肌酐檢測標準化 徐國超課件

肌酐標準化及清除率探討腎臟疾病的現(xiàn)狀慢性腎臟病（CKD）在全球范圍的發(fā)病率和患病率呈迅速增長的趨勢,其主要與人們生活水平和生活方式改變相關(guān)的糖尿病、高血壓發(fā)病率上升有關(guān)。2002年美國腎臟病年報，在美國早期CKD患者有1900萬，其中估算腎小球濾過率eGFR<60ml/min者為800萬，eGFR>60ml/min，尿微量白蛋白排泄率正常（>30mg/gCr）有1100萬。美國1988到2006年的調(diào)查同樣顯示，替代治療和終末腎的發(fā)生率逐年增加。我國目前尚無大規(guī)模、權(quán)威性的調(diào)查報道，北京大學(xué)第一醫(yī)院王海燕教授牽頭進行的流行病學(xué)調(diào)查研究報告顯示，慢性腎病的發(fā)病率占普通人群的9.4%，據(jù)此推算我國慢性腎病的患者已經(jīng)超過一億人。GFR測定的金標準為菊粉、碘海群（iohexol）或核素標記的DTPA清除率。這些方法復(fù)雜，操作難度大，一般僅限于研究作為建立eGFR估算方程比較對象。血清CystatinC是近幾年被評價較多的反映GFR的指標，大量臨床實踐表明，血清CystatinC診斷GFR下降較血清肌酐的特異性和敏感度要高，與CCr相比較也稍有優(yōu)勢。其測定采用的是顆粒增強免疫比濁法，測定成本目前還較高。因為測定價格、適用于生化分析儀的高通量檢測方法剛剛問世不久以及主要基于CystatinC估算的GFR方程發(fā)表不長時間尚需進一步驗證等諸多因素，因此尚未見到有關(guān)以CystatinC為診斷指標的CKD患病率的流行病學(xué)研究的資料。血清肌酐（SCr）水平受到年齡性別、種族、肌肉量、飲食的影響，苦味酸動力學(xué)法測定方法還受黃疸、乳糜、溶血和某些藥物的干擾。但由于肌酐血清水平相對恒定，不被腎小管重吸收，排泌量較少，測定廉價，是臨床上應(yīng)用最為廣泛的評價GFR的試驗。肌酐清除率（Ccr）較Scr更靈敏/特異的反映GFR下降的指標，但必須準確留取4小時、8小時或24小時尿液，病人，特別是門診患者依從性差，也不適合于流行病調(diào)查。對于血清肌酐測定，大家已有共識：只有當(dāng)GFR下降50%時才開始升高。我們以99mTc-DTPA清除率測得的腎小球濾過率（GFR）作為診斷評價的金指標，用受試者工作特征曲線（ROC）觀察到肌酐最佳診斷界值為107μmol/L，與參考區(qū)間上限的99%分位值（男性110μmol/L，女性93μmol/L）接近，其診斷腎小球濾過功能受損的的靈敏度、特異性分別為74.6%、90%。如果診斷界值移到133μmol/L，靈敏度會提高，但靈敏度則下降到50%。建議以99%雙側(cè)作為血清肌酐的參考區(qū)間，但必須清楚診斷界點的診斷效能。

肌酸激酶（運動）肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP

脫水自動去P

肌酐

90%以上由腎小球濾過而從尿中排出，僅7—10%由腎小管分泌排出，但腎小管對肌酐不重吸收。肌酐的代謝:1．代謝：肌酐是由肌肉酸脫水而生成，肌酸在腎、肝、由精氨酸、甘氨酸合成，貯于肌肉、腦中，在肌肉收縮時，可進一步代謝生成肌酐。肌酐(Cr)和內(nèi)生肌酐清除率（CCr）測定

注意事項：

1.日內(nèi)生理變動幅度通常在10%以內(nèi)，但與個體肌肉量有關(guān)。肌肉發(fā)達者與消瘦者（尤其是肌肉萎縮者）肌酐的生理濃度可有明顯差異。

