植物組織培養(yǎng)復(fù)習(xí)

緒論第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的一般概念植物細胞組織培養(yǎng)的概念（P1）植物細胞組織培養(yǎng)（PlantCellandTissueCulture）：是指在離體（invitro）條件下利用人工培養(yǎng)基（medium）對植物器官、組織、細胞、原生質(zhì)體等進行培養(yǎng)，使其長成完整的植株。通過無菌操作分離植物體的一部分（外植體explant），接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下（包括營養(yǎng)、激素、溫度、光照、濕度）進行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程。主要有:原生質(zhì)體（Protoplast）培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)組織（愈傷組織Callus、莖尖分生組織）培養(yǎng)器官（胚，花藥，子房，根和莖）培養(yǎng)其中最常見的是愈傷組織培養(yǎng)。植物細胞組織培養(yǎng)范疇：（廣義）又叫離體培養(yǎng)：指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞、原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。（狹義）組織培養(yǎng)：指用植物各部分組織，如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。愈傷組織（callus）：原指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團薄壁細胞，在組培中則指在離體培養(yǎng)過程中形成的具有分生能力的一團不規(guī)則細胞，多在植物體切面上產(chǎn)生。外植體（explant）：在植物細胞組織培養(yǎng)中，由活體（invivo）植物體上取下來的，接種在培養(yǎng)基上無菌細胞、組織器官等用于離體培養(yǎng)的材料。植物組織培養(yǎng)的分類1、培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)2、組織培養(yǎng)按培養(yǎng)對象可分為（外植體）植株培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)A植株培養(yǎng)(plantculture)：對完整植株材料的培養(yǎng)。扦插苗培養(yǎng)、種子苗培養(yǎng)B器官培養(yǎng)(organculture)：即離體器官的培養(yǎng)。根據(jù)作用和需要的不同，可以包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體的培養(yǎng)。根系培養(yǎng)、莖段培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、花器培養(yǎng)、果實培養(yǎng)、種子培養(yǎng)C組織或愈傷組織培養(yǎng)(tissue，callusculture)：是對植物體的各部分組織進行培養(yǎng)，如莖尖分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁組織等等；或?qū)τ芍参锲鞴倥囵B(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進行培養(yǎng)，二者均通過再分化誘導(dǎo)形成植株。分生組織培養(yǎng)、薄壁組織培養(yǎng)、輸導(dǎo)組織培養(yǎng)D細胞培養(yǎng)(cellculture)：是對由愈傷組織等進行液體振蕩培養(yǎng)所得到的能保持較好分散性的離體單細胞或花粉單細胞或很小的細胞團的培養(yǎng)?？醋o培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微室培養(yǎng)E原生質(zhì)體培養(yǎng)(proplastculture)：是用酶及物理方法除去細胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。非融合培養(yǎng)、融合培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)的生理依據(jù)細胞全能性(celltotipotency)：植物體的每一個細胞都攜帶有一套完整的基因組，并具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。植物細胞的再生性：指在植物中很多是靠種子生長來產(chǎn)生完整的植株，但也有不少可通過根、莖、葉等器官再生而成為完整的植株的特性。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對于植物細胞組織的分化和決定具有關(guān)鍵性作用。它包括：生長素類、細胞分裂素類、赤霉素、脫落酸、乙烯等。生長素類主要用于愈傷組織的形成，體細胞胚的產(chǎn)生及試管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用強弱為2,4-D>NAA>IBA>IAA。細胞分裂素類則有促進細胞的分裂與分化，延遲組織的衰老，促進芽的產(chǎn)生等作用。常用的有Zip(異戊烯腺嘌呤)、KT、6-BA、ZT等作用強弱順序為。Zip>KT>6-BA>ZT。赤霉素則有促進已分化的芽伸長生長，打破種子休眠的作用。常用的為GA3。植物組織培養(yǎng)的原理植物細胞全能性（Cellulartotipotency）：任何具有完整細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植珠所必須的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。細胞全能性證實？1958年，Steward和Shantz用胡蘿卜根韌皮部細胞做懸浮培養(yǎng)，形成的體細胞胚誘導(dǎo)得到完整小植株，證實了全能性。1.分化（differentiation）：細胞在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而在個體發(fā)育中形成各類組織和器官完成整個生活周期。2.脫分化(dedifferentiation)：在細胞組織培養(yǎng)中，一個成熟細胞或分化細胞轉(zhuǎn)變恢復(fù)分生能力成為分生狀態(tài)的過程，即形成愈傷組織的過程。3.再分化(redifferentiation)：植物的成熟細胞經(jīng)歷了脫分化后，即形成愈傷組織能再形成完整的植株，這一過程叫做脫分化。4.植物組織培養(yǎng)一般過程：初代培養(yǎng)→繼代培養(yǎng)→生根培養(yǎng)→馴化移栽A初代培養(yǎng)：芽、莖段、葉片、花、器官等外植體在離體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織、側(cè)芽或不定芽、胚狀體過程B繼代培養(yǎng)：更換新鮮培養(yǎng)基來繁殖同種類型的材料（愈傷組織、芽）。C生根培養(yǎng)：將芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)成為完整植株的過程。D馴化移栽：組培苗經(jīng)人工煉苗后移栽到馴化苗床上使之適應(yīng)露地或保護地條件的過程。第二節(jié)植物細胞組織培養(yǎng)發(fā)展簡史組織培養(yǎng)技術(shù)的蓬勃發(fā)展只是近50年的事，但它的整個歷史可以追溯至19世紀末和上世紀初。植物組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)開始于19世紀后半葉，當(dāng)時植物細胞全能性的概念還沒有完全確定，但基于對自然狀態(tài)下某些植物可以通過無性繁殖產(chǎn)生后代的觀察，人們便產(chǎn)生了這樣一種想法即能否將植物體的一部分在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)成一個完整的植物體，為此許多植物科學(xué)工作者開始了培養(yǎng)植物組織的嘗試。19世紀30年代，德國植物學(xué)家施萊登(M.J.Schleiden，1804—1881)和德國動物學(xué)家施旺(T.Schwann,1810—1882)創(chuàng)立了細胞學(xué)說：①細胞是有機體，一切動植物都是由單細胞發(fā)育而來，即生物是由細胞和細胞的產(chǎn)物所組成；

