生化檢測系統(tǒng)性能驗證

生化檢測系統(tǒng)

性能驗證為什么要做性能驗證？《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》《ISOl5189—醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》

二者均要求，設備在臨床應用之前必須要進行性能驗證；

目的：確定設備能達到所要求的性能指標；設備的性能是否合格，對檢驗結果的準確性起決定性的作用。什么是性能驗證？性能驗證試驗

對配套系統(tǒng)，一般驗證下列指標：

―準確度(accuracy)---EP15-A―精密度(precision)---EP5-A2―線性范圍（linearrange)---EP-6―可報告范圍(reportablerange)---EP-6―參考區(qū)間(referenceinterval)---C28-A2

對非配套系統(tǒng)，驗證更為廣泛。什么時候做性能驗證試驗？1.方法或系統(tǒng)首次在實驗室使用；

2.EQA(室間質(zhì)量評價)或PT（能力驗證）結果未通過，采取糾正措施后；

3.達到文件規(guī)定周期做性能驗證時首先滿足的實驗條件儀器的維護保養(yǎng)儀器校準室內(nèi)質(zhì)控試劑、校準品（有效期、批號等）人員（SOP）

保證儀器在最佳狀態(tài)一.精密度驗證實驗基本概念

測量精密度(measurementprecision)

在規(guī)定條件下，對同一或相似被測對象重復測量得到測量示值或測得量值間的一致程度。

1.測量精密度通常由不精密度的量度以數(shù)字表達，如規(guī)定測量條件下的標準差、方差和變異系數(shù)。

2.規(guī)定的條件可以是測量的重復性條件、測量的中間精密度條件或測量的再現(xiàn)性條件。

3.測量精密度用于定義測量重復性、中間測量精密度和測量再現(xiàn)性?；靖拍顪y量重復性在一組測量條件下的測量精密度，包括相同測量程序、相同操作者、相同測量系統(tǒng)、相同操作條件和地點，并且在短時間段內(nèi)對同一或相似被測對象重復測量。

1.在臨床化學上，即所謂的批內(nèi)精密度。

2.在評估體外診斷醫(yī)療器械時，通常重復性條件來代表基本不變的測量條件（被稱為重復性條件），產(chǎn)生的測量結果是最小變異。3.重復性信息可對故障排除目的有用處。

基本概念測量再現(xiàn)性：在包括了不同地點、不同操作者、不同測量系統(tǒng)的測量條件下對同一或相似被測對象重復測量的測量精密度。

1.在臨床化學上，即所謂的室間精密度。

2.在評估體外診斷醫(yī)療器械時，通常再現(xiàn)性條件代表了最大改變的條件（被稱為再現(xiàn)性條件），產(chǎn)生于獨立實驗室間比較結果時遇到的測量結果變異，如發(fā)生在室間比對計劃中（例如，能力比對）。

基本概念3.不同測量系統(tǒng)可使用不同測量程序。

4.應在實際程度上給出改變或不改變條件的說明?；靖拍钪虚g精密度在一組測量條件下的測量精密度，這些條件包括相同的測量程序、相同地點并且對相同或相似的被測對象在一長時間段內(nèi)重復測量，但可包含其它相關條件的改變。

1.應在實際程度規(guī)定改變和未改變的條件，特別是如校準物、試劑批號、設備系統(tǒng)、操作者和環(huán)境條件等變量。

2.在體外診斷醫(yī)療器械評價中，一般中間精密度條件代表醫(yī)療器械在一長時間段內(nèi)的實際使用條件。實驗方法批內(nèi)精密度在相同的測量條件下，在最短時間內(nèi)（常是在同一測量批次內(nèi)）對同一樣品測量20次，由此計算出批內(nèi)精密度。實驗方法批間精密度在一段時間內(nèi)（一般為連續(xù)20個工作日）對同一樣品（常為質(zhì)控品），每天測定一次，每次測定雙份，由此計算出批間精密度。如果時間緊，也可改為測5日，每天分2批進行，每批重復測定2次，每次至少間隔2h，每個濃度每天能獲得4個數(shù)據(jù)。由此計算出總精密度。實驗樣本的選擇1.實驗樣本要穩(wěn)定，其基質(zhì)組成應盡可能與臨床樣本相似。一般常采用臨床實驗室收集的穩(wěn)定和冷凍貯存的血清；

