生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)課件

生物化學(xué)與分子生物學(xué)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)1目錄前言第一章：生物化學(xué)與分子生物學(xué)中的定量分析第二章：生物大分子的提取、沉淀和離心分離第三章：層析技術(shù)第四章：電泳技術(shù)第五章：分子生物學(xué)基本技術(shù)目錄前言2前言前言320年代：微量分析技術(shù)導(dǎo)致了維生素、激素和輔酶等的發(fā)現(xiàn)。瑞典著名的化學(xué)家T.Svedberg奠基了“超離心技術(shù)的理論基礎(chǔ)，1924年制成了第一臺5000RCF的離心機(jī)（5000r/min-8000r/min，相對離心力“RCF”的單位可表示為“×g”)，并準(zhǔn)確測定了血紅蛋白等復(fù)雜蛋白質(zhì)的分子量，獲得了1926年的諾貝爾化學(xué)獎。。1.1生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展簡史20年代：1.1生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展簡史430年代：

電子顯微鏡技術(shù)打開了微觀世界，使我們能夠看到細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和某些生物大分子的大致結(jié)構(gòu)。美國哈佛大學(xué)的Folin教授和中國的吳憲教授建立了不少生物化學(xué)常用的分析方法如血糖分析、蛋白質(zhì)含量分析、氨基酸測定等。英藉德裔生物化學(xué)家Krebs，在1937年發(fā)現(xiàn)了三羧酸循環(huán)，對細(xì)胞代謝及分子生物學(xué)的研究作出了重要貢獻(xiàn)，他與美藉德裔生物化學(xué)家Lipmann共獲1953年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。30年代：540年代：兩位英國科學(xué)家Martin和Synge發(fā)明了分配色譜（層析），他們獲得了1952年的諾貝爾化學(xué)獎。由此，層析技術(shù)成為分離生化物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。

電泳技術(shù)由瑞典的著名科學(xué)家Tisellius奠基，從而開創(chuàng)了電泳技術(shù)的新時(shí)代，他因此獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎。層析技術(shù)和電泳技術(shù)用于分析生物大分子的組成和代謝的中間產(chǎn)物，示蹤技術(shù)的應(yīng)用推動了代謝的研究。美國化學(xué)家Pauling確認(rèn)氫鍵在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中以及生物大分子間相互作用的重要性等，并因此而獲得了諾貝爾化學(xué)獎。40年代：650年代：自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次將放射性同位素示蹤用于碳水化合物及類脂物質(zhì)的中間代謝的研究以后，射性同位素示蹤技術(shù)50年代有了大的發(fā)展，為各種生物化學(xué)代謝過程的闡明起了決定性的作用。1953年美國科學(xué)家Watson和英國科學(xué)家Crick提出DNA分子反向平行雙螺旋模型，1962年與英國科學(xué)家Wilkins分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎，Wilkins和Franklin通過對DNA分子的X-射線衍射研究為Watson和Crick的DNA模型提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，DNA雙螺旋模型的提出開創(chuàng)了生物科學(xué)的歷史新紀(jì)元。在X-射線衍射技術(shù)方面，英國物理學(xué)家Perutz對血紅蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行X-射線結(jié)構(gòu)分析,Kendrew測定了肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)，成為研究生物大分子立體結(jié)構(gòu)的先驅(qū)，他們同獲1962年諾貝爾化學(xué)獎。英國生物化學(xué)家Sanger還于1953年確定了牛胰島素中氨基酸的順序而獲得1958年的諾貝爾化學(xué)獎。Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅰ，美藉西班牙裔科學(xué)家Uchoa發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內(nèi)的遺傳信息通過RNA中間體翻譯成蛋白質(zhì)的過程。兩人分享了1959年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。50年代：760年代：各種儀器分析方法用于生物化學(xué)研究，取得了很大的發(fā)展，如HPLC技術(shù)、紅外、紫外、圓二色等光譜技術(shù)、NMR核磁共振技術(shù)等。自1958年Stem，Moore和Spackman設(shè)計(jì)出氨基酸自動分析儀，大大加快了蛋白質(zhì)的分析工作。1967年Edman和Begg制成了氨基酸序列分析儀，到1973年Moore和Stein設(shè)計(jì)出氨基酸序列自動分析儀，又大大加快了對多肽一級結(jié)構(gòu)的測定，十多年間氨基酸的自動測定工作得到了很大的發(fā)展和完善。在60年代，層析和電泳技術(shù)又有了重大的進(jìn)展，在1968-1972年Anfinsen創(chuàng)建了親和層析技術(shù)，開辟了層析技術(shù)的新領(lǐng)域。1969年Weber應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測定了蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，使電泳技術(shù)取得了重大進(jìn)展。美國生物化學(xué)家Nirenberg在破譯遺傳密碼方面作出了重要貢獻(xiàn)，Holly闡明了酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸排列順序，后來證明所有tRNA的結(jié)構(gòu)均相似。美藉印度裔生物化學(xué)家Khorana提出按預(yù)定的序列合成核酸分子的方法。他們3人共獲1969年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。法國生物學(xué)家Lwoff、JAcob和生物化學(xué)家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共獲1965年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。60年代：870年代：