②所有細胞在結(jié)構(gòu)和組成上基本相似；

③新細胞是由已存在的細胞分裂而來；

④生物的疾病是因為其細胞機能失常。根據(jù)這一學(xué)說，如果給細胞提供和生物體內(nèi)一樣的條件，每個細胞都應(yīng)該能夠獨立生活。這對組織培養(yǎng)技術(shù)的誕生起到了極大的推動作用。植物組織培養(yǎng)發(fā)展簡史可劃分為三個階段：探索階段、奠基階段、迅速發(fā)展階段探索階段（上世紀初至上世紀30年代中）1902年德國著名的植物生理學(xué)家和植物學(xué)家哈伯蘭特（Haberlandt）在Schleiden和Schwann的細胞學(xué)說的推動下，提出了高等植物細胞全能性理論。它是植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)，對植物組織培養(yǎng)的發(fā)展起了先導(dǎo)作用。植物細胞全能性的理論：即植物的體細胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植株的潛在能力。1904年，Hanning培養(yǎng)蘿卜和辣根菜的胚成功；1912年，Haberlandt的學(xué)生科特（Kotte）和美國的羅布林（Robins）在根尖培養(yǎng)中獲得了組織培養(yǎng)的成功。Kotte采用了無機鹽、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各種氨基酸的培養(yǎng)基。Robins用含無機鹽、葡萄糖或果糖的瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)了長度為1.45-3.75cm的豌豆、玉米和棉花的莖尖，形成了一些缺綠的莖和根。Laibach（1925,1929）亞麻種間雜種胚培養(yǎng)成功，證明胚培養(yǎng)在植物遠緣雜交上可利用；奠基階段（30年代中至50年代末）1934年美國的懷特（White）由番茄根建立了第一個活躍生長的無性繁殖系，并反復(fù)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，使根的離體培養(yǎng)實驗獲得了真正的成功，并在以后28年間培養(yǎng)了1600代。之后，White又以小麥根尖為材料，研究了光、溫度、通氣、pH值、培養(yǎng)基組成等各種培養(yǎng)條件對生長的影響，并于1937年建立了第一個組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，其成分均為已知化合物，包括3種B族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，該培養(yǎng)基后來被定名為White培養(yǎng)基。與此同時，高特里特（Gautheret）(1934)在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養(yǎng)實驗中，提出了B族維生素和生長素對組織培養(yǎng)的重要意義，并于1939年連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織，諾比考特（Nobecourt）由胡蘿卜均建立了與上述類似的連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物。因此，Gautheret，White和Nobecourt一起被譽為組織培養(yǎng)學(xué)科的奠基人。我們現(xiàn)在所用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，基本上都是由這三位科學(xué)家建立的。他們?nèi)说呢暙I在于：一是認識了B族維生素對植物生長的重要意義；二是發(fā)現(xiàn)了生長素是一種天然的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。后來，White于1943年發(fā)表了《植物組織培養(yǎng)手冊》專著，使植物組織培養(yǎng)開始成為一門新興的學(xué)科。40年代斯庫克（Skoog）和崔澂在煙草莖切段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷可以解除培養(yǎng)基中生長素(IAA)對芽形成的抑制作用，而能誘導(dǎo)形成芽，從而明確了腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。即細胞分裂素與生長素比例高時，產(chǎn)生芽；這一比例低時，則形成根；相等則不分化，形成愈傷組織。（器官分化的植物激素控制理論）50年代開始以后，組織培養(yǎng)研究日趨繁榮，10年當(dāng)中引人注目的進展主要有7項：1952年，莫雷爾（Morel）和馬丁（Martin）通過莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，從已受病毒侵染的大麗花中首次獲得無病毒植株；1953-1954年繆爾（Muir）把單細胞放在一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養(yǎng)，使細胞發(fā)生了分裂，即實施了看護接種技術(shù)，使單細胞培養(yǎng)獲得初步成功。1955年米勒（Miller）等人發(fā)現(xiàn)了激動素（kinetin）。不久即知道激動素可以代替腺嘌呤促進發(fā)芽，并且效果可增加3萬倍。1957年，Skoog和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；上述控制器官分化的激素模式變?yōu)榧铀嘏c生長素的比例關(guān)系。這方面的成功發(fā)現(xiàn)，有力地推動了植物組織培養(yǎng)的發(fā)展。1958年，美國植物學(xué)家斯圖爾德（Steward）等人，用胡蘿卜根韌皮部的細胞進行培養(yǎng)，得到了完整植株，并且這一植株能夠開花結(jié)實，首次證實了Haberlandt在五十多年前關(guān)于細胞全能性的預(yù)言；1958年，Wickson和Thimann指出，應(yīng)用外源細胞分裂素CTK可促成在頂芽存在的情況下打破腋芽的休眠；后來，Murashige利用這一方法發(fā)展了快繁技術(shù)，廣泛的應(yīng)用于植物的快速繁殖。綜上所述，在這一發(fā)展階段中，通過對培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分的廣泛研究，特別是對B族維生素、生長素和細胞分裂素在組織培養(yǎng)中作用的研究，已經(jīng)實現(xiàn)了對離體細胞生長和分化的控制，從而初步確立了組織培養(yǎng)的技術(shù)體系，為以后的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。迅速發(fā)展階段1960年，科金（Cocking）——開創(chuàng)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交研究工作。（用真菌纖維素酶從番茄幼根分離得到活性原生質(zhì)體）；同年，Kanta——植物試管受精首次成功。1960年，Morel——提出了一個莖尖離體無性繁殖蘭花的方法——迅速建立起蘭花工業(yè)；1962年，Murashige和Skoog發(fā)表了促進煙草組織快速生長的培養(yǎng)基組成——MS培養(yǎng)基；1964年印度固哈（Guha）和馬海舒瓦瑞（Maheshwari）成功地在毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)中，由花粉誘導(dǎo)得到單倍體植株，從而促進了花藥和花粉培養(yǎng)的研究；以后相繼在煙草、水稻、小麥、玉米、番茄、辣椒、草莓、蘋果等多種植物培養(yǎng)中獲得成功，其數(shù)目達到160多種，其中煙草、水稻和小麥等的花藥育種培養(yǎng)在中國取得了引入注目的成就。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株，這不僅在理論上證明了無壁的原生質(zhì)體同樣具有全能性，而且在實踐上為外源基因的導(dǎo)入提供了理想的受體材料。80年代中期以來，對禾谷類作物的原生質(zhì)體培養(yǎng)也相繼告捷，在這方面中國學(xué)者做出了重要貢獻。1973年Carlson等通過兩個煙草物種之間原生質(zhì)體融合，獲得了第一個體細胞雜種，Cocking等倡導(dǎo)的原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交，研究得到了迅速發(fā)展，已經(jīng)能使矮牽牛和煙草屬的雜種細胞增殖分化生成雜種植株。概括起來，這一階段的成就體現(xiàn)在：（1）微繁技術(shù)廣泛應(yīng)用（2）花藥培養(yǎng)取得顯著成績（3）原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破（4）基礎(chǔ)研究在整個植物組織培養(yǎng)發(fā)展的歷史中，我國學(xué)者做出多方面的貢獻，除了前述的崔徵的研究成效以外，還有1993年李繼侗和沈同研究銀杏的胚培養(yǎng)，將銀杏胚乳的提取物加入培養(yǎng)基，獲得成功；1993年李繼侗等關(guān)于玉米等植物離體根尖培養(yǎng)的研究工作，以及羅士韋關(guān)于幼胚和莖尖培養(yǎng)，李正理關(guān)于離體胚的研究培養(yǎng)、王伏雄等關(guān)于幼胚的研究培養(yǎng)工作。第三節(jié)植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用植物組織培養(yǎng)成為生物科學(xué)的一個廣闊領(lǐng)域，除了在基礎(chǔ)理論的研究上占有重要地位以外，還在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也得到越來越廣泛的應(yīng)用。一、農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用1.

快速繁殖種苗(rapidpropagation)用組織培養(yǎng)的方法進行快速繁殖是生產(chǎn)上最有潛力的應(yīng)用，包括花卉觀賞植物、蔬菜、果樹、大田作物及其他經(jīng)濟作物?？旆奔夹g(shù)不受季節(jié)等條件的限制，生長周期短，而且能使不能或很難繁殖的植物進行增殖。微（快）繁步驟（micropropagation）母株（完整）→外植體（母株的一小部分，種子亦可）→接種到培養(yǎng)基上→長芽（繼代增殖）→長根（試管外生根亦可）→練苗，馴化→完整植株快速繁殖可用下列手段進行：（1）通過莖尖、莖段、鱗莖盤等產(chǎn)生大量腋芽；（2）通過根、葉等器官直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽；（3）通過愈傷組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。試管快速繁殖應(yīng)用在下列生產(chǎn)或研究中：(1)繁殖雜交育種中得到的少量雜交種，以及保存自交系、不育系等。(2)繁殖脫毒培養(yǎng)得到的少量無病毒苗。(3)繁殖生產(chǎn)上急需的或種源較少的種苗。由于組織培養(yǎng)周期短，增殖率高及能全年生產(chǎn)等特點，加上培養(yǎng)材料和試管苗的小型化，這就可使有限的空間培養(yǎng)出大量的植物，在短期內(nèi)培養(yǎng)出大量的幼苗。無病毒苗(virusfree)的培養(yǎng)植物在生長過程中幾乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的種類甚至同時受到數(shù)種病毒病的危害，尤其是很多園藝植物靠無性方法來增殖，若蒙受病毒病，代代相傳，越染越重，甚至?xí)斐蓸O嚴重的后果。自從Morell952年發(fā)現(xiàn)采用微莖尖培養(yǎng)方法可得到無病毒苗后，微莖尖培養(yǎng)就成為解決病毒病危害的重要途徑之一。若再與熱處理相結(jié)合，則可提高脫毒培養(yǎng)的效果。對于木本植物，莖尖培養(yǎng)得到的植株難以發(fā)根生長，則可采用莖尖微體嫁接的方法來培育無病毒苗。組織培養(yǎng)無病毒苗的方法已在很多作物的常規(guī)生產(chǎn)上得到應(yīng)用。如馬鈴薯，甘薯，草莓，蘋果，香石竹，菊花等。而且已有不少地區(qū)建立了無病毒苗的生產(chǎn)中心，這對于無病毒苗的培養(yǎng)、鑒定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一個規(guī)范的系統(tǒng)程序，從而達到了保持園藝植物的優(yōu)良種性和經(jīng)濟性狀的目的。