2.妊娠期內(nèi)因生理原因GFR可上升，但肌酐生成速度不變，Scr因血漿稀釋作用而比常人偏低，據(jù)調(diào)查多在35.2～52.8μmol/L水平。如孕婦Scr>70.4μmol/L應(yīng)視為有升高傾向。3.劇烈肌肉活動后血肌酐和尿肌酐都有一過性增加。4.進肉食對Scr和Ucr有一定影響。根據(jù)對健康人觀察，攝取烹飪?nèi)馐澈?-4小時內(nèi)Scr可增加34-44μmol/L，可超出正常值上限，約12小時后接近正常水平。

5.Jaffé（雅費氏）法主要缺點是特異性差，血中丙酮、丙酮酸、葉酸、抗壞血酸、葡萄糖、乙酰乙酸等都能在此反應(yīng)中呈色，因而被稱為“非肌酐色原”。此外，一些頭孢類藥物如甲氧噻吩頭孢菌素也可與苦味酸反應(yīng)顯色而引起正干擾。⑶肌酐測定。1)Jaffe反應(yīng)法：測定肌酐最常用的方法是尿、血清中的肌酐與苦味酸鹽作用，生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物。此法的缺點是特異性不高，維生素C、丙酮酸、丙酮、葡萄糖、乙酰醋酸、果糖、氨基馬尿酸、蛋白質(zhì)、胍基醋酸酰胺及許多化合物也能與堿性苦味酸鹽生成紅色。這些能起反應(yīng)的物質(zhì)稱為假肌酐，相當(dāng)數(shù)量的假肌酐存在于紅細胞中。2）酶聯(lián)法：

此法特異性高，標本不需去蛋白，特別適用于自動分析。但工具酶過多、價格昂貴。

三）內(nèi)生肌酐清除率（CCr）1.

定義：腎臟在單位時間內(nèi)將若干ml血液中的內(nèi)生肌酐全部清除出去。2.

方法：收集24小時尿并計尿量，試驗前應(yīng)給受試者無肌酐飲食（禁肉類、魚類）3天，并限蛋白入量（每日低于40g），避免劇烈運動，以排除外源性肌酐的干擾。留取24小時尿，其間保持適當(dāng)?shù)乃秩肓?，禁服咖啡、茶等利尿性物質(zhì)。準確計量全部尿量V（ml）。同時抽病人血約2-3ml。

3.

計算：

體表面積的計算：

logA(m2)＝0.425log[體重kg]＋0.725log[身高cm]－2.1441999年美國腎臟病基金會（NKF）公布的K-DOQI（KidneyDiseaseOutcomeQualityInitiative）指南提出了新的CKD定義，確定CKD的診斷應(yīng)基于腎小球濾過率（GFR）和/或腎損傷的證據(jù)。CKD的診斷標準為：（1）腎臟損傷（腎臟結(jié)構(gòu)或功能異現(xiàn)常）≥3個月，可以有或無GFR下降，可表現(xiàn)為以下任何一條①病理學(xué)檢查異常；②腎損傷的指標：包括血、尿成分異常或影像學(xué)檢查異常；（2）GFR＜60ml/min/1.73m2≥3個月，有或無腎臟損傷證據(jù)。根據(jù)腎小球濾過率，K-DOQI指南將CKD分為五期I期，GFR≥90，伴有其他慢性腎損傷證據(jù)；II期，GFR60～89伴有其他慢性腎損傷證據(jù)；III期，GFR30～59；IV期，中度異常；GFR15～29；V期，已確定有腎功能衰竭；GFR<15或正在接受透析。不同分期CKD患者的癥狀及各種合并癥的發(fā)生率不同分期對于臨床處治具有一定指導(dǎo)價值