基因工程技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展，Arber，Smith和Nathans三個(gè)小組發(fā)現(xiàn)并純化了限制性內(nèi)切酶，1972年，美國斯坦福大學(xué)的Berg等人首次用限制性內(nèi)切酶切割了DNA分子，并實(shí)現(xiàn)了DNA分子的重組。1973年，又由美國斯坦福大學(xué)的Cohen等人第一次完成了DNA重組體的轉(zhuǎn)化技術(shù)，這一年被定為基因工程的誕生年，Cohen成為基因工程的創(chuàng)始人，從此，生物化學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新的大發(fā)展時(shí)期。與此同時(shí)，各種儀器分析手段進(jìn)一步發(fā)展，制成了DNA序列測定儀、DNA合成儀等。

70年代：980年代基因工程技術(shù)進(jìn)入輝煌發(fā)展的時(shí)期，1980年，英國劍橋大學(xué)的生物化學(xué)家Sanger和美國哈佛大學(xué)的Gilbert分別設(shè)計(jì)出兩種測定DNA核苷酸序列的方法，而與Berg共獲諾貝爾化學(xué)獎，從此，DNA序列分析法成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)最重要的研究手段之一。他們3人在DNA重組和RNA結(jié)構(gòu)研究方面都作出了杰出的貢獻(xiàn)。1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE），由于其高效、快速、經(jīng)濟(jì)，尤其適用于生物大分子的分析，因此受到生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等學(xué)科的科學(xué)工作者的極大重視，發(fā)展極為迅速，是生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)和儀器分析領(lǐng)域的重大突破，意義深遠(yuǎn)。現(xiàn)今，由于HPCE技術(shù)的異軍突起，HPLC技術(shù)的發(fā)展重點(diǎn)己轉(zhuǎn)到制備和下游技術(shù)。80年代101984年德國科學(xué)家Kohler、美國科學(xué)家Milstein和丹麥科學(xué)家Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)而共享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。1985年美國加利福尼亞州Cetus公司的Mullis等發(fā)明了用PCR技術(shù)（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA的技術(shù)，對于生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究工作具有劃時(shí)代的意義，因而與第一個(gè)設(shè)計(jì)基因定點(diǎn)突變的Smith共享1993年的諾貝爾化學(xué)獎1988年，美國遺傳學(xué)家McClintock由于在二十世紀(jì)五十年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。1989年，美國科學(xué)家Altman和Cech由于發(fā)現(xiàn)某些RNA具有酶的功能（稱為核酶）而共享諾貝爾化學(xué)獎。1984年德國科學(xué)家Kohler、美國科學(xué)家Mils1190年代：1993年，美國科學(xué)家Roberts和Sharp由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。1994年，美國科學(xué)家Gilman和Rodbell由于發(fā)現(xiàn)了G蛋白在細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)中的作用而分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。1995年，美國科學(xué)家Lewis、德國科學(xué)家Nusslein-Volhard和美國科學(xué)家Wieschaus由于在20世紀(jì)40-70年代先后獨(dú)立鑒定了控制果蠅體節(jié)發(fā)育基因而共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。進(jìn)入21世紀(jì)以來，PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)不斷完善，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)發(fā)展迅速。90年代：12我國生物化學(xué)界的主要成就我國生物化學(xué)界的先驅(qū)吳憲教授在20年代初由美回國后，在協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測和免疫化學(xué)等一系列有重大影響的研究。1965年我國化學(xué)和生物化學(xué)家用化學(xué)方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，1983年又通過大協(xié)作完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工合成。近年來，在酶學(xué)研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物膜的結(jié)構(gòu)與功能等方面都有舉世矚目的研究成果。90年代以來，我國參與了人類基因組計(jì)劃，在水稻基因組研究中處于國際領(lǐng)先水平，在功能基因組學(xué)研究中取得不少成績。我國生物化學(xué)界的主要成就131.2生化實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)施與裝備溫度與環(huán)境設(shè)施許多生化實(shí)驗(yàn)都要求在一定的溫度和濕度下進(jìn)行操作，因此，一個(gè)正規(guī)的生化實(shí)驗(yàn)室必須能夠保持恒溫、恒濕的環(huán)境。為了保持這些條件，實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)裝備空調(diào)和加濕器等，而儀器分析室則要求保持干燥，一些怕潮濕和易水解的試劑應(yīng)保存在干燥箱中。由于各種生物材料、制劑和各種生化試劑要求在不同的溫度下保存，實(shí)驗(yàn)室必須備有4℃、－20℃、－80℃的冰箱，需要在更低溫度下保存的樣品，則須使用液氮罐。對于需在較高溫度下進(jìn)行的操作，則可使用烘箱和高溫電爐等。實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)備有干冰，以便使用乙醇-干冰浴進(jìn)行樣品的快速冷凍分裝。