2.實驗樣本的濃度盡可能選擇與廠商聲明性能相近的濃度或接近該項目醫(yī)學決定水平的濃度。

3.通常選擇穩(wěn)定性好的、血清基質(zhì)的質(zhì)控物作為實驗樣品。樣本濃度的選擇1.精密度大小和樣品濃度有關樣品濃度高時，雖然標準差的絕對值較大，但變異系數(shù)往往變小。所以評估精密度時，建議評估高低二個濃度的精密度。當二個濃度的精密度有顯著差異時，建議增加為三個濃度。樣本濃度的選擇2.所選濃度應在測量范圍內(nèi)有醫(yī)學意義的值，即至少有一個濃度在醫(yī)學決定水平(medicaldecisionlevels)左右。

不要為了得到較小的精密度，都選用較高值的樣品，甚至超出測量范圍。也不應選用靠近最低檢出限的樣品，此時所得的精密度往往偏大。如沒有醫(yī)學決定水平，可在參考區(qū)間上限左右選一個濃度。此外再根據(jù)檢驗項目的性質(zhì)在線性區(qū)間內(nèi)選擇一個值。試劑和校準品的要求

在整個階段，盡可能使用相同條件，應使用同一種類同一批號的試劑和校準物，如有可能，只進行一次校準。使用不同批號試劑和多次校準都會增加檢驗結果的變異程度。質(zhì)量控制

檢驗時應同時至少測一個質(zhì)控品。當質(zhì)控品結果超出規(guī)定的失控限，不論實驗結果是否滿意都應棄去不用，重新進行試驗以取得實驗數(shù)據(jù)。要保存所有的質(zhì)控數(shù)據(jù)和失控處理記錄。在正式實驗前操作者應熟練掌握1.操作程序

2.保養(yǎng)程序

3.樣本準備

4.校準及檢測程序

數(shù)據(jù)收集

分析前，檢查數(shù)據(jù)中有無由于偶然差錯引起的離群值(outliers)。離群值的標準：任何結果和總均值的差超過4個標準差。為了能收集到至少20個有效數(shù)據(jù)，除補充由于質(zhì)控失控而增加的測試外，還應再增加由于離群值不用于精密度的計算所需增加的檢驗次數(shù)。數(shù)據(jù)收集

進行批內(nèi)精密度評估實驗時，一次只能有一個離群值，當不接受數(shù)據(jù)超過2個，應懷疑是否為方法不穩(wěn)定或操作者不熟悉所致。此時應不用此次試驗數(shù)據(jù)，檢查問題和解決問題后重新開始新的評估實驗。*必須保留任何離群值和室內(nèi)質(zhì)控失控的記錄。結果分析

計算均值、標準差和變異系數(shù)。從CLIA’88允許誤差表中查閱評價的該項目的允許誤差范圍。

判斷標準批內(nèi)精密度—CV值要求低于1/4CLIA’88允許誤差。批間精密度—CV值要求低于1/3CLIA’88允許誤差。CLIA’88允許誤差范圍不涉及的項目：

EQA的允許誤差試劑說明書提供二.正確度驗證實驗基本概念準確度（accuracy）指檢測結果與被測量真值之間的一致程度。正確度（truness）指大批檢測結果得到的平均值與真值的一致程度。通常用統(tǒng)計量“偏倚”來表示。偏倚（bias）指測量結果的預期值與可接受值間的差異。以檢測計量單位或百分率表示，即平均值與參考值的差異?；靖拍钫`差（error）指對于真值或?qū)τ诳山邮艿?、預期真值或參考值的偏離，分為隨機誤差和系統(tǒng)誤差?？傉`差（totalerror）指某實驗室用某方法在多次獨立檢驗中分析某樣品所得各個結果值與靶值之差在一定置信區(qū)間內(nèi)的最大值。包括隨機誤差和系統(tǒng)誤差，是不準確度的估計值。文件依據(jù)CLSI頒布的EP15-A文件《用戶對精密度和準確度性能的核實指南》參考物質(zhì)：選擇有證的參考物質(zhì)，或具有結果互換性的校準品，選擇兩個水平。樣本比對：隨機選取20份人源樣本。

