PRRSV經(jīng)典株與Nsp2變異株RT-PCR鑒別診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

PRRSV經(jīng)典株與Nsp2變異株RT-PCR鑒別診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（檢驗(yàn)SOP）.適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）經(jīng)典毒株與Nsp2基因缺失株的特異性逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）區(qū)分技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于疑似感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的豬的組織、血液及其他病料樣品。.試劑天根公司TIANampVirusRNAKit病毒RNA提取試劑盒，目錄號(hào)：DP315-R賽百盛公司goldview天根公司QuantOneStepRT-PCRKit目錄號(hào)：KR113瓊脂糖分析純酒精（99.7%）6DNA電泳LoadingBuffer.實(shí)驗(yàn)室條件儀器：PCR儀、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、電泳儀、電泳梢、冰箱、紫外儀、微量移液器、水浴箱等。從事PCR工作的實(shí)驗(yàn)室盡可能分區(qū)，根據(jù)條件劃分出DNA提取區(qū)、基因擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。特別注意電泳后的瓊脂糖凝膠要及時(shí)處理，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成污染。.試劑的準(zhǔn)備擴(kuò)增PRRSV的引物：PRRSVP1、PRRSVP2、PRRSVLOW。1.5%瓊脂糖凝膠加入0.1%goldview1TAE緩沖液goldview滅菌超純水DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(MarkerDL1000).操作步驟樣品處理處理材料：a.材料為發(fā)病豬只血液、血清或淋巴液可直接吸取140b.材料為細(xì)胞上清液，可直接使用140區(qū)新鮮上清混勻。c.材料為貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)先處理為細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融三次，然后3000r/min離心5min,取上清液140區(qū)bd.材料為病豬肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病料樣品時(shí)，需要先用生理鹽水或PBS進(jìn)行研磨，收集研磨物后反復(fù)凍融3次，12000r/min離心10min,取上清140wb用移液器將560"LCarrierRNAT作液(為裂解液RL與CarrierRNA溶液的混合液，配制方法如附錄配液表配制)加入一個(gè)干凈的1.5mL離心管中。注意：如果樣本體積大于140^1,可等比例增加工作溶液和無(wú)水乙醇的用量。向離心管中加入140區(qū)檢測(cè)樣品（樣品需平衡至室溫），渦旋振蕩15秒混勻。注意：為了保證裂解充分，樣品和CarrierRNA工作液需要徹底混勻。在室溫（15-25C）孵育10分鐘。簡(jiǎn)短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。加入560區(qū)疣水乙醇，蓋上管蓋并渦旋振蕩15秒。注意：如果周圍環(huán)境高于25C,乙醇需要在冰上預(yù)冷后再加入。簡(jiǎn)短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。仔細(xì)將離心管中的630W腋體轉(zhuǎn)移至RNase-fre破WttiCR2（吸附柱放在2mL收集管中），蓋上管蓋，6000%（8000rpm）離心1分鐘，棄廢液,將吸附柱放回收集管。注意：如果吸附柱上的液體未能全部離心至收集管中，請(qǐng)加大轉(zhuǎn)速，延長(zhǎng)離心時(shí)間至液體完全轉(zhuǎn)移到收集管中，如為組織苗，在過(guò)柱前請(qǐng)離心后將上清液過(guò)柱。重復(fù)此步驟7。小心打開吸附柱蓋子，加入500小蟒液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），蓋上管蓋，6000%（8000rpm）離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管。小心打開吸附柱蓋子，加入500區(qū)喀液RW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），蓋上管蓋，6000%（8000rpm）離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管。將吸附柱放回收集管中，13,400g（12,000rpm）離心3分鐘，使吸附膜完全變干，棄廢液。