1.2生化實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)施與裝備溫度與環(huán)境設(shè)施14實(shí)驗(yàn)室用純水生化實(shí)驗(yàn)室使用最多的溶劑是“水”，配制生化實(shí)驗(yàn)用試劑不能用自來水，只能使用經(jīng)過純化的水。生化實(shí)驗(yàn)對所用水的純度是要求比較高的，通?？梢哉J(rèn)為，水的質(zhì)量越高，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果就越真實(shí)可靠和準(zhǔn)確，為此必須保證實(shí)驗(yàn)用水的質(zhì)量。常用的兩種純水是二次蒸餾水和無離子水。在超純分析和特殊的生化實(shí)驗(yàn)中要求更高的水質(zhì)，如無菌水、亞沸蒸餾水、無二氧化碳蒸餾水等。根據(jù)實(shí)際工作的需要，來選用水的種類，如：無離子水、普通蒸餾水、二次蒸餾水、亞沸蒸餾水及按特殊要求制備的高純水等。所有的各種純水，在貯存中都會被污染：塑料容器會產(chǎn)生有紫外吸收的有機(jī)物；玻璃和金屬容器會產(chǎn)生金屬離子的污染；長時(shí)間放置更會使水長菌，空氣中的二氧化碳會溶入水中，所以貯存高純水一定要隔絕空氣，密封蓋嚴(yán)，必要時(shí)貯存在冰箱的冷藏室中。實(shí)驗(yàn)室用純水15消毒系統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行生物培養(yǎng)和生物反應(yīng)的操作，這些操作都必須排除其他生物因素的干擾，因此在做這些實(shí)驗(yàn)之前，都必須對實(shí)驗(yàn)中用到的、可能造成污染的材料、器械等進(jìn)行消毒滅菌處理。常用的滅菌方法有：高溫、高壓滅菌、紫外線照射、火焰焚燒、過濾除菌、酒精等試劑浸泡消毒等，因此實(shí)驗(yàn)室必須配備各種無菌處理設(shè)備。離心設(shè)備離心方法是分離和制備生物大分子最常用的手段，因而生化實(shí)驗(yàn)室必須備有各種形式的離心機(jī)。常用的有普通臺式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)和超速離心機(jī)等。消毒系統(tǒng)16計(jì)量系統(tǒng)

