細胞固定，在田間就可以進行活體操作，被稱為“子房注射法”或“花粉管通道法”。微注射法的優(yōu)點是可以進行活體操作，不影響植物體正常的發(fā)育進程。田間子房注射操作簡便、成本低。但只對子房比較大的植物有效，對于種子很小的植物操作要求精度高，需要顯微操作，轉(zhuǎn)化率也相對較低，而且轉(zhuǎn)基因后代容易出現(xiàn)嵌合體。(4)微注射法。此法是利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸106(5)其他直接轉(zhuǎn)化方法。隨著科技的不斷前進，人們先后又發(fā)明了多種直接轉(zhuǎn)化方法，如超聲波介導(dǎo)法、脈沖電泳法和離子束介導(dǎo)等方法，但是由于上述方法技術(shù)還不成熟、轉(zhuǎn)化率低，有的原理不清楚或者是所需設(shè)備太昂貴，因此在實際中的應(yīng)用受到了限制。(5)其他直接轉(zhuǎn)化方法。隨著科技的不斷前進，人們先后又發(fā)明了107

(五)轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1．轉(zhuǎn)化體的篩選外源目的基因在植物受體細胞中的轉(zhuǎn)化頻率往往是相當?shù)偷?，在?shù)量龐大的受體細胞群體中，通常只有為數(shù)不多的一小部分獲得了外源DNA，而其中目的基因已被整合到核基因組并實現(xiàn)表達的轉(zhuǎn)化細胞則更加稀少。為了有效地選擇出這些真正的轉(zhuǎn)化細胞，必要使用特異性的選擇標記基因進行標記。(五)轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定108常用選擇標記基因包括抗生素抗性基因及除草劑抗性基因兩大類，如卡那霉素抗性基因NPTⅡ和潮霉素抗性基因hpt，除草劑抗性基因bar基因和Glyphosate抗性基因epsps等。在實際工作中，是將選擇標記基因與適當啟動子構(gòu)成嵌合基因并克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時進行轉(zhuǎn)化。當標記基因被導(dǎo)入受體細胞之后，就會使轉(zhuǎn)化細胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力，抑制、殺死非轉(zhuǎn)化細胞，轉(zhuǎn)化細胞則能夠存活下來。由于目的基因和標記基因同時整合進入受體細胞的比率相當高，因此在具有上述抗性的轉(zhuǎn)化細胞中將有很高比率的轉(zhuǎn)化細胞同時含有上述兩類基因。常用選擇標記基因包括抗生素抗性基因及除草劑抗性基因兩大類，如1092．轉(zhuǎn)化體的鑒定通過選擇壓篩選得到的再生植株只能初步證明標記基因已經(jīng)整合進入受體細胞，至于目的基因是否整合、表達還一無所知，因此還必須對抗性植株進一步檢測。根據(jù)檢測水平的不同可以分為DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的鑒定。2．轉(zhuǎn)化體的鑒定通過選擇壓篩選得到的再生植株只能初步證明110

(六)轉(zhuǎn)化體的安全性評價和育種利用通過上述鑒定證實攜帶目的基因的轉(zhuǎn)化體，還必須根據(jù)有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理規(guī)定、在可控制的條件下進行安全性評價和大田育種利用研究。從目前的植物基因工程育種實踐來看，利用轉(zhuǎn)基因方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株，常常存在外源基因失活、純合致死、花粉致死效應(yīng)，以及目標性狀明確的基因?qū)胫参锖笥捎诓迦胛稽c的原因可能導(dǎo)致其他性狀的變化等現(xiàn)象；有些轉(zhuǎn)基因植株可能會由于組織培養(yǎng)方面的原因造成結(jié)實率降低。因而，通過轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得理想的品種(系)，一般在獲得轉(zhuǎn)化體后，應(yīng)結(jié)合利用雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。(六)轉(zhuǎn)化體的安全性評價和育種利用111第二節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點

隨著轉(zhuǎn)基因應(yīng)用實踐的增多，越來越多的實驗發(fā)現(xiàn)，外源基因在受體中的命運受到一系列生理生化過程的作用并以復(fù)雜的遺傳方式表現(xiàn)出來。這主要是由于外源基因進入宿主細胞后，將會受到宿主基因組的監(jiān)控，一般要發(fā)生DNA片段丟失、重排、異常重組，加之外源基因在宿主基因組內(nèi)整合的隨機性和多拷貝的影響，使外源基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中的遺傳規(guī)律變得非常復(fù)雜，對其了解還處于初始階段。第二節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點隨著轉(zhuǎn)基因應(yīng)用實踐的增多，越112一、外源基因整合的機制從現(xiàn)有研究結(jié)果來看，外源基因主要是通過同源重組、位點特異性重組、轉(zhuǎn)座作用和異常重組幾種整合方式進入受體基因組。一、外源基因整合的機制113