在育種上的應(yīng)用(breeding)植物組織培養(yǎng)技術(shù)為育種提供了許多手段和方法，使育種工作在新的條件下更有效的進行。（1）倍性育種，縮短育種年限，雜種優(yōu)勢明顯。（2）克服遠緣雜交的不親合性和不孕性（胚培養(yǎng)）（3）保存種質(zhì)例如：用花藥培養(yǎng)單倍體植株；用原生質(zhì)體進行個體細胞雜交和基因轉(zhuǎn)移；用子房、胚和胚珠完成胚的試管發(fā)育和試管受精，以及種質(zhì)資源的保存等等。工廠化育苗(industrializingpropagation)近年來，組織培養(yǎng)育苗工廠化生產(chǎn)已作為一種新興技術(shù)和生產(chǎn)手段，在園藝植物的生產(chǎn)領(lǐng)域蓬勃發(fā)展。（1）工廠化育苗含義：是指以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)，將外植體接種在人工配制的培養(yǎng)基上，通過控制環(huán)境條件，使細胞脫分化、再分化成新的組織、器官，進而培育出與母株一樣的批量幼苗的方法。例如：非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)育苗的工廠化生產(chǎn)。（2）特點：繁殖快，整齊、一致，無病蟲害，周期短，周年生產(chǎn)，性狀穩(wěn)定。（3）作用：有利于繁殖系數(shù)低、雜合材料的快速繁殖；有利于有性繁殖優(yōu)良性狀易分離材料的繁殖；有利于保持從雜合的遺傳群體中篩選出的表現(xiàn)型優(yōu)異植株的優(yōu)良遺傳性；組織培養(yǎng)育苗的無毒化生產(chǎn)，還可減少病害傳播；可以減少氣候條件對幼苗繁殖的影響，緩和淡、旺季的供需矛盾。（4）現(xiàn)狀：世界上一些先進國家園藝植物組織培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展從60年代就已經(jīng)開始，并隨著生長、分化規(guī)律性探索的逐步深化，到了70年代僅花卉業(yè)就已在蘭花、百合、非洲菊、大巖桐、菊花、香石竹、矮牽牛等二十幾種花卉幼苗生產(chǎn)上建立起大規(guī)模試管苗商品化生產(chǎn)。到1984年世界花卉幼苗產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)總值已達20億美元，其中美國花卉幼苗市場總值為6億多美元，日本三友種苗公司有60％的幼苗靠組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖。1985年僅蘭花一項，在美國注冊的公司就有100余家，年銷售額在1億美元以上。我國采用快速繁殖技術(shù)，也使優(yōu)良品種達到迅速的推廣和應(yīng)用。如廣東切花菊"黃秀風(fēng)"的應(yīng)用，使菊花變大，長勢加強，花色鮮艷，抗病力增強，打開了進入香港市場的渠道，使30多種觀葉植物的推廣很快遍及全國，豐富了人們的生活，并將自然界的幾百個野生金錢蓮品種繁種馴化，培養(yǎng)了一批園林垂直綠化的材料，促進了園林業(yè)的發(fā)展。（5）制約：植物組織培養(yǎng)也存在一定的困難。首先是繁殖效率與商品需要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解決，因而無法滿足生產(chǎn)的需要。其次是在培養(yǎng)過程中如何減少變異株的發(fā)生。更重要的是應(yīng)降低組培苗工廠化生產(chǎn)的成本，只有降低成本，才能更好的投產(chǎn)應(yīng)用?？傊S著組織培養(yǎng)這一技術(shù)的發(fā)展及各種培養(yǎng)方法的廣泛應(yīng)用，使這一技術(shù)在遺傳育種、品種繁育等方面表現(xiàn)出了巨大的潛力，特別是生物工程和工廠化育苗實施以后，它將以新興產(chǎn)業(yè)的面目在技術(shù)革命中發(fā)揮重大作用。在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、組織學(xué)、胚胎學(xué)、基因工程、生物工程等方面的應(yīng)用要揭開生命活動的秘密，需要多科學(xué)、多技術(shù)的相互配合，其中植物組織培養(yǎng)技術(shù)是不可缺少的，它為遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物工程等提供了一種有效、快速的方法。因為要揭示生命的奧秘，首先要研究單個基因的作用，研究它在細胞內(nèi)是如何組裝的，如何與其它基因發(fā)生聯(lián)系，如何表達和調(diào)控等。分離單個基因，對它DNA進行測序，再對其中的某些堿基實行突變，然后還需要將基因送到受體細胞當(dāng)中，看表達情況，以確定其功能。接受基因的受體細胞要產(chǎn)生再生植株，就需要通過組織培養(yǎng)的方法才能實現(xiàn)。利用組織培養(yǎng)的材料作為植物生物反應(yīng)器中國的中草藥是一份人類寶貴的財富，但很多種中草藥資源匱乏，產(chǎn)量不足，甚至瀕于滅絕。如果能利用組織和細胞培養(yǎng)的方法在實驗室內(nèi)生產(chǎn)，不再依附于自然環(huán)境，不僅可以解決現(xiàn)有困難，而且可以通過篩選高產(chǎn)有效成分的細胞系，來提高其藥用價值。比如用培養(yǎng)的人參懸浮細胞，來生產(chǎn)人參皂苷，已在日本等國家形成規(guī)模。利用培養(yǎng)的植物細胞和組織細胞作為生物反應(yīng)器，也可以生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜生產(chǎn)乙肝疫苗正在實驗中。本章小結(jié)植物組織培養(yǎng)是指在離體（invitro）條件下利用人工培養(yǎng)基（medium）對植物器官、組織、細胞、原生質(zhì)體等進行培養(yǎng)，使其長成完整的植株。按照外植體的不同，組織培養(yǎng)可分為植株培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)5種類型。組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要體現(xiàn)于以下幾個方面：快速繁殖優(yōu)良苗木；獲得脫毒苗；育種上應(yīng)用；工廠化育苗。復(fù)習(xí)思考題(1)什么是廣義的植物組織培養(yǎng)?什么是狹義的植物組織培養(yǎng)?(2)什么是"外植體"?(3)按照外植體的不同，植物組織培養(yǎng)可以分成幾類?比較常用的是哪些?(4)你認為植物組織培養(yǎng)技術(shù)在當(dāng)前的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有什么價值?為什么?第2章愈傷組織培養(yǎng)本章主要內(nèi)容：愈傷組織的誘導(dǎo)與分化愈傷組織的繼代培養(yǎng)愈傷組織的形態(tài)發(fā)生不定芽和根的發(fā)生體細胞胚的發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用本章教學(xué)目的與要求：1、了解愈傷組織細胞分化的各時期的特點2、掌握植物激素控制理論3、掌握愈傷組織的形態(tài)發(fā)生4、區(qū)別胚狀體發(fā)生途徑與器官發(fā)生途徑形成植株5、愈傷組織培養(yǎng)在園藝植物育種中的應(yīng)用愈傷組織培養(yǎng)(callusculture)：是指將外植體接種到人工培養(yǎng)基上，在激素作用下，進行愈傷組織誘導(dǎo)、生長和分化的培養(yǎng)過程。第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化一．愈傷組織的誘導(dǎo)誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵主要是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。二．愈傷組織的分化從外植體脫分化形成典型的愈傷組織大致可分為三個時期：誘導(dǎo)期、分裂期、分化期。Stage1.Induction（誘導(dǎo)期）：細胞準備進行分裂的時期，是愈傷組織形成起點。誘導(dǎo)期細胞內(nèi)發(fā)生的變化：氣體交換增加，如氧氣的吸收增加RNA含量增加（增加到300%）蛋白質(zhì)量增加（每個細胞的總增加量為200%）酶活性增強Stage2.Celldivision（分裂期）：指外植體細胞經(jīng)誘導(dǎo)脫分化，不斷分裂、增生子細胞的過程。分裂期細胞的主要表現(xiàn)：1.細胞的數(shù)目迅速增加。2.每個細胞平均鮮重下降。3.細胞體積小，內(nèi)無液泡。4．細胞的核和核仁增大到最大。5.細胞中RNA含量減少，而DNA含量保持不變。6.隨著細胞不斷分裂和生長，細胞總干重、蛋白質(zhì)和核酸量大大增加，新細胞壁合成極快。分裂期愈傷組織的共同特征：細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。Stage3.Differentiation（分化期）：指愈傷組織細胞停止分裂，細胞內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)和生理上的變化,形成一些不同形態(tài)和功能的細胞的時期。分化期細胞特點：A細胞分裂部位和方向發(fā)生改變。B形成瘤狀或片狀的分生組織結(jié)節(jié)?；蚓S管組織結(jié)節(jié)。C細胞的體積相對穩(wěn)定，不再減少。D出現(xiàn)了各種類型的細胞：如管胞、纖維細胞、薄壁細胞、分生細胞、色素細胞等。E生長旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色。根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為：生根的愈傷、滲出粘性多糖的愈傷、易碎第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)1、繼代培養(yǎng)定義：培養(yǎng)物在培養(yǎng)基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過程。2、愈傷組織培養(yǎng)的調(diào)控因素：外植體、培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基（一）材料本身外植體：遺傳型、年齡、器官和部位（二）培養(yǎng)基1．無機營養(yǎng)培養(yǎng)基中的N，大多數(shù)都用硝態(tài)氮，對細胞分化起重要作用。2．植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)一般使用的濃度為0.1-10mg／L。使用植物生長調(diào)節(jié)劑時，要注意種類和濃度，特別是生長素和細胞分裂素的比值。器官分化的植物激素控制理論(激素配比模式)生長素與細胞分裂素的比值是根和芽形成的控制條件，決定著發(fā)育的方向：是愈傷組織、長根還是長芽?！?，利于根的形成生長素/細胞分裂素→適中，利于愈傷組織的形成→低，利于芽的形成3．有機成分（1）培養(yǎng)基中加入糖、各類B族維生素、肌醇和甘氨酸等，可滿足愈傷組織生長和分化的要求。（2）各種氨基酸和嘌呤、嘧啶類物質(zhì)，可促進器官分化。（3）水解酪蛋白中含有多種氨基酸，助于器官分化。（4）酰胺類往往有促進器官形成的作用。4.培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（三）培養(yǎng)條件光照：光強、光照時間、光質(zhì)溫度：24-28℃第三節(jié)愈傷組織的形態(tài)發(fā)生形態(tài)建成：外植體細胞在適宜的培養(yǎng)條件下發(fā)生脫分化、再分化，產(chǎn)生芽和根，或者形成胚狀體，發(fā)育成苗或完整植株。愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式：不定芽方式、胚狀體方式愈傷組織類型及特征結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立胚性愈傷組織：具有產(chǎn)生胚狀體能力。一、不定芽方式（adventitiousbud）愈傷組織的器官發(fā)生順序有四種情況：（1）愈傷組織僅有根或芽器官的分別形成，即無根的芽或無芽的根；（2）先長芽，后長根，多數(shù)情況；（3）先長根，再從根的基部長芽。這種情況較難誘導(dǎo)芽的形成，尤其對于單子葉植物；（4）先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起來形成一株植株。小麥的形態(tài)發(fā)生：愈傷組織→芽分化→試管苗二、胚狀體方式（somaticembryo）胚狀體（embryoid）：指在組織培養(yǎng)中，由一個非合子細胞(體細胞)，經(jīng)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程（經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚5個時期），形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。注意：體細胞胚1、不同于合子胚2、不同于孤雌/雄胚3、不同于器官發(fā)生方式形成的幼苗胚狀體與合子胚的比較：合子胚：萌發(fā)率高，質(zhì)量好；來源于受精卵；有明顯胚柄；形態(tài)固定，體積相對較小；變異率低。胚狀體：萌發(fā)率低，質(zhì)量差；來源于體細胞；即使有胚柄也不明顯；形態(tài)復(fù)雜，常有兩個以上的子葉，體積較大；變異率高。由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株的過程：→愈傷組織外植體脫分化↓→胚狀體→再生植株胚狀體發(fā)生途徑與器官發(fā)生途徑形成植株的區(qū)別:①胚狀體具有兩極性，即有莖端和根端。②胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系。③胚狀體維管組織的分布是獨立的“Y”字形。胚狀體方式比不定芽方式有更多的優(yōu)點：胚狀體產(chǎn)生的數(shù)量比不定芽多；胚狀體可以制成人工種子，便于運輸和保存；胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。第四節(jié)愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用1、加快了園藝植物新品種和良種繁育速度；2、培育無病毒苗木；3、獲得倍性不同的植株；4、克服遠緣雜交困難；5、利于種質(zhì)資源長期保存和遠距離運輸；6、提供育種中間材料；7、誘發(fā)和離體篩選突變體；8、制造人工種子。本章小結(jié)：1、愈傷組織培養(yǎng)含義。2、愈傷組織形成分三個時期：誘導(dǎo)期、分裂期、分化期。3、誘導(dǎo)期、分裂期、分化期細胞的特點。4、分裂期愈傷組織的特征：細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。5、繼代培養(yǎng)的含義。6、培養(yǎng)方式分為固體和液體培養(yǎng)兩大類。7、形態(tài)建成含義。8、器官發(fā)生形成小苗的方式。9、胚狀體發(fā)生途徑與器官發(fā)生途徑形成植株的區(qū)別。第3章器官培養(yǎng)本章主要內(nèi)容根的培養(yǎng)莖尖的培養(yǎng)葉的培養(yǎng)本章教學(xué)目的與要求(1)一般掌握離體根培養(yǎng)的取材部位和培養(yǎng)基的選擇；(2)掌握莖尖培養(yǎng)的種類和操作步驟；(3)掌握莖段培養(yǎng)中材料的選擇、處理及培養(yǎng)基的調(diào)整；(4)掌握離體葉片的培養(yǎng)步驟；(5)一般掌握胚胎培養(yǎng)的類型與各自的注意事項。器官培養(yǎng)：指植物某一器官的全部或部分或器官原基的離體培養(yǎng)，包括根、莖、葉、花、果實、種子等。培養(yǎng)目的：研究器官的功能、分化、形態(tài)建成；快速繁殖；獲得脫毒苗；種質(zhì)保藏等。第一節(jié)根的培養(yǎng)根培養(yǎng)的意義:（1)是進行根系生理研究的最優(yōu)良實驗體系;（2)是研究器官分化、形態(tài)建成的良好體系；（3）可建立快速生長的根無性系。一、離體根的培養(yǎng)方法：1、培養(yǎng)無菌苗2、切取1.0cm的根尖3、接種在White培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)4、一周后，取側(cè)根擴大培養(yǎng)，可得到離體根的無性系（培養(yǎng)條件為暗光和25-27℃）植株再生根段的離體培養(yǎng)也可以用來再生植株。第一步誘導(dǎo)形成愈傷組織。第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的分化、在愈傷組織上分化成小植株。二、培養(yǎng)基：無機離子較低的White培養(yǎng)基或者2/3或1/2的MS、B5培養(yǎng)基三、影響離體根生長的因素：基因型培養(yǎng)基生長物質(zhì)PH環(huán)境條件第二節(jié)莖尖的培養(yǎng)一、含義及意義1、類型莖尖分生組織培養(yǎng)：對長度0.1mm左右，含1-2個葉原基的莖尖進行培養(yǎng)，目的是獲得無病毒植株。普通莖尖培養(yǎng)：對幾毫米至幾十毫米長的莖尖、芽尖及側(cè)芽的培養(yǎng)，目的是快速繁殖。2、莖尖培養(yǎng)的意義：無性系快速繁殖；培養(yǎng)無病毒苗，品種改良；理論基礎(chǔ)研究。二、莖尖培養(yǎng)的一般方法1、莖尖培養(yǎng)步驟取材挑選雜菌污染少，生長不久的莖尖。木本植物可在取材前對莖尖噴幾次滅菌藥劑。以保證材料不帶或少帶菌。用于普通莖尖培養(yǎng)，可先從植物的莖、藤或匍匐枝上切取2cra以上的頂梢。消毒接種將采集到的莖尖切成0.5-1.0cm長，并將其大葉除去，休眠芽預(yù)先剝除鱗片。將莖尖置于流水沖洗2-4h，再在95％的酒精中處理30s，然后在稀釋20倍的次氯酸鈉中浸5-8min，最后用無菌水沖洗數(shù)次，準備接種。接種為了減少污染，可在接種前再剝掉一些葉片，使莖尖為0．5cm左右大小。這樣取莖尖大小只能作為快速繁殖。有些植物的莖尖由于多酚氧化酶的氧化作用而變褐。所以在接種時，不能用生銹的解剖刀，動作要敏捷，隨切隨接，減少傷口在空氣中暴露的時間，也可配制1％-5％Vc液，將切下的莖尖材料浸入處理一下。2、一般方法(一)制備外植體