實驗方案定值參考物來源1.已用參考方法或決定性方法定值的新鮮冰凍人血清或其他一些未摻入成分的人物質(zhì)；2.從能力比對試驗中獲得的參考物；3.廠家提供的正確度確認物或質(zhì)控物；4.實驗室室間質(zhì)評物；5.由第三方提供的已用一些不同方法定值的物質(zhì)。實驗方法（參考物質(zhì)）至少要求測定2個水平，選擇的水平應能代表方法的最低和最高測量范圍；連續(xù)測定3-5天，每天一個分析批，每批兩個濃度水平，每個濃度水平同一樣品重復測定2次；統(tǒng)計連續(xù)3-5天的測定數(shù)據(jù)，計算得出均值、標準差和不確定度，并根據(jù)T臨界值確定置信區(qū)間上下限；判斷每個正確度驗證物質(zhì)指定濃度是否在數(shù)據(jù)統(tǒng)計得出的置信區(qū)間內(nèi)。正確度驗證-數(shù)據(jù)統(tǒng)計（參考物質(zhì)）濃度水平指定濃度結果

次數(shù)第一天第二天第三天第四天第五天水平19.70第一次10.7010.509.9010.509.10第二次10.1010.409.1010.309.90水平234.20第一次38.2036.7036.6037.2033.80次二次36.0035.7035.9036.1032.10濃度水平測試計數(shù)均值標準差不確定度t-臨界值上置信限下置信限水平11010.050.560.1783.2510.6309.470水平21035.831.730.5483.2537.61034.050結論水平1計算得出的95%置信區(qū)間為9.470-10.630umol/L;水平2計算得出的95%置信區(qū)間為34.050-37.610umol/L,包括參考物質(zhì)水平1濃度:9.70umol/L和參考物質(zhì)水平2濃度:34.20umol/L,實驗驗證數(shù)據(jù)能夠證實正確度,正確度驗證通過。實驗方法（樣本比對）檢測20份患者樣品，其濃度水平覆蓋檢測方法的可報告范圍；在實驗室以常規(guī)操作方式檢測新鮮患者樣品；在3-4天時間內(nèi),每天由試驗方法和比較方法在4h內(nèi)檢測5~7份樣品；評價質(zhì)量控制程序，確保穩(wěn)定的操作條件和有效的實驗結果；檢查比較數(shù)據(jù)識別任何異常的結果；計算配對結果之間的差值，并繪制差值與比較值之間的差值圖，用圖形顯示；將數(shù)據(jù)進行配對t-檢驗計算，確定方法之間的平均差值以及差值的標準差；計算置信區(qū)間和驗證限，將測量的差值（或百分差值）與廠家的聲明進行比較。正確度YX序號試驗方法比較方法Yi-XiYi-Xi-B(Yi-Xi)%(Yi-Xi-B)%11.8151.98-0.170.35-8.33%17.56%21.8152.01-0.200.32-9.70%15.80%31.127721.425-0.300.22-20.86%15.11%42.71043.155-0.440.07-14.09%2.16%51.63351.735-0.100.41-5.85%23.70%62.33533.435-1.10-0.59-32.01%-17.09%74.28345.505-1.22-0.71-22.19%-12.88%85.65077.67-2.02-1.51-26.33%-19.64%90.998251.05-0.050.46-4.93%43.89%100.676392.6-1.92-1.41-73.99%-54.27%1113.612513.1650.450.963.40%7.29%122.25062.475-0.220.29-9.07%11.65%132.89192.91-0.020.49-0.62%16.99%正確度驗證-數(shù)據(jù)統(tǒng)計（樣本對比）-1144.69485.66-0.97-0.45-17.05%-8.00%150.661871.55-0.89-0.38-57.30%-24.23%163.29123.435-0.140.37-4.19%10.74%170.785290.865-0.080.43-9.22%50.05%180.821590.770.050.566.70%73.27%191.77872.135-0.360.16-16.69%7.32%202.84353.4-0.56-0.04-16.37%-1.29%和

