【案例揭秘】通過色譜和紫外方法,使用體內(nèi)數(shù)據(jù)建立并驗證一種有區(qū)分力的阿托伐他汀鈣片的溶出方法

【案例揭秘】通過色譜和紫外方法，使用體內(nèi)數(shù)據(jù)建立并驗證一種有區(qū)分力的阿托伐他汀鈣片的溶生方法【案例揭秘】動態(tài)溶生測試法為難溶性藥物孟魯司特鈉魯司特鈉建立體內(nèi)外相關(guān)性通過上述原版文獻資料的翻譯，各位同行對一些產(chǎn)品的體內(nèi)外相關(guān)性有了一定的了解，今天給大家展示最新的本群同行的翻譯作品。歡迎各位同行一起來探討。原文由處見下面截圖第八季上海API群友會報名免費參加（點擊可跳轉(zhuǎn)）：第八季醫(yī)藥信息群友會第二輪通知（掃描二維碼報名）摘要：本文開發(fā)并驗證了一種通過參比制和中試批受試制劑（PB）的體內(nèi)數(shù)據(jù)，分析阿托伐他汀鈣片溶生度的方法。在不同的溶劑和漏槽條件中進行實驗后，確定了合適的溶解度實驗條件，該條件為：漿法，50rmp,900ml的pH6.0的磷酸鉀緩沖液。參比制劑和受試制劑（PB）的體內(nèi)溶由度數(shù)據(jù)通過生物等效性試驗獲得，吸收的劑量通過Loo-Riegelman法計算＜為了獲得A級的體內(nèi)體外相關(guān)水平，需要在吸收和溶解的數(shù)據(jù)之間加入一個6.0的時間校正因子。根據(jù)美國藥典的相關(guān)規(guī)定，使用高效液相色譜法和紫外分光光度法對測量藥物溶由度的溶生方法進行了驗證。通過檢測不同中試批（PA和PB）和參比制劑的數(shù)據(jù)，評估了方法靈敏度。本文介紹的溶由度測試方法經(jīng)過了驗證，可以在質(zhì)量控制和新處方開發(fā)中作為一種有區(qū)分力的方法使用。簡介藥物體外溶由行為和體內(nèi)藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)之間的聯(lián)系，是生物藥劑學(xué)研究中的一項主要挑戰(zhàn)。體內(nèi)體外相關(guān)性（IVIVC）被定義為藥品的生物學(xué)特性、或由生物學(xué)特性衍生生的參數(shù)，與同一劑型藥品的理化特性之間的關(guān)系。這個概念允許使用IVIVC作為人體藥代動力學(xué)研究的替代指標(biāo)，在首次申報、生產(chǎn)規(guī)模改變以及上市后其他變更中減少生物等效性評估的樣本量。服用莫一劑型的藥品后，最常使用血藥濃度的曲線下面積（AUC）和最大血藥濃度（Cmax）等藥代動力學(xué)參數(shù)描述藥品生物學(xué)特性。最常使用的描述藥品理化特征的方法是體外的溶生行為。為了獲得IVIVC,生物學(xué)特性和理化特性間的關(guān)系常使用數(shù)學(xué)方式表達。應(yīng)當(dāng)使用有足夠靈敏度的方法測量固體制劑的體外溶由度，能夠區(qū)分由于處方比例和生產(chǎn)過程的顯著變化帶來的溶生行為差異。在制藥工業(yè)中，溶生度實驗是用以指導(dǎo)新處方開發(fā)、評估批間質(zhì)量差異的一個非常重要的工具。在生物系統(tǒng)內(nèi)，藥物在液體溶媒中的溶生，是系統(tǒng)吸收的重要先決條件。如果一個藥物有較低的溶生度，它在胃腸道中完全或部分溶生的速率，往往控制著藥品吸收的速度。IVIVC在藥物研發(fā)過程中可以用于溶生標(biāo)準(zhǔn)的制定、支持BE豁免。但是IVIVC的概念不適用于所有藥品，因此它對相關(guān)溶生方法的開發(fā)和制定有意義的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)造成了挑戰(zhàn)。