實(shí)驗(yàn)13 經(jīng)典免疫技術(shù)課件

實(shí)驗(yàn)十三經(jīng)典免疫技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、掌握直接凝集反應(yīng)的原理和操作方法

2、熟悉免疫標(biāo)記技術(shù)的原理和操作方法一、凝集反應(yīng)為一種血清學(xué)反應(yīng)。顆粒性抗原（完整的病原微生物或紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電介質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間，出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊。參與凝集反應(yīng)的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩類。（一）實(shí)驗(yàn)原理2、間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大小的顆粒狀載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用。在有電介質(zhì)存在的適宜條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)。用做載體的微球可用天然的微粒性物質(zhì)，如人（O型）和動物（綿羊、家兔等）的紅細(xì)胞、活性炭顆粒或硅酸鋁顆粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯膠乳微球等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，當(dāng)顆粒上的抗原與微量抗體結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，敏感性比直接凝集反應(yīng)高得多。YYY+（二）材料

標(biāo)準(zhǔn)抗A、抗B診斷血清；受測者紅細(xì)胞、鹽水、采血針、棉球、玻片等。待測細(xì)菌純培養(yǎng)物，標(biāo)準(zhǔn)診斷血清（三）方法（細(xì)菌菌型測定）1.取一塊清潔載玻片，用記號筆劃上記號，在一側(cè)滴加標(biāo)準(zhǔn)的診斷血清一滴,另一側(cè)滴加一滴生理鹽水。2.用接種環(huán)無菌操作取適量的待測細(xì)菌,分別與標(biāo)準(zhǔn)診斷血清和生理鹽水混均。3.靜置室溫下數(shù)分鐘后，在白色背景下肉眼觀察，也可顯微鏡觀察。注意事項(xiàng)：（1）生理鹽水、診斷血清要適量；（2）待檢菌為腸道致病菌，注意無菌操作，玻片用后放入消毒缸內(nèi)；（3）用接種環(huán)取待檢菌時，不要挑取瓊脂；待檢菌與生理鹽水、診斷血清混勻時，不要涂得太寬，否則影響結(jié)果觀察。（四）結(jié)果判斷（三）操作步驟1.制板：將溶化的1.5%瓊脂3.5-4ml倒在載玻片上，使之能將表面覆蓋，制成厚度約2～3mm厚的瓊脂糖凝膠板。2.打孔:待冷卻后根據(jù)所需形狀打孔,孔徑為4mm?？组g距離為4mm-5mm;瓊脂玻板的制備十字型打孔圖。3.加樣:用微量加樣器取Ag10uL加入中央孔;將抗體進(jìn)行倍比稀釋,稀釋度分別為原液,1:2;1:4;每個稀釋度取10uL加入外圍抗體孔中。4.擴(kuò)散:置濕盒37℃,24小時觀察結(jié)果每孔加入抗原/抗體10μl注意事項(xiàng)

（1）打孔時，不要將瓊脂劃破；（2）加樣時，不要溢出孔外；（3）加樣用的吸管不要混用。Ag01/11/21/41/81/16AbAbAbAbAb（四）結(jié)果記錄三、膠體金標(biāo)記技術(shù)用膠體金顆粒標(biāo)記已知抗體或抗原，檢測標(biāo)本中未知抗原或抗體的技術(shù)。（一）原理以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標(biāo)記物的顯色（>20nm的膠體金顆粒呈磚紅色）達(dá)到檢測目的。根據(jù)檢測裝置的不同，可分為膠體金斑點(diǎn)滲濾試驗(yàn)和膠體金斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)。膠體金斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)將各種反應(yīng)試劑(抗體)附著在硝酸纖維素膜條上，檢測時將待檢標(biāo)本加在膜條的一端，使膜條上的膠體金標(biāo)記抗體溶解后，與標(biāo)本中的待測物質(zhì)反應(yīng)形成IC，并通過毛細(xì)管作用在膜條上滲濾、移行，再與膜上另一種抗體反應(yīng)，再后被截留、聚集在膜條的一定區(qū)域，形成有顏色的反應(yīng)條帶。臨床上常用的有膠體金早孕診斷試劑條用鼠抗α-HCG（人絨毛膜促性腺激素）單克隆抗體和兔抗鼠1gG多克隆抗體分別固相硝酸纖維膜和膠體金標(biāo)記的抗β-HCG單克隆抗體及其他試劑制成，應(yīng)用層析式雙抗體夾心法的原理檢測尿液中HCG，用于妊娠早期輔助診斷。（二）材料待檢尿液、早早孕試驗(yàn)條（三）方法將早早孕試驗(yàn)棒的吸水區(qū)浸入待檢尿液中3~5秒，勿超過“max”線取出試驗(yàn)條放置于干燥、不吸水的平面上，置4~5秒后觀察結(jié)果陽性陰性無效HCG(+)HCG(-)結(jié)論:（四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果(3種可能)（五）結(jié)果分析人絨毛膜促性腺激素（HCG）是受孕婦女體內(nèi)產(chǎn)生的一種糖蛋白類激素，在受孕婦女血液和尿液中大量存在。卵子受精后第6天開始分泌HCG