研究表明，MDRD方程的開發(fā)對象是CKD患者，適用于評估西方CKD人群GFR，其準確性和方便性均優(yōu)于肌酐清除率（Ccr）對于糖尿病和非糖尿病患者的應(yīng)用診斷效能類似。MDRD的應(yīng)用應(yīng)該注意：①對于健康人或GFR≥90mLmin-1的CKD患者此研究公式的性能不明。此研究公式應(yīng)用于兒童，75歲以上的老年人，孕婦，有嚴重并發(fā)癥的患者或體型極端，肌肉量大或營養(yǎng)不良的人可能會產(chǎn)生估算GFR的誤差。不推薦應(yīng)用于健康個體或所有住院患者腎功能的評價。②估算兒童GFR多采用Schwartz（施瓦茲）和Filler方程，因為考慮了GFR和身高/血肌酐之間的比例關(guān)系。Schwart公式：GFR=k×身高(cm)/血肌酐(μmol/L)，k為常數(shù)（0-18個月正常嬰兒k為40，2-16歲女孩及2-13歲男孩k均為49，13-16歲男孩k為62）。Filler公式④回歸誤差考慮到各種誤差的類型，指南建議eGFR偏離小于30%仍然是可以接受的。在簡化MDRD方程中的諸測定參數(shù)，肌酐測定的不確定度對eGFR的影響最大。2003年美國病理學(xué)院（CAP）觀察了80μmol/L沒有基質(zhì)效應(yīng)的新鮮人血清在50個不同方法組間的測定變異，結(jié)果測定的SD為5μmol/L，以氣相色譜-質(zhì)譜法作為參考方法，觀察常規(guī)測定結(jié)果與真值之間的差異，結(jié)果測定偏倚為-5.3-27μmol/L。如果一年齡為60的女性患者血清肌酐值為88μmol/L，以簡化方程計算得到eGFR為60ml/L，如果測定的方差為5.3μmol/L,eGFR變化的95%可信區(qū)間為53-69ml/min，eGFR測定偏差達±13%；如果測定的方差為10μmol/L,eGFR變化的95%可信區(qū)間為46-84ml/min，eGFR測定偏差達±30%。在美國CKD教育計劃實驗室協(xié)作組提出肌酐測定的質(zhì)量要求[ImprovetheprecisionofcreatininemethodstomeetthetotalerrorgoalforserumcreatininemeasurementdescribedinthepaperpublishedinClinicalChemistry2006；52（1）：5-18]，血清肌酐測定的不精密度<0.08mg/dL（<7.1μmol/L），與參考方法IDMS的偏差<0.05mg/dL（<4.4μmol/L）。同時建議報告血清肌酐結(jié)果采用SI制時保留1位小數(shù)點位置，以傳統(tǒng)單位mg/dl報告結(jié)果時應(yīng)保留2位小數(shù)點