根據(jù)生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)，阿托伐他汀屬于BCSII類（低溶解高滲透）藥品。對于BCSII類藥品，可能能夠通過溶生試驗預(yù)測體內(nèi)的結(jié)果，因為溶生速率是影響吸收的主要限制因素。Palemetal.,Ahjel和Lupulesa,Narasaiah等人近些年已經(jīng)開展了一些阿托伐他汀片溶生度的實驗。但是這些實驗主要評估不同處方之間的理化差異，缺乏對體內(nèi)行為的研究。2004年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布了用于質(zhì)量控制的溶生實驗條件，使用美國藥典方法2,轉(zhuǎn)速75rpm,緩沖液體系為pH6.8的50mM磷酸鉀緩沖液。本文的主要目的是開發(fā)并驗證一種可用于實驗室常規(guī)使用的、具有區(qū)分度的阿托伐他汀鈣片溶生方法，并根據(jù)體內(nèi)模型闡述藥品的釋放過程。體外溶由數(shù)據(jù)與體內(nèi)吸收的數(shù)據(jù)進行比較，體內(nèi)的數(shù)據(jù)是通過巴西的參比制劑（RP）和仿制藥的一個中試批（PB）進行生物等效性試驗獲得的。使用HPLC和UV方法進行定量分析。實驗材料和方法實驗材料純度為99.85%的阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，兩批用于測試的阿托伐他汀鈣片（PA和PB）,生物等效性試驗用到的RP和PB,以及相應(yīng)的空白對照品。以上試劑都由當(dāng)?shù)氐闹扑幑咎峁?。兩批中試產(chǎn)品的區(qū)別在于，PB中竣甲基纖維素鈉（崩解劑）的含量比PA高3%。參比制劑采購自當(dāng)?shù)厥袌?，藥品商品名為Citalor?,規(guī)格80mg,批號0691060,體內(nèi)體外試驗使用同一批號。HOLC級的乙睛和甲醇來自TEDIA公司(Fairfield,USA)。溶由介質(zhì)和分析中使用的超純水由(Millipore?,Milfor,MA,USA)制備。其他所有化學(xué)制劑都為試劑級。阿托伐他汀鈣的HPLC定量和UV分析文獻調(diào)研顯示沒有特定的用于阿托伐他汀鈣溶生實驗的分析方法。因此我們根據(jù)ICH2005的要求，開發(fā)了一種HPLC測定的方法，用于初步的溶生度實驗研究。HPLC系統(tǒng)使用島津的工作站，包括LC-20AT的泵，SPD-M20A的光電二極管陣列(PDA)檢測器，CBM20A系統(tǒng)控制器，DGU-20A5脫氣機，CTO-20AC柱溫箱和SIL-20AC自動進樣器。使用LCsolution軟件獲取和處理數(shù)據(jù)。使用在25c下的RP-18柱(250X4.6mm;粒徑，5以m＞進行色譜分析，流動相由pH4.2乙酸鈉緩沖液：乙睛(45:55,v/v)的混合物組成，流速為1.0mL/min,注射體積為20以L。在245nm波長下進行檢測。使用的紫外-可見分光光度計型號為UV-1800,配備有1cm石英電池的雙光束(Shimadzu,Kyoto,Japan),光譜帶寬(1±0.2nm)波長精度為土0.1nm。使用島津UVProbe軟件2.33進行儀器控制，數(shù)據(jù)采集和分析。體內(nèi)數(shù)據(jù)采用2X2的生物等效性試驗設(shè)計，每個周期中61名健康受試者服用試驗制劑或參比制劑?？诜蝿┝亢?，在3個半衰期的時間段內(nèi)采集血液樣本，兩個周期之間最小間隔7個半衰期(清洗期)0RP和PB的藥代參數(shù)、各自的CV和IC90%見表一。體內(nèi)數(shù)據(jù)通過Scientist?version2.0(MicroMath?)