均值2.83388053.34650.510.65

AV(B3:B22)AV(C3:C22)

S(E3:E22)

Y均值X均值差值（B）差值標準差（SDdiff)

置信限pt臨界值測試數(shù)n置信上限置信下限偏倚B偏倚sd0.012.8620-0.10-0.93-0.510.65廠家聲明的變異系數(shù)10.00%驗證區(qū)間上限驗證區(qū)間下限

正確度驗證-數(shù)據(jù)統(tǒng)計（樣本對比）-2三.線性范圍及可報告范圍驗證實驗基本概念線性范圍（linearrange)使實驗系統(tǒng)的最終分析結果為可接受的線性的濃度范圍，此時非線性誤差應低于允許誤差。線性（linearity）在給定的測量范圍內(nèi)，使測定結果與樣本中分析物的量直接成比例的能力?；靖拍罘治鰷y量范圍（analyticalmeasurementrange）是患者樣本不進行任何稀釋、濃縮或其他預處理，由檢測系統(tǒng)直接測量得到的可靠結果范圍（測量結果不精密度和偏倚在允許范圍內(nèi)的分析物的濃度），在此范圍內(nèi)一系列不同樣本分析物的測量值與其實際濃度呈線性比例關系。臨床可報告范圍（clinicalreportablerange)是定量檢測項目向臨床能報告的檢測范圍，患者樣本可經(jīng)稀釋、濃縮或其他預處理，對于臨床可報告范圍大于分析測量范圍的檢測項目，需要進行最大稀釋度實驗，以確定臨床可報告范圍的上限，并結合臨床決定水平和功能靈敏度（定量限）來決定該項目的臨床可報告范圍。文件依據(jù)CLSI頒布的EP6-A文件《定量測量方法的線性評價》儀器要求

應有較好的測定精密度不存在明顯的攜帶污染等。對儀器應進行定期維護及校準，保證其處于正常狀態(tài)。試劑及校準品要求試劑應注意試劑有效期及批號，不可采用過期試劑或不同批號的試劑。校準品可采用與評價試劑配套的校準品。校準品的使用應嚴格按照產(chǎn)品說明，儀器校準步驟與間隔應按照本室的標準操作程序進行。樣本選擇原則和類別樣本選擇原則和類別為避免基質(zhì)效應對結果的影響，選用的樣品應與臨床實驗樣品相似。不可采用含有對測定方法具有明確干擾作用物質(zhì)的樣品，如溶血、脂血、黃疸或含有某些特定藥物的樣品。樣品物濃度應包括試劑廠商提供的試劑所能達到的線性范圍。線性范圍樣品制備1.收集臨床檢測過程中的高值樣品即濃度接近預期測定上限的患者血清（H）和低值樣品(L)，若收集不到低值樣品，可用生理鹽水或蒸餾水替代。

2.將H和L樣品按：1L、3L+1H、2L+2H、1L+3H、1H關系各自配制(必要時可改變比例)混合，形成系列評價樣品。線性范圍樣品測定進行線性范圍驗證時，應進行5個濃度水平的樣品測定，并在1個批次測量中完成實驗，每個樣品至少重復測定2次，測量次序為隨機；如果測定方法本身存在明顯的攜帶污染，應根據(jù)實際情況采取恰當措施盡量避免對測定結果的影響。線性范圍數(shù)據(jù)統(tǒng)計稀釋比