人血清肌酐測定標準化研究進展

1、人血清肌酐測定的常規(guī)方法及不同測定系統(tǒng)間的變異人血清肌酐常規(guī)測定方法有兩類：Jaffé堿性苦味酸動力學(xué)法和酶法。堿性苦味酸法測定除有上述局限性外，還有同樣都是Jaffé法，開放的自建系統(tǒng)與Beckman為代表的封閉系統(tǒng)間，在低于病理值時呈正偏差，高于病理值時呈負偏差，要把這兩類方測定的結(jié)果統(tǒng)一是非常有難度的2007年徐靜等在中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表了北京13家31個血清肌酐測定系統(tǒng)的現(xiàn)場比對實驗發(fā)現(xiàn)，測定均值為82μmol/L和92μmol/L的冰凍血清樣本苦味酸測定的變異11%和10%，酶法測定變異為10.3%和8.5%，測定變異較CAP調(diào)查CV%明顯偏大，不能滿足臨床的需要。不同系統(tǒng)間的差異與先前童清等發(fā)表的北京市48家三級醫(yī)院臨床化學(xué)現(xiàn)場調(diào)查結(jié)果類似。這種從測定系統(tǒng)的統(tǒng)計上看，被調(diào)查的所有自建系統(tǒng)（A試劑配B家校準品，在C家儀器上測定）均沒有采用配套的校準品，進一步的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，所有自建系統(tǒng)，與Beckman原系統(tǒng)比較，在肌酐小于和大于200μmol/L，有明顯的正（高至12%）和負偏差（低至-9%）。測定均值為82μmol/L的樣本在自建測定系統(tǒng)間的變異接近10%，而封密的Beckman系統(tǒng)測定小于4%。由于自建立分析系統(tǒng)（英文稱之為nonhomogeneoussystem）未經(jīng)科學(xué)比對，是實驗室間測定差異大的重要原因。而酶法測定變異明顯比苦味酸方法低，但酶法較苦味酸法測定結(jié)果系統(tǒng)偏低3.5-8.8%。實驗室間血清肌酐測定值的一致性和準確性（不確定度）不能達到臨床的要求，使得估算eGFR的不確定度較大，可比性不理想，影響了eGFR的推廣應(yīng)用。血清肌酐測定標準化是一個世界難題，我們國家臨床診斷檢測系統(tǒng)測定量值或校準的定值的溯源性研究剛剛起步，血清肌酐測定多為自建、未經(jīng)嚴格比對的檢測系統(tǒng)，因此肌酐測定的標準化工作格外困難，。由于血清肌酐苦味酸測定的變異大，特別受血清內(nèi)源性物質(zhì)如膽紅素、維生素C、蛋白質(zhì)含量、溶血、藥物等的影響，當(dāng)重復(fù)性好，可以溯源到質(zhì)譜的肌酐酶法測定方法問世后，肌酐堿性苦味酸動力學(xué)法測定的時代應(yīng)該結(jié)束了。當(dāng)然在使用MDRD-EPI時，要求血清肌酐測定方法應(yīng)采用酶法，肌酐酶法測定結(jié)果應(yīng)該溯源到質(zhì)譜法。2007年后美國CDC發(fā)布血清肌酐測定標準物質(zhì)CRM567，后面還要介紹，該物質(zhì)具有互換性可以用于常規(guī)方法的準確度考證。美國病理學(xué)家協(xié)會同樣也推出用于血清肌酐準確度驗證的標準物質(zhì)LN-24。在此推動下，很多廠家在血清肌酐測定量值溯源方面作了大量工作，包括積水、羅氏酶法、強生新一代肌酐干化學(xué)酶法、貝克曼新一代苦味酸法、西門子苦味酸法和測定結(jié)果均具有良好的準確性，這些方法測定量值可以溯源到肌酐測定的最高標準ID-MS方法，他們的測定性能可以滿足臨床要求。無論是溯源到ID-MS的酶法還是苦味酸法，其測定結(jié)果較傳統(tǒng)的堿性苦味酸法測定系統(tǒng)偏低，因此肌酐酶法測定的參考值和苦味酸法應(yīng)該不同，迄今也尚未見到采用溯源到質(zhì)譜測定肌酐的參考值的權(quán)威報告。椐北京大學(xué)第一醫(yī)院王學(xué)晶和李海霞大夫未發(fā)表的資料表明，采用溯源到ID-MS的方法測定到男性血清肌酐測定結(jié)果顯著高于女性，小于60歲組顯著高于大于60歲年齡組。血清肌酐小于60歲組和大于60歲年齡組男性和女性血清肌酐95%、97.5%和99%分位結(jié)果分別為：87μmol/L，93μmol/L、102μmol/L和65μmol/L，60μmol/L，71μmol/L以及105μmol/L、109μmol/L、111μmol/L和77μmol/L、83μmol/L、91μmol/L肌酐標準物質(zhì)的研究現(xiàn)狀NIST標準物質(zhì)（SRM）914a為肌酐的純度標準物質(zhì)（結(jié)晶），用于參考方法的校準。SRM914a的定標液是用肌酐純品溶于緩沖液制備的，由于與血清基質(zhì)不同，這種校準品用于常規(guī)方法的校準NIST標準物SRM909-b-1、b-2和參考物質(zhì)參考方法研究院IRMM）提供有證參考物質(zhì)（BCR573，574，575）為多水平的凍干人血清基質(zhì)標準物質(zhì)，其中肌酐的定值方法為氣相色譜分離同位素稀釋質(zhì)譜法（GC-IDMS）這些標準物質(zhì)可以用于較高一級參考測量程序的真值質(zhì)控品。雖然這種物質(zhì)為人血清基質(zhì)，但經(jīng)過凍干等加工過程，其與病人新鮮患者血清間的互通性尚未證實，所以如果以上參考物質(zhì)校準常規(guī)方法時，測定結(jié)果可能會出現(xiàn)偏差。盡管實驗室自動化技術(shù)有了長足進步，肌酐標準化的需求也愈加迫切，在過去的十幾年里，以Jaffe法為基礎(chǔ)的檢測方法的室間變異并未減小，這是不得不正視的現(xiàn)實；同時，該研究也指明了，標準化問題并不能改變分析干擾問題（非特異偏差），此外廠商也應(yīng)通過與參考系統(tǒng)更好的校準來減小其方法的偏差。人血清肌酐測定的參考方法被比利時Ghent大學(xué)、德國臨床化學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)會（DGKC）和NIST提名的三種GC-IDMS方法被國際檢驗醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會（JCTLM）認可為血清肌酐的參考方法。這三種方法均需要除去肌酸的預(yù)處理步驟，因為肌酸會產(chǎn)生與肌酐相同的衍生物干擾測定。前衍生和樣本的預(yù)處理過程步驟復(fù)雜、費時。液相-同位素稀釋質(zhì)譜法（ＬＣ-ＩＤＭＳ）正被提名為血清肌酐測定的參考方法LC-IDMS較GC-IDMS對于樣本的處理簡單和快速。我國計量院和衛(wèi)生部臨床檢驗中心也建立起了ID-MS參考方法。北京大學(xué)第一醫(yī)院參加了JCTLM委托DGKC舉辦2006年度肌酐國際比對，采用的方法為HPLC-UV檢測法。當(dāng)時該計劃只有兩家實驗室參加。另外一家參考實驗室采用的是ID-MS檢測。北京大學(xué)一附院的結(jié)果較ID-MS檢測法系統(tǒng)高10%，并且方法的不確定度也高達10%。從臨床應(yīng)用的角度，這種偏差是不可以接受的。偏差的可能原因是內(nèi)標物的選擇或校準不當(dāng)，也可能是方法學(xué)本身性質(zhì)所決定。方法學(xué)的變異偏大，可能原因是樣本的處理和/或內(nèi)標物的選擇不合適。2009年起北京大學(xué)第一醫(yī)院建立起一種HPLC離子交換UV檢測的方法檢測血清肌酐，該方法與推薦的質(zhì)譜法有一個不到6μmol/L明確的正偏差，但重復(fù)性好。該方法簡單快速，應(yīng)該可以作為ID-MS第三方驗證的方法。不同系統(tǒng)間人血清肌酐測定值偏差較大，并且影響到eGFR的應(yīng)指標，包括肌酐的參考值是否需要改變，肌酐清除率結(jié)果診斷界用，這應(yīng)該受到臨床實驗室和臨床醫(yī)生的關(guān)注。對于臨床實驗室肌酐參考值是否更改，每個國家自己建立的eGFR方程是否需要修正都有應(yīng)該對本實驗室各個肌酐測定系統(tǒng)測定結(jié)果按照行業(yè)通行標準仔仔細評估影響。不管在中國，還是在國際上血清肌酐測定的標準化需要計細進行方法學(xué)比對，以決定本實驗室測定系統(tǒng)的選擇，應(yīng)該選擇溯源到ID-MS的酶法作為本實驗室的方法。臨床醫(yī)生的參與。