軟件進行非線性回歸方法分析。通過二室模型和相關(guān)參數(shù)計算中間血藥濃度。通過Loo-Riegelman方法計算藥物隨時間的吸收分數(shù)(fractionabsorbed,FA)。為了計算IVIVC,通過線性回歸分析的方法計算RP、PB的吸收分數(shù)(FA)和經(jīng)溶生方法測得的溶由分數(shù)(dissolvedfraction,FD)。表I:RP和PB的藥代參數(shù)、CV和IC90%初步體外研究阿托伐他汀鈣溶解度測定首先進行阿托伐他汀鈣漏槽條件試驗，在不同的溶劑中，加入過量的阿托伐他汀鈣，散裝加入到管中，一式三份，溶劑體積10mL,37±0.5°條件下磁力震蕩24小時。溶劑包括：HCl(0.1M),pH1.2不含酶的胃液，pH3.0檸檬酸鹽緩沖液，pH4.0乙酸鹽緩沖液，pH5.0,6.0和6.8的磷酸鹽緩沖液，水。24小時后，將所有溶液3000rpm離心15分鐘，通過定量過濾器過濾。用甲醇/水(50:50v/v)按1:5比例稀釋，0.45以m尼龍膜過濾后通過LC法分析。溶由度儀和靈敏度使用VankelVK7010溶生度工作站(n=8)進行方法開發(fā)和驗證，該設(shè)備通過雙向蠕動泵連接VK8000自動取樣工作站。使用DM-20型數(shù)字式電位器(S?oPaulo,Brazil）用于測定所有緩沖溶液的pH值。所有溶生度條件的測試都在預(yù)先加熱到37±0.5的00mL溶液中進行。實驗考察了不同的轉(zhuǎn)速、緩沖液組成、以及漿法、籃法帶來的影響。分別在5,10,15,20,30,45,60,和120分鐘，由自動取樣器經(jīng)35以m過濾器過濾后，抽取各條件下的溶液，用HPLC和UV的方法進行分析。為了評估哪種溶劑更有區(qū)分力，將不同時間點溶由和吸收分數(shù)的數(shù)值繪制成圖像，比較在預(yù)定的溶生條件下，哪種可以觀察到溶生度和體內(nèi)吸收有最大的相似性。通過此步驟選曲的溶劑將用于后續(xù)的評估。RP和PB在不同條件中都進行了上述比較。溶由方法驗證根據(jù)現(xiàn)行的指導(dǎo)原則，進行了溶生方法的方法學(xué)驗證?？疾靺?shù)包括專屬性、準(zhǔn)確性、線性、精密度和耐用性，還對溶由介質(zhì)的脫氣情況、過濾器對實驗的干擾以及穩(wěn)定性進行了考察。專屬性通過用和RP具有相同處方的PB空白對照品進行專屬性評估。將對照品轉(zhuǎn)移至分離管中（n=3）,37±0.5°C條件下900mL溶劑溶解，并用美國藥典方法2以150rpm轉(zhuǎn)速攪拌90min。樣本過濾后使用HPLC和UV方法檢測。通過PDA進行峰純度檢測顯示由分析物的色譜峰只包含一種物質(zhì)。在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，對經(jīng)溶生介質(zhì)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照品溶液進行UV分析。線性采用合適的溶劑做稀釋的情況下，HPLC方法的線性范圍為10.0-175.0以g/mLUV法線性范圍1.0-17.5以g/mL將溶液做成3個平行樣，連續(xù)三天獲取HPLC和UV的數(shù)據(jù)。通過回歸分析評估線性，用最小二乘法計算，并用方差分析（ANOVA）評估擬合度。準(zhǔn)確度和精密性在容器中通過往空白對照品溶液中加入已知數(shù)量的阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（分別加入對應(yīng)正常值的25%、100%和125%的阿托伐他汀鈣），進行回收試驗，來考察分析方法的準(zhǔn)確度。