取1-2cm的枝條頂梢，去小葉---消毒---解剖鏡下用解剖刀除去幼葉和葉原基，露出生長點，切下0.1-0.2mm長的莖尖(含1-2個葉原基)。(二)培養(yǎng)基多數(shù)采用MS，培養(yǎng)基中生長素是必須的，如2,4-D，IAA，NAA等，但濃度不能太高，一般用0．1mg／L左右，高于此濃度，往往產(chǎn)生畸變芽或形成愈傷組織，不同植物對生長素的反應(yīng)是不同的。(三)培養(yǎng)方法1、固體培養(yǎng)法：試管培養(yǎng)2、紙橋培養(yǎng)法：用酒杯狀的濾紙代替瓊脂，使杯底朝上塞入試管中，與液體培養(yǎng)基接觸，將離體莖尖置于濾紙上方進行培養(yǎng)。優(yōu)點：培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，營養(yǎng)物質(zhì)能通過濾紙均衡而持久地供給外植體，有利于外植體的健康成長。缺點：操作工藝復(fù)雜。三、莖尖分生組織培養(yǎng)與脫毒四、普通莖尖培養(yǎng)與繁殖技術(shù)快速繁殖(微繁殖)：用組織培養(yǎng)的方法，使植物的部分器官、組織迅速擴大培養(yǎng)，并移植到溫室或農(nóng)田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。特點：繁殖速度快；使用材料少，生產(chǎn)效率高，省時省工；節(jié)約空間有利于植物的工廠化生產(chǎn)；在無菌條件下進行，不受病蟲害侵害。（一）莖尖微繁技術(shù)的過程：分5個階段1、無菌培養(yǎng)體系的建立外植體的制備、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。芽的增殖頂芽和腋芽的發(fā)育頂芽、側(cè)芽生長，形成一個微型的小灌木叢狀的叢生苗結(jié)構(gòu)。叢生苗的每個枝條轉(zhuǎn)接繼代，可迅速獲得多數(shù)的嫩莖。這種繁殖方式稱作微型扦插或無菌短枝扦插。優(yōu)點：不經(jīng)愈傷組織，所以最能使無性系后代保持原品種的特性。（2）不定芽的發(fā)育不定芽產(chǎn)生的途徑：外植體上直接產(chǎn)生、由外植體誘導(dǎo)的愈傷組織上產(chǎn)生。中間繁殖體的增殖中間繁殖體：由第二階段芽的增殖產(chǎn)生的數(shù)量有限的芽、苗、原球莖。將之轉(zhuǎn)接到新鮮的相同培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，3-4周轉(zhuǎn)接一次，擴大培養(yǎng)。莖的培養(yǎng)發(fā)育方向：腋芽萌發(fā)脫分化后產(chǎn)生胚狀體（原球莖）脫分化后直接產(chǎn)生不定器官脫分化后形成愈傷組織誘導(dǎo)生根壯苗目的：使增殖的嫩枝生根產(chǎn)生小植株，以便移栽。試管苗生根的措施：用White、1/2或1/3MS、B5等生根培養(yǎng)基；降低N，P，K鹽的量；適當(dāng)加大生長素（如NAA），不用或少用細胞分裂素，或在無激素的培養(yǎng)基上生根；蔗糖降低到1.0-1.5%，以增強植株自養(yǎng)能力；加入1%左右的活性炭；增加光強度，以提高小植株的光合能力。5、試管苗的移植生根培養(yǎng)1個月左右。移植時可根據(jù)生根情況來進行。若發(fā)現(xiàn)新梢基部生有較濃密的不定根，長度在lcm以內(nèi)，就可移栽人土。移栽時通過幾天的煉苗過程，栽入塑料營養(yǎng)缽或育苗盤中，營養(yǎng)缽盛經(jīng)燒烤或常壓滅菌的培養(yǎng)土(1分腐殖土：1分沙)。栽后給予較高的空氣濕度條件。培養(yǎng)土要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭小拱棚，以減少水分的蒸騰，并且初期要常噴霧處理，保持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)小苗有生長趨勢，可逐漸減少濕度，將拱棚兩端打開通風(fēng)，并且減少噴水次數(shù)。使小苗適應(yīng)濕度較小的條件。以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，少澆水或不澆水，促進小苗長得粗壯。溫度管理上要掌握適宜的生根溫度，最適宜的溫度是16-20℃。光照管理上初期可用較弱的光照，在小拱棚上加蓋遮陽網(wǎng)或報紙等，以防陽光灼傷小苗和增加蒸騰作用，后期可直接利用自然光照。可用育苗盤進行馴化生根、孔徑選擇2cm左右即可。孔穴裝入蛭石：珍珠巖：草炭土為1：1：0．5的基質(zhì)。當(dāng)小苗長至5cm高左右再移人塑料營養(yǎng)缽中。(二)影響莖尖培養(yǎng)微繁殖的因素基因型；外植體的大小；供試植株的生理狀態(tài)；芽在植株上的部位；供試植株的年齡；培養(yǎng)基；褐變；玻璃化（三）莖段的培養(yǎng)莖段培養(yǎng)：指不帶芽和帶1個以上定芽或不定芽的，包括塊莖、球莖在內(nèi)的幼莖切段的無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)莖段的主要目的是快繁。優(yōu)點：培養(yǎng)技術(shù)簡單易行，繁殖速度較快；芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無病，性狀均一；解決不能用種子繁殖的無性繁殖植物的快速繁殖問題等。莖段培養(yǎng)過程：健康植株上選健壯的枝梢→去葉片用水沖洗莖段→75%酒精1分鐘→0.1%升汞→1%次氯酸鈉→培養(yǎng)→植株再生(1)材料的選擇和處理取生長健壯無病蟲的幼嫩枝條或鱗莖盤，若是木本，取當(dāng)年生嫩枝或一年生枝條，剪去葉片，剪成3-4cm的小段。取材時注意莖的基部比頂部切段，側(cè)芽比頂芽的成活率低，所以應(yīng)優(yōu)先利用頂部的外植體，但由于每個新梢僅一個頂芽，也可利用腋芽，莖上部的腋芽培養(yǎng)效果較好。還應(yīng)注意盡量在生長期取芽，在休眠期取外植體，成活率降低。如蘋果在3-6月取材的成活率為60％，7-11月下降到10％，12-2月都下降10％以下。(2)培養(yǎng)最常用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，加入3％蔗糖，用0．7％的瓊脂固化。培養(yǎng)條件保持25℃左右。經(jīng)培養(yǎng)后莖段的切口特別是基部切口上會長出愈傷組織，呈現(xiàn)稍許增大，而芽開始生長，有時會出現(xiàn)叢生芽，從而得到無菌苗。在莖段培養(yǎng)中，促進腋芽增殖用6-BA是最為有效的，依次為Kt和Zt等。生長素雖不能促進腋芽增殖，但可改善苗的生長。GA對芽伸長有促進作用。繼代兩種途徑：一是促進腋芽的快速生長，二是誘導(dǎo)形成大量不定芽。第一種途徑的好處是不會產(chǎn)生變異，能保持品種優(yōu)良特性。且方法簡便，可在各種植物上使用，每年從一個芽可增殖10萬株以上。第二種途徑會產(chǎn)生變異。繼代增殖過程注意選用培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑。（4）生根降低或除去細胞分裂素而加人生長素。由于在苗增殖時施用了較高濃度的細胞分裂素，并促使苗中保持著一定的量，因此，在生根培養(yǎng)中不需要加細胞分裂素。生長素的濃度，NAA一般0．1-1．0mg／L，IBA和IAA可稍高。MS，B5White等培養(yǎng)基，都可用于誘導(dǎo)生根，但是其含鹽濃度要適當(dāng)加以稀釋。前面的幾種培養(yǎng)基中，除White外，都富含N，P，K鹽，它們都抑制根的發(fā)生。因此，應(yīng)將它們降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平。生根培養(yǎng)時增強光照有利于發(fā)根，且對成功地移栽到盆缽中有良好作用。故在生根培養(yǎng)時應(yīng)增加光照時間和光照強度，但強光直接照射根部，含抑制根的生長，所以在生根培養(yǎng)時最好在培養(yǎng)基中加0．3％活性炭，以促進生根。(5)移植在馴化時要進行煉苗。然后洗凈瓊脂，小心移栽，初期濕度要大，基質(zhì)通氣濕潤，保濕保溫，更要精心管理等。第三節(jié)葉的培養(yǎng)一、定義葉培養(yǎng)：離體葉的培養(yǎng)是指包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉等葉組織的無菌培養(yǎng)。葉培養(yǎng)的意義：1、是研究葉形態(tài)建成、光合作用、葉綠素形成的好方法；2、通過葉組織的脫分化與再分化以證實葉細胞的全能性；3、通過葉組織培養(yǎng)，探索離體葉組織培養(yǎng)的條件和影響因素；4、建立體細胞快速無性繁殖體系；5、葉細胞培養(yǎng)物經(jīng)誘變篩選突變體。二、葉組織培養(yǎng)的方法1、制備外植體：幼嫩葉片---水洗---消毒---無菌水洗。2、影響培養(yǎng)因素：（1）6-BA和KT利于芽的形成；2,4-D利于愈傷組織形成。（2）極性：葉片腹面向上放置利于芽的分化。（3）損傷：常從葉柄、葉脈的切口處形成愈傷組織和芽。三、離體葉組織中再生植株發(fā)生途徑1、直接產(chǎn)生不定芽2、離體葉→愈傷組織→不定芽3、離體葉→愈傷組織→胚狀體→不定芽→愈傷組織→4、離體葉→小鱗莖或球狀體本章小結(jié)：(1)植物器官培養(yǎng)的含義。(2)離體根培養(yǎng)的方法、培養(yǎng)基、影響離體根生長的因素。(3)莖尖培養(yǎng)的含義；莖尖培養(yǎng)包括普通莖尖培養(yǎng)和莖尖分生組織培養(yǎng)。(4)紙橋培養(yǎng)的含義。(5)莖尖微繁一般的過程。(6)離體葉組織脫分化和再分化中，莖和芽分化主的4個途徑。(7)試管苗誘導(dǎo)生根方法。第4章胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)：是指將植物的胚胎與母體分離，培養(yǎng)在人工的培養(yǎng)基上形成幼苗的過程，包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)以及子房培養(yǎng)。本章內(nèi)容胚培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)胚珠和子房培養(yǎng)1904年的Haning最早成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣椒的胚，并萌發(fā)形成小苗；30年代成功地把蘭科植物的胚培養(yǎng)成小植株；40年代在蘋果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、馬鈴薯、甘藍與大白菜的種間雜種的胚胎培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)及子房與胚珠培養(yǎng)均取得了不同程度的進展。本章教學(xué)目的與要求(1)掌握胚培養(yǎng)和胚乳培養(yǎng)的操作步驟；(2)了解胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的操作步驟。胚胎培養(yǎng)的意義：①克服遠緣雜種的不育性，②使胚胎發(fā)育不完全的植株獲得后代(蘭天麻)；③縮短育種年限，提高育種效率。