(一)同源重組整合同源重組是外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生交換替代，并整合到受體染色體組上的一種重組方式。同源重組現(xiàn)象廣泛發(fā)生在生物體內(nèi)，例如真核生物姊妹、非姊妹染色子體之間的交換，細菌以及某些低等真核生物的轉(zhuǎn)化，細菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合，噬菌體的重組等都屬于這種類型?，F(xiàn)有研究表明在轉(zhuǎn)基因過程中，外源基因可以通過同源重組的方式整合到受體染色體組中，實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。(一)同源重組整合同源重組是外源DNA與受體細胞染114

(二)位點特異性重組位點特異性重組發(fā)生在兩條DNA的特異位點上，在位點特異性重組酶的作用下，通過對DNA的特異性切割實現(xiàn)外源基因的整合。(二)位點特異性重組位點特異性重組發(fā)生在兩條DNA115

(三)轉(zhuǎn)座作用所謂轉(zhuǎn)座成分是指在生物基因組內(nèi)存在的能在不同區(qū)域之間發(fā)生轉(zhuǎn)移的控制成分，這些轉(zhuǎn)座成分現(xiàn)在一般稱為轉(zhuǎn)座單元，簡稱轉(zhuǎn)座元、或轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座元的轉(zhuǎn)移過程叫做轉(zhuǎn)座。一般轉(zhuǎn)座過程包括轉(zhuǎn)座成分的復(fù)制和復(fù)制后轉(zhuǎn)座成分的插入。利用生物體自身的這種特點人們先后開發(fā)出多種用于外源基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。利用轉(zhuǎn)座系統(tǒng)進行基因轉(zhuǎn)移的基本原理是通過體外重組將外源基因插入到上述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，在上述攜帶有目的DNA片段的重組轉(zhuǎn)座成分復(fù)制并整合插入到染色體其他區(qū)域時實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。(三)轉(zhuǎn)座作用116