具體方法為，將含有20mg/mL的，體積為1.0,4.0和5.0mL的阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用甲醇溶解，分別加入到含有溶生介質(zhì)和空白對照品的容器中，最終體積為900mL。預(yù)熱至37±0.5°許使用USP方法2,50rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)60min。等份取樣，過濾，必要時可以用溶劑稀釋，并通過HPLC和UV進行分析。上述研究在3個不同的日子進行，分別檢測所添加物質(zhì)的回收率。為了評估該方法的重復(fù)性，精密度實驗與準(zhǔn)確度考察同時開展。2名不同的分析人員在不同日期對RP片的溶由曲線進行中間精密度分析，同時每次分析都當(dāng)天配制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液?；谙鄬?biāo)準(zhǔn)誤差（RSD）確定重復(fù)性，基于每個時間點兩個溶液間的差異確定中間精密度。溶液脫氣和過濾器的影響將溶液加熱到42。C脫氣，然后真空過濾。比較用脫氣溶液和非脫氣溶液獲得的溶由曲線，確定實驗中應(yīng)使用脫氣后的溶液。將與正常片重量一致的空白對照品轉(zhuǎn)移至燒杯中，37±0.5。攬拌1小時，隨后加入阿托伐他汀鈣，終濃度為250以g/mL。抽取10mL等份試樣,35以m過濾器過濾后用流動相稀釋，得到濃度為100以g/mL的溶液，上樣前再用0.45以m的膜過濾。相同溶液的另一份試樣按相同的程序操作，但以3000rpm離心5分鐘，不過濾。色譜分析結(jié)果顯示，可以使用過濾器過濾。過濾后樣品的檢測結(jié)果在未過濾的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液、離心后的樣品溶液的98-102%之間。耐用性通過在一定程度上改變?nèi)芤旱膒H值（pH5.8和6.2）的方法測試溶生度方法的耐用性。藥物在調(diào)整過pH的緩沖液中的溶生度和正常條件下（pH6.0）的溶由度相比，通過Student'檢驗分析。HPLC和UV間的比較，不同溶由曲線間的比較通過Student'檢驗，評估HPLC和UV兩種方法檢測阿托伐他汀鈣溶生度實驗中的適用性。比較中使用的數(shù)值是通過在5,10,15,30,45,和60分鐘在每個單獨的容器中取樣得到的中間精密度。RP、PA和PB的溶由曲線通過非模型依賴型的方法分析，包括差異因子f1和相似因子f2o結(jié)果和討論阿托伐他汀鈣溶解度和漏槽條件阿托伐他汀鈣溶解度的結(jié)果（圖1）是溶由介質(zhì)和漏槽條件選擇的基礎(chǔ)。pH6.0和6.8的磷酸鉀緩沖液滿足80mg劑量的漏槽條件，因此在初步研究中使用這兩種緩沖液。圖1:阿托伐他汀鈣在不同介質(zhì)中的溶解度（37攝氏度、24小時）溶由方法選擇首先，在37±0.5°條件下，按美國藥典方法1,以75和100的轉(zhuǎn)速分別在900ml的pH6.0和pH6.8的磷酸鉀緩沖液中檢測參比制劑的溶生度（n=6）o按照美國藥典方法1,使用40目的籃子不能使足夠的藥物從籃中轉(zhuǎn)移到溶液中，又因為片重較重（約1000mg）,轉(zhuǎn)速也不合適。在增加轉(zhuǎn)速至100rmp后，阿托伐他汀鈣的溶解度最大只達到80%o上述實驗結(jié)果不值得繼續(xù)開發(fā)籃法的溶生方法，為了獲得阿托伐他汀鈣的完全溶生，我們對美國藥典方法2進行了研究。采用美國藥典方法2,在pH6.0的900mL溶液中用50和75rpm的速度攪拌。