第一節(jié)胚培養(yǎng)胚培養(yǎng)：采用人工的方法將胚從種子、子房或胚珠中分離出來，再放在無菌的條件下，讓其進一步生長發(fā)育，以至形成幼苗的過程。一、培養(yǎng)類型1、幼胚培養(yǎng)幼胚：是指子葉期以前的幼小胚。遠緣雜交育種現(xiàn)在可使心形期胚或更早期的長度僅0.1～0.2mm的胚生長發(fā)育成植株。由于胚越小就越難培養(yǎng)，所以，盡可能采用較大的胚進行胚養(yǎng)。現(xiàn)在幼胚培養(yǎng)成功的有大麥、薺萊、甘蔗、甜菜、胡蘿卜等。2、成熟胚培養(yǎng)成熟胚：一般指子葉期后至發(fā)育完全的胚,培養(yǎng)較易成功。將成熟或未成熟種子用70％酒精進行幾秒鐘的表面消毒，再用無菌水沖洗3-4次，然后在無菌條件下進行解剖，取出胚并接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)。二、培養(yǎng)過程：1、幼胚培養(yǎng)過程：取子房→常規(guī)表面消毒→解剖鏡下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚→固體培養(yǎng)幼胚的發(fā)育方式：胚性發(fā)育；早熟發(fā)育；產(chǎn)生愈傷組織。2、成熟胚培養(yǎng)過程---以玉米成熟胚培養(yǎng)為例（1）玉米種子消毒；（2）在黑暗條件下，將種子放在無菌濕潤的含濾紙的培養(yǎng)皿中培育6hr；（3）將吸漲的種子在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)將胚分離出來；（4）無菌水沖洗3次；（5）在MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)；（6）觀察：2d出現(xiàn)胚根，3-4d出現(xiàn)胚芽，10d長成幼苗。三、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件1、培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基有Tukey，MS，B5，Nitsch培養(yǎng)基，其中前者適于成熟胚培養(yǎng)，其他適于未成熟胚和幼胚培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：糖類：幼胚需求較多附加成分：椰乳光照：光照可以促進某些植物胚的轉(zhuǎn)綠，利于胚芽生長，而黑暗則利于胚根生長。因此以光暗交替培養(yǎng)較為有利。培養(yǎng)方式：幼胚培養(yǎng)適于液體培養(yǎng)，成熟胚適于固體培養(yǎng)。四、胚培養(yǎng)的應(yīng)用1)在遠緣雜交育種中：克服雜種胚不能正常發(fā)育2)克服珠心胚的干擾，提高育種效率3)縮短育種周期4)測定休眠種子的萌發(fā)率5)理論研究中的應(yīng)用第二節(jié)胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)：是指將胚乳從母體上分離出來，在無菌的環(huán)境條件下培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼苗的過程。一、胚乳培養(yǎng)過程胚乳外植體制備：種子消毒→取出胚乳培養(yǎng)：White或MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基→25~27℃→暗或弱光發(fā)育：誘導(dǎo)形成愈傷組織→再分化形成胚狀體或不定芽→生根培養(yǎng)→植株胚乳培養(yǎng)過程：胚乳→愈傷組織→形態(tài)發(fā)生→胚狀體發(fā)育成苗或不定芽苗胚乳植株染色體數(shù)目的檢查取根尖、幼葉或愈傷組織→0.2%-0.5%秋水仙素堿溶液在25℃浸泡4-8hr→流水沖洗5-10min→卡諾氏液或FAA液固定→1mol/L鹽酸，60℃水浴8-10min→染色、壓片、鏡檢、計數(shù)二、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件可用MS、White等，加入2，4-D或NAA0.5～2.0mg/L，BA0.1～1.0mg／L。在25～27℃和黑暗條件或散射光下培養(yǎng)，約6～l0d胚乳開始膨大，再培養(yǎng)形成愈傷組織．這時應(yīng)轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基可加入0.5～3.0mg／L的BA及少量的NAA。待愈傷組織長出芽后，切下不定芽，插人生根培養(yǎng)基中，光下培養(yǎng)10～15d，切口處可長出白色的不定根。三、胚乳再生植株的染色體倍數(shù)穩(wěn)定型：三倍體畸變型：除少數(shù)是三倍體，多數(shù)是由多種倍性細胞組成的嵌合體四、胚乳培養(yǎng)的應(yīng)用1、胚乳培養(yǎng)可得到三倍體植株，產(chǎn)生無籽果實?；蚣颖缎纬闪扼w植株進行育種。2、胚乳培養(yǎng)可得到倍性不同的愈傷組織，可分離和篩選各種類型的非整倍體植株。第三節(jié)胚珠和子房培養(yǎng)一、胚珠培養(yǎng)胚珠培養(yǎng)：是指將胚珠從母體上分離出來，在無菌的人工環(huán)境條件下培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼苗的過程。胚珠培養(yǎng)類型：1、受精胚珠的培養(yǎng)2、未受精胚珠的培養(yǎng)（一）、胚珠培養(yǎng)的基本過程：（二）、培養(yǎng)基：White,Nitsch,MS（三）、胚珠的發(fā)育：A受精胚珠：一是形成種子；二是形成愈傷組織。B未受精胚珠：形成單倍體植株。二、子房培養(yǎng)子房培養(yǎng)：子房培養(yǎng)是指將子房從母體上分離出來，在無菌的人工環(huán)境條件下培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼苗的過程。類型：授粉子房的培養(yǎng)；未授粉子房的培養(yǎng)。（一）子房培養(yǎng)的培養(yǎng)過程1、制備外植體：在開花前后適宜時期取子房或幼花，消毒2、子房培養(yǎng)：固體或液體培養(yǎng)均可（二）培養(yǎng)基：N6,MS（三）培養(yǎng)子房的發(fā)育：性細胞（卵細胞、助細胞、極核、反足細胞）→胚狀體或愈傷組織→單倍體植株；體細胞（珠被、子房壁）→胚狀體或愈傷組織→二倍體植株。三、胚珠和子房培養(yǎng)的應(yīng)用（一）胚珠培養(yǎng)的應(yīng)用1、受精胚珠培養(yǎng)目的：打破種子的休眠；挽救胚的發(fā)育，以獲得雜交種。2、未受精胚珠培養(yǎng)目的：獲得單倍體植株。（二）子房培養(yǎng)的應(yīng)用1、授粉子房培養(yǎng)目的：挽救雜種胚。2、未授粉子房培養(yǎng)目的：獲得單倍體植株。本章小結(jié)：(1)胚胎培養(yǎng)包括：幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)和胚乳培養(yǎng)等。(2)胚胎培養(yǎng)的意義。(3)離體胚培養(yǎng)方法：成熟胚和幼胚培養(yǎng)。(4)未成熟胚培養(yǎng)，三種不同的生長方式，胚性發(fā)育；早熟萌發(fā)；形成愈傷組織。(5)胚培養(yǎng)的作用。(6)檢查胚珠植株的染色體數(shù)目的方法。(7)分析胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的發(fā)育途徑。第5章花藥和花粉培養(yǎng)本章主要內(nèi)容：花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)花粉和花藥培養(yǎng)應(yīng)用本章教學(xué)目的與要求(1)掌握花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的區(qū)別；(2)了解花藥最佳接種時期；(3)掌握花藥培養(yǎng)的大致過程；(4)掌握花粉發(fā)育的四種途徑；(5)掌握花粉培養(yǎng)的大致過程?；ǚ酆突ㄋ幍呐囵B(yǎng)(pollenandantherculture)：是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機能，不經(jīng)受精而發(fā)生細胞分裂，由單個花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。單倍體植物(haplobiont)：用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個完整的植株。第一節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥培養(yǎng)：是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進而分化成植株的技術(shù)?；ǚ叟囵B(yǎng)：是將花粉從花藥中分離出來進行離體培養(yǎng)的過程。一、花藥和花粉的培養(yǎng)方法（一）花粉發(fā)育時期1、適宜時期：單核期,尤其是單核中、晚期(單核靠邊期)花粉粒形態(tài)：花粉粒即雄配子體。2、花粉發(fā)育時期的檢測：外部形態(tài)觀察：在水稻中，一般葉枕距為5-15cm，穎片淡黃綠色、雄蕊長度接近穎片長度的1/2時，可能為單核靠邊期的花粉。壓片染色法：是檢測花粉發(fā)育時期的簡便有效方法，常用染色劑為醋酸洋紅。（二）培養(yǎng)過程1、花藥培養(yǎng)過程1）預(yù)處理：低溫冷藏是最常用的方法在冰箱4-5℃下保持3-4d2）表面消毒3）接種4）培養(yǎng)形成花粉植株花粉→愈傷組織→苗花粉→胚狀體→苗水稻花藥培養(yǎng)過程：旗葉鞘用70％酒精擦洗一遍→剝?nèi)テ烊~鞘，取出稻穗→10％漂白粉10min→無菌水洗3次→左手持穗，右手用鑷子取花藥，放無菌培養(yǎng)皿中→用接種環(huán)接種到培養(yǎng)基上→培養(yǎng)5天，花藥變褐，20天后花藥裂開，長出淡黃色的花粉愈傷組織，先長芽，后長根，形成幼苗花藥培養(yǎng)脫毒1974年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；花藥采取時期單核期：花蕾4-6mm，花藥1mm花藥誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基：MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L增殖分化培養(yǎng)基：MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+瓊脂7g/L2、花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)成苗途徑與花藥培養(yǎng)比較相同點：胚狀體成苗途徑、愈傷組織再分化成苗途徑。不同點：花粉培養(yǎng)需進行花粉的分離，特殊的花粉誘導(dǎo)培養(yǎng)。