生化實(shí)驗(yàn)都要求在各種標(biāo)準(zhǔn)的定量條件下進(jìn)行，因此實(shí)驗(yàn)室必須配備各種標(biāo)準(zhǔn)的定量系統(tǒng)。常用的定量系統(tǒng)有：稱量系統(tǒng)、液體體積度量系統(tǒng)、pH測定系統(tǒng)、液體溶質(zhì)定量系統(tǒng)等。⑴稱量儀器：最常用的設(shè)備是各種千分之一的扭力天平、單、雙盤天平和各種萬分之一的電子天平等，它們分別用于各種緩沖液的配制和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量等。⑵液體體積度量儀器：常用的有各種量筒、移液管、容量瓶、微量進(jìn)樣器和各種自動取液器等。⑶酸堿度pH測量儀器：最常用的是pH試紙和pH計(jì)。⑷液體溶質(zhì)定量儀器：此系統(tǒng)主要是根據(jù)液體溶質(zhì)的某些理化特性而設(shè)計(jì)的，不同的物質(zhì)在一定的條件下有特定的吸收光譜，其吸收值的大小與其在溶液中的濃度有一定的關(guān)系，可以通過測定某物質(zhì)在溶液中的吸收光譜來計(jì)算出該物質(zhì)的濃度，因而分光光度計(jì)就是生化實(shí)驗(yàn)室必備的儀器分析手段。主要有可見分光光度計(jì)和高檔的快速掃描紫外／可見分光光度計(jì)等。

計(jì)量系統(tǒng)17電泳裝置電泳是生化實(shí)驗(yàn)中最常用最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，主要用于分析、鑒定，也可用于制備。電泳裝置由電源和電泳槽兩部分組成，詳見第4章。層析系統(tǒng)層析又稱為色譜，是分離各種生物大分子的主要手段之一，因而各種層析系統(tǒng)和核酸蛋白檢測器就是生化實(shí)驗(yàn)室最常用的儀器設(shè)備。主要的層析技術(shù)有：吸附層析、凝膠排阻層析、離子交換層析和親和層析等，詳見第3章。PCR儀PCR(PolymeraseChainReaction)是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該反應(yīng)是用DNA聚合酶在體外大量擴(kuò)增DNA片段的一種方法。PCR儀就是將此方法實(shí)現(xiàn)了自動化操作的一種儀器，是生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用和必備的設(shè)備。電泳裝置18生物培養(yǎng)設(shè)施生物培養(yǎng)是生化實(shí)驗(yàn)必不可少的設(shè)備。生物材料的培養(yǎng)有微生物培養(yǎng)、植物細(xì)胞及組織培養(yǎng)、動物細(xì)胞及動物培養(yǎng)等。不同的培養(yǎng)，其對設(shè)施的要求也有所不同。微生物培養(yǎng)：需要恒溫恒濕培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)器即搖床（有空氣和水浴式以及全溫式搖床）、發(fā)酵罐、大型生物反應(yīng)器等。植物細(xì)胞及組織培養(yǎng)：需要恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)器、生物反應(yīng)器和植物房等。動物細(xì)胞及動物培養(yǎng)：需要二氧化碳培養(yǎng)箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱和動物房等。為了對所培養(yǎng)的微生物和動植物細(xì)胞進(jìn)行破碎，提取所需的生物大分子，還必需有各種高效率的細(xì)胞破碎裝置。

生物培養(yǎng)設(shè)施19基因?qū)雰x用于向受體生物細(xì)胞中導(dǎo)入基因。常用的導(dǎo)入儀有：電導(dǎo)入儀、基因槍、激光和超聲導(dǎo)入儀、原生質(zhì)體融合儀等。高效液相色譜儀和毛細(xì)管電泳儀用于各種生物大分子的分析與鑒定。冷室