酶法真的完美嗎？臨床投訴---肌酐的異常波動肌酐，給我們帶來的尷尬和思考檢測系統(tǒng)基本性能問題帶來的結(jié)果誤差？---質(zhì)控在控什么干擾帶來的肌酐假性降低?為什么只用酶法肌酐檢測的結(jié)果偏低?---方法學(xué)有問題？文獻檢索，初步線索醫(yī)囑回顧，發(fā)現(xiàn)端倪初步試驗，進行確認多貝斯膠囊（羥苯磺酸鈣）是--種口服血管保護劑，對DR的"三高"因素有明顯的抑制和逆轉(zhuǎn)作用。它可降低毛細血管高通透性，降低血液高粘滯性，降低血小板高活性，從而減輕視網(wǎng)膜滲出、出血，減少微血管瘤等。主要治療1、糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變：2、微循環(huán)障礙引起的心、腦、腎疾病，如腎小球動脈硬化癥等；3、降低血液粘稠度；4、防止微血栓形成；5、四肢麻木、疼痛，皮膚瘙癢；6、靜脈曲張等綜合癥。初步調(diào)查結(jié)論---羥苯磺酸鈣干擾酶法肌酐的檢測，造成結(jié)果明顯假性降低。后果：錯誤評估糖尿病腎病患者腎臟功能水平，掩蓋并延誤病情。實驗驗證擬解決的問題對當(dāng)前酶法檢測系統(tǒng)是否普遍存在干擾臨床狀態(tài)干擾程度？對臨床診治的影響干擾實驗體外添加實驗志愿者口服藥物實驗臨床服藥患者血清干擾實驗1.羥苯磺酸鈣的藥代動力學(xué)---健康男性口服本品500mg后，約4h達血藥濃度峰值，峰濃度約為13μg/ml。在組織中分布廣泛，與血漿蛋白結(jié)合率為20-25%，但不能透過血腦屏障。

本品主要以原形從尿中排