花粉培養(yǎng)過程：取花蕾（鏡檢）→消毒→取花藥→預(yù)培養(yǎng)數(shù)天→分離花粉→接種→培養(yǎng)→愈傷組織發(fā)生二、培養(yǎng)基（一）基本培養(yǎng)基：MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；B5培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)；N6培養(yǎng)基：適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。（二）激素種類和濃度細胞分裂素可促進胚狀體形成；生長素可誘導(dǎo)愈傷組織形成；細胞分裂素與生長素比值高時可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗。（三）蔗糖濃度較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織；較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。三、單倍體植株染色體加倍的方法單倍體植物天然發(fā)生的途徑：孤雌生殖；無配子生殖；孤雄生殖單倍體植株染色體加倍的方法1、自然加倍2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、處理愈傷組織和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹單倍體植株的頂芽、腋芽，可得到能結(jié)實的二倍體植株3、愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，可得到二倍體植株第二節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用（單倍體植株育種）1、誘導(dǎo)形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；2、有利于篩選隱性突變體，提高選擇效率;3、有利于隱性基因控制性狀的選擇；4、快速獲得自交系的超雄株。本章小結(jié)：(1)花藥培養(yǎng)是器官培養(yǎng)，花粉培養(yǎng)屬細胞培養(yǎng)。(2)花藥培養(yǎng)一般選擇花粉的單核期進行接種。(3)花藥培養(yǎng)包括：選擇材料-消毒-接種培養(yǎng)-愈合組織生成-分化出單倍體植株。(4)花粉的發(fā)育途徑包括：營養(yǎng)細胞發(fā)育、生殖細胞發(fā)育、營養(yǎng)和生殖細胞同時發(fā)育及花粉均等分裂發(fā)育。(5)花粉培養(yǎng)包括花粉的分離-預(yù)處理-培養(yǎng)過程。(6)胚胎培養(yǎng)包括：幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)和胚乳培養(yǎng)等。(7)胚胎的培養(yǎng)的意義。第二章細胞組織培養(yǎng)的基本技術(shù)本章教學(xué)目的與要求(1)掌握組織培養(yǎng)實驗室的設(shè)計；(2)掌握組織培養(yǎng)常用的實驗儀器設(shè)備及其使用方法；(3)掌握調(diào)控組織培養(yǎng)的主要環(huán)境條件。(5)掌握滅菌的不同方法和具體操作過程；(6)掌握無菌接種的步驟；(7)掌握外植體的培養(yǎng)方法和步驟；(8)一般掌握外植體褐變和玻璃化的處理方法；(9)掌握試管苗馴化的基本程序；本章主要內(nèi)容商業(yè)性組織培養(yǎng)實驗室和小工廠的設(shè)計與主要設(shè)備培養(yǎng)基及其配制外植體的選擇與培養(yǎng)試管苗的馴化與移載第一節(jié)商業(yè)性組織培養(yǎng)實驗室和小工廠的設(shè)計與主要設(shè)備培養(yǎng)皿的清洗；培養(yǎng)基的配制、分裝和高壓滅菌；無菌操作——材料的表面滅菌和接種；將培養(yǎng)物放到培養(yǎng)室培養(yǎng)；試管苗的馴化、移栽和初期管理。一、設(shè)計組成：準備室、緩沖室、馴化室、溫室、無菌操作室、培養(yǎng)室(一)、洗滌室(cleaningroom)洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、干燥和貯存。室內(nèi)配備：大型水槽，最好是白瓷水槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪墊橡膠。上下水道要暢通。備有塑料筐，用于運輸培養(yǎng)器皿。備有干燥架，用于放置干燥涮凈的培養(yǎng)器皿。(二)、準備室(repairingroom)完成培養(yǎng)基制備以及試管苗出瓶、清洗與整理工作。準備室要求明亮、通風(fēng)。如果房間較多，可將準備室分為洗滌室和配置室兩部分。洗滌室專門負責(zé)試管苗出瓶與培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室則負責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。(三)、緩沖室進入無菌室前要在緩沖室里換上經(jīng)過滅菌的衛(wèi)生服、拖鞋，戴上口罩。應(yīng)當(dāng)在此室內(nèi)安裝滅菌用的紫外燈?？刂茻o菌室及培養(yǎng)室的配電板等。(四)、無菌操作室(transferingroom)接種室是進行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個重要操作室。其無菌條件的好壞對組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。配置：在工作方便的前提下，接種室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時的空氣擾動。接種室要求干爽安靜，清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝1-2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。(五)、培養(yǎng)室(culturingroom)培養(yǎng)室是將接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。設(shè)計原則：充分利用空間和節(jié)省能源；高度比培養(yǎng)架略高為宜；周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培養(yǎng)架大多由金屬制成。規(guī)格：一般設(shè)5層，最低一層離地高約10cm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架即高1.7m左右。培養(yǎng)架長度都是根據(jù)日光燈的長度而設(shè)計，如采用40W日光燈，則長1.3m，30W的長1m，寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在20-27℃左右，具備產(chǎn)熱裝置，并安裝窗式或立式空調(diào)機。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70％-80％為好，可安裝加濕器?？刂迫展庹諘r間可安裝定時開關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h也有的需要連續(xù)照明。現(xiàn)代組培實驗室大多設(shè)計為采用天然太陽光照作為主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長良好，馴化易成活。(六)、馴化室馴化室要求清潔無菌，配有空調(diào)機、加濕器、恒溫恒濕控制儀、噴霧器、光照調(diào)節(jié)裝置、通風(fēng)口以及必要的殺菌劑。、溫室應(yīng)配有空調(diào)機、通風(fēng)口、加濕器、恒溫恒濕控制裝置、噴霧裝置、光照調(diào)節(jié)裝置以及必要的殺菌殺蟲裝置及相應(yīng)藥劑。二、儀器設(shè)備和器皿用具（一）常見儀器設(shè)備超凈臺優(yōu)點是操作方便自如，比較舒適，工作效率高，準備時間短。開機10分鐘即可操作，可進行長時間使用。在工廠化生產(chǎn)中，接種工作量很大，需要經(jīng)常長久地工作時，超凈臺是很理想的設(shè)備。無菌箱在投資少的情況下，可以用接種箱來代替超凈臺。接種箱依靠密閉、藥劑熏蒸和紫外燈照射來保證內(nèi)部空間無菌。但操作活動受限制，準備時間長，工作效率低。工作原理：超凈臺功率在145-260W左右，它裝有小型鼓風(fēng)機，使空氣穿過一個前置過濾器，在這里把大部分空氣塵埃先過濾掉，然后再使空氣穿過一個細致的高效過濾器，它除去了大于0．3um的塵埃、細菌和真菌孢子等，最后以較潔凈的氣流吹到工作臺面。超凈空氣的流速為每分鐘24-30m，這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈對器械等的灼燒消毒。在這樣的無菌條件下操作，就可以保證無菌材料在轉(zhuǎn)移接種過程中不受污染。根據(jù)風(fēng)幕形成的方式，超凈臺可分為水平式和垂直式二種型號。3、空調(diào)機4、除濕機5、恒溫箱6、烘箱7、高壓滅菌鍋8、冰箱9、電子分析天平和托盤天平10、顯微鏡及解剖鏡11、水浴鍋12、搖床與轉(zhuǎn)床13、磁力攪拌器14、電蒸餾水器15、酸度計16、離心機（二）各類玻璃器皿1、培養(yǎng)器皿培養(yǎng)器皿：在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和進行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。要求由堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制成，以保證長期貯存藥品及培養(yǎng)的效果；培養(yǎng)用的還要求透光度好，能耐高壓高溫，能方便放入培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿，根據(jù)培養(yǎng)的目的和要求，可以采用不同種類、規(guī)格的玻璃器皿。其中以試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等使用較多。最常使用的是：三角瓶培養(yǎng)皿（9、12cm直徑）用于：游離細胞、原生質(zhì)體、花粉等的靜置培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、無菌種子的發(fā)芽、植物材料的分離等都需采用。試管（18mmXl80mm或20mmX200mm）用于：培養(yǎng)較高的試管苗。工廠化生產(chǎn)可采用廣口的200ml罐頭瓶，加蓋半透明的塑料蓋，由于瓶口大，所以大量繁殖時操作方便、工作效率高，也減少了培養(yǎng)材料的損傷。但缺點是易引起污染。2、分注器3、離心管4、刻度移液管5、細菌過濾器用于除去不能采用濕熱滅菌法的液體中的細菌。一般采用0.22um微孔濾膜進行抽濾滅菌。包括濾頭，注射器或采用抽濾裝置：真空泵、吸濾瓶、濾氣玻璃管等。6、實驗器皿在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實驗用的玻璃器皿，包括：100ml、250ml、500ml、1000ml燒杯；l0ml、l00ml、1000ml量筒；l00ml、1000ml試劑瓶(棕色)等等。