(四)異常重組異常重組整合是外源基因整合到植物基因組的最常見方式。正如異常重組的名稱一樣，目前對這種外源基因的整合機制幾乎是一無所知，一般認為異常重組不需要有DNA的同源序列、RecA蛋白質(zhì)，以及轉(zhuǎn)座酶的參與。但是有研究結(jié)果表明，即使是通過異常重組方式整合到受體染色體的外源基因，也是建立在具有少數(shù)幾個同源性堿基基礎(chǔ)上進行的。由于植物基因工程中所用的外源基因同植物基因組間無同源區(qū)或同源區(qū)段較短，故整合時出現(xiàn)這一方式；即使是一些同源區(qū)段較高的外源基因的整合，也通常以異常重組整合進行。(四)異常重組117二、整合后的外源基因在植株體內(nèi)的表現(xiàn)通過各種途徑整合進入植物基因組的外源基因中只有很少一部分能夠整合到基因組，而能夠穩(wěn)定遺傳的外源基因所占比例更是非常小。例如，利用轉(zhuǎn)化效率較高的農(nóng)桿菌對模式植物擬南芥進行外源基因轉(zhuǎn)移來看，外源基因整合進入基因組的平均比例為30％～80％，而能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株所占百分比例一般不超過10％，這主要是由于在轉(zhuǎn)基因后代中大多數(shù)外源基因都已經(jīng)丟失或者發(fā)生基因沉默所導(dǎo)致的。二、整合后的外源基因在植株體內(nèi)的表現(xiàn)118所謂基因沉默是指整合到基因組中的外源基因不能正常表達，而是處于一種失活狀態(tài)。所謂基因沉默是指整合到基因組中的外源基因不能正常表達，而是處119導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默的原因是十分復(fù)雜的，主要包括：順式失活是因為多拷貝的外源基因連在一起，發(fā)生甲基化作用而失活；反式失活是順式失活的一種復(fù)雜形式，順式失活的轉(zhuǎn)基因作為一個“沉默因子”而影響染色體上等位或非等位的基因甲基化，導(dǎo)致基因失活，而沉默因子本身不發(fā)生變化；共抑制發(fā)生在轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源同源基因之間或者轉(zhuǎn)基因純合體兩個位點之間的相互作用從而導(dǎo)致基因沉默。導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默的原因是十分復(fù)雜的，主要包括：120克服基因沉默的方式有去甲基化、降低拷貝數(shù)、添加增強子以及對外源基因的結(jié)構(gòu)進行改造等方法?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，重復(fù)序列是引起基因沉默的關(guān)鍵，因此如何降低外源基因在植物體內(nèi)整合的拷貝數(shù)是解決基因沉默的有效方式之一。這可以通過兩條途徑進行：一是在轉(zhuǎn)基因植株后代中選擇單拷貝植株；二是選用外源基因整合拷貝數(shù)低的轉(zhuǎn)基因方法。例如采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)移獲得的轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的整合拷貝數(shù)比通過基因槍轟擊方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的整合數(shù)目要低很多?？朔虺聊姆绞接腥ゼ谆?、降低拷貝數(shù)、添加增強子以及對外121三、外源基因在后代中的遺傳規(guī)律大量轉(zhuǎn)基因遺傳研究的結(jié)果表明，2／3以上轉(zhuǎn)化植株的外源基因呈現(xiàn)出單基因顯性的孟德爾式分離，自交后代表現(xiàn)3：1分離，與非轉(zhuǎn)化親本雜交后代表現(xiàn)1：1分離規(guī)律；有少部分表現(xiàn)出作為兩個不連鎖的顯性基因，在自交后代中表現(xiàn)出15：1的分離規(guī)律；或者呈現(xiàn)兩對以上顯性基因的分離規(guī)律。但是顯性個體比例顯著低于孟德爾比例的現(xiàn)象也普遍存在，這大多發(fā)生在早期世代；極少數(shù)轉(zhuǎn)化體還常常發(fā)生復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因分離，例如有的轉(zhuǎn)基因當代自交一代符合3：1的分離規(guī)律，自交二代卻不符合孟德爾規(guī)律。三、外源基因在后代中的遺傳規(guī)律122第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種3-課件123可能的原因有：外源基因的重排或者缺失，外源基因?qū)胝T發(fā)的隱性致死突變或轉(zhuǎn)基因純合致死，含轉(zhuǎn)基因的雄配子致死、非轉(zhuǎn)化體在早代逃避選擇等。進一步研究表明，轉(zhuǎn)基因分離方式的多樣性與轉(zhuǎn)基因的整合方式和拷貝數(shù)有關(guān)。多拷貝整合是常見的整合方式，在某些轉(zhuǎn)化事件中，轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)達到幾十個，它們有的串聯(lián)整合，有的獨立整合，有的串聯(lián)與獨立整合共存。這些轉(zhuǎn)基因拷貝在世代傳遞中的不穩(wěn)定性和相互位置的改變以及彼此間直接與(或)間接的互作，增加了外源基因分離與表達的復(fù)雜性?？赡艿脑蛴校和庠椿虻闹嘏呕蛘呷笔?，外源基因?qū)胝T發(fā)的隱性124第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物品種的選育通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化植株很少直接作為品種進行推廣應(yīng)用，這是由于各類作物品種都具有一系列主要育種目標性狀，這些性狀又各有其組成因素及生理生化基礎(chǔ)，將外源基因?qū)耸荏w植株只能賦予該株具有特定的目標性狀，對于其他目標性狀是否符合生產(chǎn)的需要還不清楚。第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物品種的選育通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化植株很125雖然可以從受體材料的來源上對所獲得的轉(zhuǎn)基因植株的性狀加以推測，但是由于轉(zhuǎn)基因目標性狀是通過非常規(guī)手段方式獲得的，外源基因的插入很有可能對原有基因組的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，并對宿主基因的表達產(chǎn)生影響，這勢必影響甚至改變該作物品種的原有性狀。此外，轉(zhuǎn)基因植物的安全風險性也是一個值得考慮的問題。因此通過轉(zhuǎn)基因方式獲得的植株還必須通過常規(guī)的品種鑒定途徑才能用于生產(chǎn)。從現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因育種情況來看，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物主要用于為培育新的作物品種而創(chuàng)造育種資源。雖然可以從受體材料的來源上對所獲得的轉(zhuǎn)基因植株的性狀加以推測126如同傳統(tǒng)作物育種一樣，對轉(zhuǎn)基因作物品種進行選育時也要遵循一定的育種程序，同時兼顧轉(zhuǎn)基因育種的特殊性。從現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因育種的過程來看，主要的程序有以下步驟：轉(zhuǎn)基因作物育種目標的制訂；轉(zhuǎn)基因作物育種方法的確定及轉(zhuǎn)基因植物的獲得；轉(zhuǎn)基因作物品種的選育等。如同傳統(tǒng)作物育種一樣，對轉(zhuǎn)基因作物品種進行選育時也要遵循一定127一、轉(zhuǎn)基因作物育種目標的制訂1．依據(jù)市場經(jīng)濟的需要和生產(chǎn)發(fā)展前景2．依據(jù)不同的自然環(huán)境、栽培條件，抓主要矛盾3．落實具體性狀目標4．要考慮品種的搭配5．要充分考慮到轉(zhuǎn)基因作物，尤其是外源目的基因?qū)θ祟惤】岛铜h(huán)境安全的影響一、轉(zhuǎn)基因作物育種目標的制訂128二、轉(zhuǎn)基因方法的確定及轉(zhuǎn)基因植株的獲得由于不同的轉(zhuǎn)基因方法各有其優(yōu)缺點，因此在選擇具體的方法時應(yīng)該充分考慮到上述情況。例如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對于轉(zhuǎn)化雙子葉植物十分有效，因此在創(chuàng)造雙子葉轉(zhuǎn)基因植物時一般優(yōu)先選用此種方法。在前面所述的培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株時，多數(shù)采用的都是農(nóng)桿菌介導(dǎo)方式獲得的。受體品種的選擇在轉(zhuǎn)基因育種中是十分重要的。一般來說，如果轉(zhuǎn)化方法可行，那么，受體品種首選生產(chǎn)上正在大面積推廣或即將在生產(chǎn)上推廣的優(yōu)良品種。用它們轉(zhuǎn)化而成的轉(zhuǎn)基因植株易于快速地培育出新品種在生產(chǎn)上推廣利用。

二、轉(zhuǎn)基因方法的確定及轉(zhuǎn)基因植株的獲得129不管通過什么方法，都