注意：乙醇的殘留可能會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響?？蛇x步驟：將吸附柱放回2mL收集管中，打開吸附柱蓋子，室溫放置3分鐘，使吸附膜完全變干。將吸附柱放入一個(gè)RNase-free超凈離心管(1.5mL)中，小心打開吸附柱的蓋子，向膜中央加入60區(qū)LRNase-freedd^O,蓋上蓋子，室溫放置5分鐘。6000xg(8000rpm)離心1分鐘?？蛇x步驟：將上一步驟的洗脫液再次加入膜中央，并6000為(8000rpm)離心1分鐘，以增強(qiáng)RNA洗脫效果。注意：確保洗脫液(RNase-freeddH2O)在室溫平衡后再使用。如果加入洗脫液的體積很小(小于50科1),為了將膜上的RNA充分洗脫下來(lái)，應(yīng)注意將洗脫液加到膜的中央位置。洗脫體積可以根據(jù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求靈活處理，洗脫液(RNase-freeddH2O)加到吸附柱后，離心前在室溫放置5分鐘，有助于提高RNA的產(chǎn)量。將提取的RNA樣品按照下條件進(jìn)行RT-PCR,剩余部分請(qǐng)及時(shí)放入-80C保存(所有配置工作均在冰上進(jìn)行)。檢測(cè)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。配置如下體系：(25林L體系)TOC\o"1-5"\h\zRnase-freeddHO8.75L10XRT-PCRbuffer2.5dNTPMixture1.05XRT-PCRenhancer5.0HotmasterTaqpolymerase1.25LQuantRtase0.25LRnase0.25L擴(kuò)增引物(P1\P2\LOW)各1.0MRNA模板3.0抹LPRRSV檢測(cè)反應(yīng)條件:⑴反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min50c⑵PCR預(yù)變性4min94c⑶變性40s94c]⑷退火40s55c335Cycles⑸延伸40s65c,(6)延伸10min65c⑺保溫16C電泳制備1.5%瓊脂糖凝膠板。取5山PCR產(chǎn)物與1人的上樣緩沖液(10Moadingbuffer)混勻后加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中。加入分子量標(biāo)準(zhǔn)。蓋好電泳儀，插好電極，90V電壓電泳，1h。在紫外儀觀測(cè)下用數(shù)碼相機(jī)照相并進(jìn)行照片存檔。用分子量標(biāo)準(zhǔn)比較判斷PCR片段大小。.結(jié)果判定每次樣品應(yīng)當(dāng)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照(經(jīng)典毒株與Nsp2缺失毒株)及空白對(duì)照，若待檢樣品擴(kuò)增出與經(jīng)典毒株標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照大小相同的特異性條帶且空白對(duì)照無(wú)條帶，即可判為經(jīng)典毒株感染；若檢測(cè)樣品擴(kuò)增出Nsp2基因缺失株標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照大小相同的特異性條帶且空白對(duì)照無(wú)條帶，即可判斷為Nsp2基因缺失毒株感染；未擴(kuò)增出與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照大小相近的

特異性條帶，則判為陰性；若空白對(duì)照擴(kuò)增出與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照相似的條帶，則該次實(shí)驗(yàn)判為失敗，應(yīng)當(dāng)重新進(jìn)行一次RT-PCR檢測(cè)圖1PRRSV的檢測(cè)結(jié)果M:MarkerDL1000;+1為CH-1a株陽(yáng)性對(duì)照，+2為經(jīng)典株陽(yáng)性對(duì)照、+3為變異株陽(yáng)性對(duì)照;1、2、3、4為樣品編號(hào)。注：藍(lán)耳變異株擴(kuò)增目的片段為180bp，藍(lán)耳經(jīng)典株擴(kuò)增目的片段為250bp。附錄：TAE電泳緩沖液(50X)10.5mol/L乙二俊四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二俊四乙酸二鈉18.61gTOC\o"1-5"\h\z滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLTAE電泳緩沖液(50X配制三羥甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二俊四乙酸二鈉溶液(pH8.0)100mL滅菌雙蒸水加至1000mL1%瓊脂糖凝膠的配制瓊月旨糖1.5gTAE電泳緩沖液(1X)100mL微波爐中完全融化，加goldview5也混勻。.CarrierRNA工作液的配制樣品個(gè)數(shù)RV(mL)CarrierRNA水溶液(I)樣品個(gè)數(shù)RV(mL)CarrierRNA水溶液10.565.6137.2872.821.121