溶由曲線顯示此法可以獲得較高的溶生速率，在75rpm的轉(zhuǎn)速下達到快速溶生，特別是當(dāng)與50的轉(zhuǎn)速相比，前3個取樣點的溶生最為明顯。即使采用較低的轉(zhuǎn)速，開始階段的溶生較慢，且更平緩，但與體內(nèi)吸收數(shù)據(jù)相比，仍然超生了希望的IVIVC水平（圖2）。圖2:槳法，轉(zhuǎn)速50和75rmp,pH6.0的900mL磷酸緩沖液條件下，阿托伐他汀鈣參比制劑（n=6）的溶由曲線為了降低溶由速率，我們嘗試了降低攪拌槳的轉(zhuǎn)速至35和40rpm。結(jié)果顯示與先前的實驗相比，降低轉(zhuǎn)速的確可以減緩溶生速率，開始階段溶生也較平穩(wěn)，但這樣會使溶生過程暫停，部分劑量始終不能溶解。為了使藥物完全溶解，同時獲得IVIVC,我們選擇了美國藥典方法2,50rpm轉(zhuǎn)速，pH6.0和6.8的900mL緩沖液。這些條件用來與體內(nèi)吸收數(shù)據(jù)相比，建立最有區(qū)分力的溶生方法。盡管溶由速率高于體內(nèi)吸收，但這兩種條件下RP和PB都可以完全的溶由。由于處方中竣甲基纖維素含量較低,PA在上述條件下未能完全溶由（圖3）o圖3:槳法，50rpm轉(zhuǎn)速，pH6.0(a)和pH6.8(b)的磷酸鹽緩沖液中，各樣品的溶由曲線，用以篩選最有區(qū)分力的溶生條件。溶生方法的靈敏度是指該方法能反映由產(chǎn)品變化的能力。一個有區(qū)分力的溶生方法，應(yīng)該在模擬胃腸道(TGI)的體外測試環(huán)境下，反映由藥品在體內(nèi)吸收的過程。在圖3中可以看由，pH6.0的磷酸鉀緩沖液(f2=63.74)與pH6.8的磷酸鉀緩沖液(PB和RP的f2=81,19)相比，前者更好的對應(yīng)藥物的體內(nèi)數(shù)據(jù)。盡管溶生和吸收的速率不同，兩種制劑的輕微的體內(nèi)吸收差異也可以通過溶由差異反映由來。pH6.0的緩沖液可以使RP和PB都獲得與吸收曲線有較好對應(yīng)的溶由曲線。在這種介質(zhì)中，采用槳法、50rpm轉(zhuǎn)速，可以觀察到產(chǎn)品見有不同的溶由曲線，和體內(nèi)吸收曲線觀察到的差異一致。當(dāng)使用pH6.8的緩沖液時沒有觀察到這種現(xiàn)象。因此，我們提由為了獲得最有區(qū)分力的溶由曲線，槳法，50rpm轉(zhuǎn)速，pH6.0的磷酸鹽緩沖液是最合適的。需要補充說明的是，在初步研究階段，與剛剛配置的樣品相比，阿托伐他汀鈣樣品在實驗條件下的穩(wěn)定性范圍是99.59%-101.06%,說明樣品在配置后24小時中可以保持100±2%勺穩(wěn)定性范圍。IVIVC過程中體內(nèi)數(shù)據(jù)的處理阿托伐他汀鈣的體內(nèi)數(shù)據(jù)通過RP和PB的體內(nèi)生物等效性試驗獲得。體內(nèi)試驗采用的樣品批次與溶生方法開發(fā)和IVIVC中用到的批次一致。阿托伐他汀鈣在二室模型中的平均血藥濃度如圖4所示。選擇這個模型是基于最佳數(shù)學(xué)和圖形擬合。通過Scientist?程序計算從生物等效性試驗中獲取的平均血藥濃度，與程序預(yù)測值進行疊加計算，并運用模型選擇標(biāo)準(zhǔn)進行判斷。血藥濃度-時間數(shù)據(jù)通過Loo-Riegelman法轉(zhuǎn)化為吸收分數(shù)（FA）。圖3a顯示了服用RP和PB的阿托伐他汀鈣后吸收分數(shù)-時間曲線。通過與生物等效性試驗獲得的FA相比，RP和PB都有更快的溶由曲線。由于數(shù)據(jù)問的內(nèi)在差異，無法得到合適的線性關(guān)系。圖4:阿托伐他汀鈣參比制劑（a）和中試批（b）的平均藥時濃度曲線。因此，我們采用了時間比例因子的方法。