(L:H)稀釋度檢測結果逸出值判斷第1次第2次平均值理論值差異可接受范圍4：011.611.481.555.64-72.616%±20.00%3：12172.91172.01172.46181.31-4.884%2：23360.04367.81363.93356.991.943%1：34542.92580.55561.74532.665.459%0：45674.08696.46685.27708.33-3.256%逸出值判斷各檢測數(shù)據(jù)均在有效范圍內(nèi)，檢測數(shù)據(jù)有效。線性方程y=175.673x-170.031R2=0.995、斜率:=175.673、截距:-170.031結論R2>0.995，項目AFP結果呈線性關系；各稀釋度水平差異在±20.00%范圍內(nèi)，廠家提供的分析測量范圍1-800ng/ml可接受。線性范圍數(shù)據(jù)繪圖稀釋度線性回歸與理論濃度的差異分布線性范圍結果分析以預期值為橫坐標，以實測值為縱坐標進行線性回歸，得到直線回歸方程Y＝aX+b，a在0.97～1.03范圍內(nèi)，r2≥0.95。

可報告范圍樣品測定實驗方法：可采用對標本的稀釋、濃縮或者其他預處理用于擴展直接分析測量下的分析物值得范圍，可建立或驗證儀器或檢測系統(tǒng)測量相應的準確度實驗結果值的范圍。實驗材料：1選用與檢測儀器相配套的試劑，校準品及其他輔助試劑。2按照線性范圍內(nèi)供應商聲明的或穩(wěn)定的高值樣本。操作步驟：1按標本操作規(guī)則做好項目校準、常規(guī)質(zhì)控，保證檢測系統(tǒng)處于良好狀態(tài)。2選擇線性范圍內(nèi)的3份高值血清標本，分別做2、5、10、20、50、100….倍的稀釋，分別檢測稀釋后樣本結果的濃度。測定結果記錄在下表中。可報告范圍驗證實驗數(shù)據(jù)記錄四.分析靈敏度驗證實驗基本概念檢測低限（LLD）指樣品單次檢測可以達到的非空白檢測響應量對應的分析物量。功能靈敏度（FS)指檢測系統(tǒng)可定量報告分析物的最低濃度?？瞻紫蓿↙oB)指在規(guī)定的可能性條件下，空白樣品被觀察到的最大檢測結果。檢出低值（LoD)指在規(guī)定的可能性條件下可以檢出的樣本中分析物的最小量。文件依據(jù)CLSI頒布的EP-17A文件進行靈敏度性能評價。功能靈敏度實驗程序?qū)⑿势坊蛸|(zhì)控品稀釋后，在儀器上分別對不同濃度的樣品連續(xù)測定20次，計算均值、標準差和變異系數(shù)，以不精密度（CV）≤20%時對應檢測限樣品具有的平均濃度即為功能靈敏度。五.抗干擾驗證實驗樣本選擇選取臨床混合血清1例。不可采用溶血、脂血、黃疸或含有某些特定藥物的樣品。樣品物濃度應盡量選擇該項目正常參考區(qū)間內(nèi)的濃度。干擾物的確定根據(jù)臨床樣品的特點，實驗所選干擾物為：結合膽紅素、游離膽紅素、脂肪乳、維生素C(Vc)、血紅蛋白。樣本制備

將每一系列的干擾樣品根據(jù)實驗要求配制成4個不同濃度的樣本血清，按照從低—高、高—低循環(huán)測定5遍，計算每個濃度下的均值與未添加干擾物的樣品的相對偏差，并求取重復性的變異系數(shù)。判斷標準

當相對偏差不超過±15%，重復性變異系數(shù)不超過10%時，可認為對應的干擾物濃度對測定結果無影響。

六.參考區(qū)間驗證實驗實驗目的:

驗證已知參考區(qū)間在本實驗室應用的可接受性。實驗方法1.從健康人群中抽出20個參考個體（最好能夠覆蓋各個年齡段）;2.依照實驗室標準操作規(guī)程檢測樣本;3.發(fā)現(xiàn)離群值應棄用，并用新的參考個體代替，以確保測試結果不含離群值;實驗方法4.如果20例參考個體中不超過1例（5％的結果）的檢測值在參考區(qū)間外，則已知的參考區(qū)間可以接受。若2例以上超出