瓶口封塞瓶口封塞可用多種方法，要具有一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。以前封口常用棉塞。但這種封口辦法夏季極易污染，且不易保持培養(yǎng)基的濕度?，F(xiàn)在多采用聚丙烯塑料薄膜作為封口，以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙。這樣經(jīng)濟方便，且通氣好。也可采用專用的封口膜。、器械用具（P13）1．鑷子類：尖頭和槍形2．剪刀類3．解剖刀4．解剖針5、接種工具：接種針、接種鉤及接種鏟（由白金絲或鎳絲制成）6、鉆孔器7、其它：酒精燈，電爐，試管架，搪瓷盤等第二節(jié)培養(yǎng)基及其配置目的要求：(1)一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點；(2)掌握基本培養(yǎng)基的配方；(3)一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量；(4)掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟；(5)熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法；(6)一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法。一、培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基的種類按成分分類:MS,B5,White,NT,KM-8P,N6等。按狀態(tài)：液體，固體。固體培養(yǎng)基的特點（與液體培養(yǎng)基相比）優(yōu)點：操作簡便，通氣問題易解決，便于觀察研究缺點：培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸（即吸收）面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分充分利用，同時培養(yǎng)物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。2、培養(yǎng)基配制（1）MS培養(yǎng)基（MurashigeandSkoogMedium）植物組織培養(yǎng)中常用的一種培養(yǎng)基。離子濃度較高，硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基高。器官，花藥，細胞，原生質(zhì)體培養(yǎng)。（2）B5培養(yǎng)基（B5Medium）銨含量較低木本植物，十字花科植物（3）White培養(yǎng)基（WhiteMedium）無機鹽含量低生根培養(yǎng)（4）NT培養(yǎng)基（NTMedium）1970煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)（5）KM-8培養(yǎng)基（KM-8Medium）1974有機成分復(fù)雜，包括所有單糖和維生素，呼吸代謝主要有機酸原生質(zhì)體和融合體培養(yǎng)（6）N6培養(yǎng)基（N6Medium）1974，朱至清等。成分簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高小麥，水稻及其他植物花藥培養(yǎng)和組織培養(yǎng)3、培養(yǎng)基的成分（1）水培養(yǎng)基的主要組分，水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒，是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止儲藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。無機營養(yǎng)組分作用：滿足植物對各礦質(zhì)元素的需求。大量元素，6種微量元素，7種非必須元素，6種鐵采用螯合鐵，F(xiàn)eSO4加EDTA有機營養(yǎng)成分碳源：蔗糖維生素類：硫胺素（B1），煙酸（B3），吡哆醇（B6），泛酸鈣（B5），肌醇。氨基酸：蛋白質(zhì)組成成分，促進細胞生長。其他有機附加物椰子汁，酵母提取物，馬鈴薯，水解酪蛋白等?？梢源龠M組織生長。椰子汁：椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在10%-20%。它在愈傷組織和細胞培養(yǎng)中有促進作用。馬鈴薯：去掉皮和芽后，加水煮30分鐘，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。對PH值緩沖作用大。添加后可得到健壯的植株。酵母提取物，香蕉，水解酪蛋白等。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)植物激素“五兄弟”：生長素﹑赤霉素﹑細胞分裂素﹑脫落酸﹑乙烯生長素（auxin）的發(fā)現(xiàn)向光性：在單側(cè)光的照射下，植物朝向光源方向生長的現(xiàn)象。1、19世紀末達爾文(C.R.Darwin)實驗實驗材料：胚芽鞘總結(jié)上述三個實驗，達爾文提出：胚芽鞘尖端受單側(cè)光刺激后,就向下面的伸長區(qū)傳遞影響，造成伸長區(qū)背光面比向光面生長快,因而使胚芽鞘出現(xiàn)向光彎曲。2.1910年詹森（B.Jensen）的實驗結(jié)論：胚芽鞘的尖端產(chǎn)生的某種刺激可以透過瓊脂片傳遞給下面一段。3.1914年拜爾（Paal）的實驗去尖端，把尖端放于胚芽鞘切面的左側(cè)，胚芽鞘向右側(cè)彎曲生長。去尖端，把尖端放于胚芽鞘切面的右側(cè)，胚芽鞘向左側(cè)彎曲生長。結(jié)論：胚芽鞘的彎曲生長，是因為尖端產(chǎn)生的影響在其下部分布不均勻造成的。4、1928年（F.W.Went）溫特的實驗結(jié)論：胚芽鞘的彎曲生長確實是一種化學(xué)物質(zhì)引起的，并命名為生長素。1934年從人尿分離出具有生長素效應(yīng)的物質(zhì)——吲哚乙酸。1942年從高等植物中分離出生長素，并確認是IAA。在植物體內(nèi)，具有促進植物生長的功能，除了吲哚乙酸（IAA）外，還有苯乙酸（PAA）和吲哚丁酸（IBA）。生長素生理作用的應(yīng)用頂端優(yōu)勢：植物的頂芽優(yōu)先生長，而側(cè)芽生長受抑制的現(xiàn)象。形成原因：頂芽產(chǎn)生的生長素向下運輸，大量地積累在側(cè)芽部位，側(cè)芽對生長素濃度又比較敏感，使側(cè)芽的生長受到抑制。植物向光性：在單側(cè)光線照射下，背光側(cè)>向光側(cè)，背光側(cè)細胞生長快，結(jié)果使莖朝向光源一側(cè)彎曲。根的向重力性（向地性）莖的背重力性（背地性）生長素類似物的應(yīng)用促進扦插的枝條生根用一定濃度的生長素類似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。促進果實發(fā)育（培育無籽果實）傳粉受精后，胚珠發(fā)育成種子的過程中產(chǎn)生大量生長素，促進子房發(fā)育成果實。如何培育無籽果實？在沒有接受花粉的雌蕊柱頭上涂上一定濃度的生長素類似物，使子房正常發(fā)育為果實，因為沒有受精，果實內(nèi)沒有種子。防止落花落果，疏花疏果農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用一定濃度的生長素類似物溶液噴灑棉株，可以達到保蕾保鈴的效果。（4）用作除草劑如(2，4-D)，適用于麥田、稻田，雙子葉植物比單子葉植物對生長素更敏感，用高濃度的除草劑能抑制雙子葉植物（雜草）的生長。生長素（auxin）吲哚乙酸（IAA，天然），奈乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4-D），吲哚丁酸（IBA），2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）。促進細胞分裂與根分化，2,4-D有強烈的愈傷組織誘導(dǎo)能力，但抑制器官分化。細胞分裂素（cytokinin）激動素（KT），6-芐基腺嘌呤（6-BA），玉米素（ZT），異戊烯氨基嘌呤（2IP）刺激細胞分裂，誘導(dǎo)芽的分化、葉片擴大和莖長高，抑制根的生長。細胞分裂素常與生長素相互配合，用以調(diào)節(jié)細胞分裂，細胞伸長，細胞分化和器官形成。主要作用；促進細胞分裂。細胞分裂素與生長素相互作用生長素與細胞分裂素的比例被稱為“激素杠桿”，決定著發(fā)育的方向。當(dāng)生長素含量高于細胞分裂素時，主要誘導(dǎo)植物組織脫分化和根原基的形成。當(dāng)細胞分裂素的效應(yīng)高于生長素時，主要誘導(dǎo)植物組織再分化和芽原基的形成。赤霉素（gibberelinacid）GA3，促進細胞生長，刺激不定胚發(fā)育成正常小植株。1926年，水稻感染了赤霉菌→植物瘋長→惡苗病。將赤霉菌培養(yǎng)基的濾液噴灑稻健康水稻幼苗上，不感染赤霉菌，卻有惡苗病的癥狀。1935年科學(xué)家從培養(yǎng)基濾液中分離出赤霉素（GA）。GA3誘導(dǎo)甘藍莖的伸長，產(chǎn)生超長莖。主要作用：促進細胞伸長；促進種子萌發(fā)；果實發(fā)育。合成部位：幼葉、幼芽、幼根、未成熟的種子乙烯（ethylene）對芽的誘導(dǎo)具有一定作用，促進果實著色和成熟。在生理環(huán)境的溫度和壓力下，是一種氣體，比空氣輕，實驗中很難掌握用量，所以一般不使用。培養(yǎng)的植物組織也會產(chǎn)生乙烯，如果封口用的是不透氣的塑料膜，容器內(nèi)就會逐漸積累乙烯，嚴重時可引起培養(yǎng)物的死亡。AgNO3可逆轉(zhuǎn)乙烯的抑制作用。乙烯在常溫下是氣體。作為生長調(diào)節(jié)劑用的是乙烯利。（5）附加組分活性炭吸附有害物質(zhì)；遮光作用：防止褐化和玻璃苗產(chǎn)生；促進根的生長副作用：瓊脂不易凝固；降低培養(yǎng)基PH；吸附植物激素替代物：墨汁滲壓劑保持培養(yǎng)基中的滲透壓常用滲壓劑蔗糖，聚乙二醇（PEG），山梨醇，甘露醇硝酸銀Ag＋與乙烯受體結(jié)合，抑制乙烯的作用促進愈傷組織的生長、器官與胚胎分化，減輕培養(yǎng)物玻璃化和衰老副作用：使再生植株畸形抗生素殺滅細菌和真菌，防止污染常用的有：青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、利福平、卡拉霉素一般不耐高溫，使用時單獨過濾滅菌副作用：對培養(yǎng)物生長有抑制作用；抗生素污染凝固劑制備固體培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物能夠處于表面，既能吸收必需的養(yǎng)分、水分，又可不致因缺氧而死亡。材料必須無毒害作用，且不被培養(yǎng)的植物組織所吸收，不與培養(yǎng)液成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。常用凝固劑：瓊脂，淀粉，濾紙等瓊脂：來源于石花菜等海藻。高溫下融化，溫度降低凝固。不會被植物和菌類吸收利用。常用濃度：0.7-1％質(zhì)量差的瓊脂要求的凝固濃度更高。4、培養(yǎng)基配制（1）母液的配制P33參考修改母液的定義優(yōu)點：減少操作步驟；增加稱量的準確性。MS培養(yǎng)基大量元素母液（10X）NH4NO3