這個因子可以用于體外溶由速率快于或慢于體內(nèi)吸收速率的情況下。時間比例因子可以通過將一定劑量的藥物在體內(nèi)吸收所需的時間，與相同劑量的藥物在體外溶生所需要的時間進行對比。在對原點（零）進行線性回歸后，將直線的斜率作為時間比例因子，從而獲得IVIVCo因此，我們在10-90%的劑量分數(shù)內(nèi)，對比了體內(nèi)吸收和體外溶生的時間，結(jié)果如表II所示。圖5展示了數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，RP和PB的斜率分別為5.7和6.1o表II:PR和PB在一定劑量分數(shù)下的溶由時間（TD）和吸收時間（TA）圖5:溶生或吸收相同質(zhì)量的阿托伐他汀鈣，內(nèi)體所需時間和體外時間的線性回歸關(guān)系因此，通過此方法可以得到時間比例因子大約為6.0o之后將這個值用于RP和PB的體內(nèi)吸收曲線、體外溶由曲線的比較（圖6）。給定時間內(nèi)的溶由分數(shù)，與時間乘以6的吸收分數(shù)做對比。表III顯示了線性回歸的結(jié)果，在900毫升pH6.0的磷酸鉀緩沖液，槳法50rpm的條件下，可以建立A級水平的相關(guān)性。圖6:引入時間比例因子后，參比制劑（a）和中試批產(chǎn)品（b）的溶由-吸收關(guān)系表III:采用時間比例因子后的IVIVC回歸分析使用相關(guān)方程，評估使用RP和PB預(yù)測的FA及預(yù)測誤差，以評估模型的準(zhǔn)確度。每個誤差反映了預(yù)測值和實測值的差異，這個差異低于FDA1997年設(shè)定的10%的標(biāo)準(zhǔn)以下。這表明我們提由的溶生度方法有很高的精確度，可以作為體內(nèi)研究的替代方法（表IV）。溶生度方法驗證專屬性色譜分析顯示在相同的保留時間內(nèi)，空白對照制劑沒有顯示吸收峰。PDA檢測器顯示，峰純度高于0.9999o止匕外，專屬性分析表明UV法在245nm處沒有收到輔料的干擾，因此在此溶生方法中，HPLC和UV法都可以用于阿托伐他汀鈣的定量檢測。線性HPLC（濃度范圍10.0至175.0以g/mL）和UV（濃度范圍1.0-17.5以g/mL）的方法都進行了線性研究，兩者的確定系數(shù)分別為0.9995和0.9999。在pH6.0的磷酸緩沖液中，線性回歸得到的方程分別為：HPLC:y=46546x?8588.7,UV:y=0.0374x0.083。ANOVA分析顯示，線性無顯著性差異（p>0.05）。用student'St驗評估截距在回歸方程中的意義，結(jié)果表明與理論0值無差異，兩種方法的p>0.05o準(zhǔn)確度、精密度通過加入已知質(zhì)量的阿托伐他汀鈣，測量回收率的方法評估準(zhǔn)確度。連續(xù)三天，每個阿托伐他汀鈣濃度分別用HPLC和UV進行兩次測量。HPLC測得的平均回收率為（平均數(shù)%iRSD99.60±1.55,99.81±1.2和99.56±0.93,使用UV法測得的平均回收率為99.40±1.82,101.42±0.94101.82±1.26o較低的RSD水平表明，本文表述的溶由曲線的定量分析有較好的準(zhǔn)確度和精密度。中間精密度通過比較參比制劑的兩條溶由曲線考察。HPLC和UV法在每個時間點上的檢測結(jié)果與平均數(shù)（n=6）的差異都小于2%,確定了方法的精密度。評估脫氣與過濾器的使用溶解在溶劑中的氣體可能通過多種方式影響試驗結(jié)果。溶解性氣體可以顯著改變非緩沖液的pH值，通過形成氣泡改變流體流動模式，并改變活性成分的性質(zhì)和分析結(jié)果。在非脫氣和脫氣的溶劑中進行的實驗顯示樣品溶由行為不受影響，在溶生度測試中也沒有觀察到干擾。過濾器的評估，對于確定它是否可以