16.5gKH2PO4

1.7gKNO3

19gCaCl2·2H2O

4.4gMgSO4·7H2O

3.7g

溶于1000mL水，放置4℃冰箱保存。常用10X或20X。配制大量元素母液時殘留不溶物各種化合物必須充分溶解后才能混合，混合時注意先后順序,要注意把鈣離子和硫酸根離子和磷酸氫根離子錯開。微量元素母液（1000X）KI

0.83gNa2MoO4·2H2O

0.25gH3BO3

6.2gCuSO4·5H2O

0.025gMnSO4·H2O

16.9g

CoCl2·6H2O

0.025gZnSO4·7H2O

8.6g配成1000mL母液，存放于冰箱中。鐵鹽母液200XNa·EDTA

7.46g

FeSO4·7H2O

5.56g配成1000mL母液，存放于冰箱中。剛配制的鐵鹽溶液放人冰箱后出現(xiàn)結(jié)晶，原因是鐵離子和EDTA沒有螯合徹底，室溫放置過夜后再移入冰箱中保存。有機元素母液（1000X）鹽酸硫胺素（VB1）

0.1g煙酸

0.5g

甘氨酸

2g鹽酸吡哆醇（VB6）

0.5g

配成1000mL母液，存放于冰箱中。肌醇母液10X肌醇

1g

配成1000mL母液，存放于冰箱中。常用10X或100X。植物激素母液各激素單獨配置，通常濃度為1mg·mL-1生長素類：少量NaOH溶解后，加水定容。細胞分裂素類：少量鹽酸或NaOH溶解后，加水定容。GA3：乙醇溶解?；蛏倭恳掖既芙夂蠹铀ㄈ荨＃?）培養(yǎng)基配制先在燒杯中放入一些蒸餾水；分別取各種母液；稱取蔗糖倒入，攪拌溶解；按設(shè)計好的方案添加各種激素；用精密試紙或酸度計調(diào)整PH；加蒸餾水用量筒定溶至1L；稱取5-10g左右瓊脂粉,倒入上面配好的溶液中，加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊；滅菌；滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實驗臺上令其冷卻凝固。PH值常用PH5.8檢測：試制或PH計高壓蒸汽滅菌會造成PH值下降0.2-0.5PH值過低，瓊脂培養(yǎng)基難以凝固；PH值過高，無極鹽沉淀。（3）培養(yǎng)基滅菌組織培養(yǎng)常見的滅菌方法消毒：是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。滅菌：是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體的表面和空隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有有生命的物質(zhì)全部殺死。常用的滅菌方法物理方法：干熱滅菌（烘烤或灼燒）濕熱滅菌（常壓或高壓蒸煮）射線處理（紫外線、超聲波、微波）過濾除菌大量無菌水沖洗化學(xué)方法：甲醛（福爾馬林）過氧化氫高錳酸鉀來蘇兒漂白粉次氯酸鈉升汞（氯化汞）酒精培養(yǎng)基的滅菌（濕熱滅菌法）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在108KPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及高度耐熱的芽胞。滅菌方法：打開鍋蓋，加水至水位線。把已裝好培養(yǎng)基的三角瓶，連同蒸餾水及接種用具等放人鍋筒內(nèi)，裝時不要過分傾斜培養(yǎng)基，以免弄到瓶口上或流出。然后蓋上鍋蓋，對角旋緊螺絲。接通電源加熱，當(dāng)升至0．05MPa時，打開放氣閥放氣，回“0‘，后關(guān)閉放氣閥。當(dāng)氣壓上升到0.10MPa時，保壓滅菌20min，到時停止加熱。當(dāng)氣壓回“0”后打開鍋蓋，取出培養(yǎng)基，放于平臺上冷凝。滅好的培養(yǎng)基不要放置時間太長，最多不能超過1周。過濾滅菌赤霉素、玉米素、脫落酸等是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。防細菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45微米(常用0.22微米)以下，當(dāng)溶液通過濾液后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻。抽濾裝置：包括濾器，接收瓶，泵，導(dǎo)管。針頭濾器：滅菌包裝，配合一次性注射器一次性使用?？臻g及物體表面滅菌紫外線滅菌熏蒸滅菌（熏蒸劑：甲醛及高錳酸鉀）污染真菌污染污染來源：培養(yǎng)基滅菌不徹底；細菌污染污染來源：操作不嚴格；外植體滅菌不徹底。固體培養(yǎng)基滅菌后，不能凝固，可能的原因是什么？PH值偏酸；活性炭添加較多；瓊脂條或瓊脂粉濃度不夠；瓊脂質(zhì)量差；反復(fù)滅菌。培養(yǎng)基滅菌后，出現(xiàn)沉淀，是什么原因？PH值偏堿。外植體的接種與培養(yǎng)胚狀體（embryoid）：離體培養(yǎng)條件