生化實(shí)驗(yàn)一般都要求在低溫下進(jìn)行，由于冰浴太小，冷柜也不能進(jìn)人操作，因此就需要有一間4℃-10℃的冷室，工作人員可以在其中進(jìn)行各種柱層析、各種電泳、生物大分子的提取和分離、硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)以及各種物質(zhì)的透析等操作，并可以貯存各種生物制品和生化試劑。基因?qū)雰x20其它設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室除以上常規(guī)設(shè)備和設(shè)施外，還必須裝備下列一些常用設(shè)備：A.通風(fēng)柜：用于有害和有毒氣體的操作。B.微波爐：用于化凍、滅菌及其他一些需要快速加熱的操作。C.組織打碎機(jī)和勻漿器：用于各種生物材料、動植物組織和細(xì)胞的破碎。D.超聲清洗機(jī)：用于各種器皿、移液管和自動取液器吸頭的清洗和高效液相色譜儀所用流動相的脫氣等。E.冰凍干燥機(jī)：用于生物大分子水溶液的冰凍干燥，可由其水溶液直接制得固體干粉。F.機(jī)械和水環(huán)式真空泵：用于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和各種真空抽氣操作。G.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：用于各種水溶液和有機(jī)溶液的旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾操作。H.酶標(biāo)儀：用于免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)的酶聯(lián)免疫吸附測定。其它設(shè)備21第一章：生物化學(xué)與分子生物學(xué)中的定量分析第一章：生物化學(xué)與分子生物學(xué)中的定量分析22一、基本原理(一）滴定分析法的概念

滴定（titration）:是將已知準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過滴定管滴加到待測溶液中的過程。

滴定分析法（volumetricanalysis）:待滴定進(jìn)行到化學(xué)反應(yīng)按計(jì)量關(guān)系完全作用為止，然后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和體積計(jì)算出待測物質(zhì)含量得分析方法稱為滴定分析法。滴定分析法具有快速準(zhǔn)確，操作簡便，儀器要求低的特點(diǎn)，相對誤差一般在0.2%以下。通常適用于組分含量在1%以上的常量組分分析，有時(shí)也可用于測定微量組分。目前仍然是廣泛應(yīng)用的定量分析方法。

第一節(jié)滴定分析法一、基本原理第一節(jié)滴定分析法23當(dāng)化學(xué)反應(yīng)按計(jì)量關(guān)系完全作用，即滴加溶液物質(zhì)的量與待測定組分物質(zhì)的量恰好符合化學(xué)反應(yīng)式所表示的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，稱為反應(yīng)到達(dá)了化學(xué)計(jì)量點(diǎn)（stoichiometricpoint），也稱為“等當(dāng)點(diǎn)”（equivalentpoint)。適合于滴定分析的化學(xué)反應(yīng)必須具備以下三個(gè)條件：1.待測物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)溶液之間的反應(yīng)要有嚴(yán)格的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，反應(yīng)定量完成的程度要達(dá)到99.9%以上，這是定量計(jì)算的基礎(chǔ)。2.反應(yīng)必須迅速完成，或通過加熱、使用催化劑等措施可以迅速完成。3.必須有適宜的指示劑或其它簡便可靠的方法確定終點(diǎn)。

當(dāng)化學(xué)反應(yīng)按計(jì)量關(guān)系完全作用，即滴加溶液物質(zhì)的量與待24如何準(zhǔn)確的確定化學(xué)計(jì)量點(diǎn)是滴定分析中的重要問題。常在待測物質(zhì)的溶液中加入一種輔助試劑，將它的顏色變化作為化學(xué)計(jì)量點(diǎn)到達(dá)的信號。這種輔助試劑稱為“指示劑”（indicator)。在滴定過程中，指示劑正好發(fā)生顏色變化的轉(zhuǎn)變點(diǎn)稱為滴定終點(diǎn)（endpointofthetitration)?；瘜W(xué)計(jì)量點(diǎn)是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的計(jì)量關(guān)系求得的理論值，而滴定終點(diǎn)是實(shí)際滴定時(shí)的測得值，指示劑并不恰好在到達(dá)化學(xué)計(jì)量點(diǎn)的一瞬間變色，兩者不一定恰好符合，它們之間存在的很小的差距引起的誤差叫滴定誤差（titrationerror）或終點(diǎn)誤差（endpointerror）。滴定誤差的大小，決定于指示劑的性質(zhì)和用量。為了減小誤差，需要選擇適當(dāng)?shù)闹甘緞沟味ńK點(diǎn)盡可能接近化學(xué)計(jì)量點(diǎn)。如何準(zhǔn)確的確定化學(xué)計(jì)量點(diǎn)是滴定分析中的重要問題。常在25（二）生化與分子生物學(xué)中常用的滴定法1.酸堿滴定法是利用酸堿中和反應(yīng)的一種容量分析法。是在水溶液中以質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定分析方法。一般的酸堿以及能與酸堿直接或間接進(jìn)行質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的物質(zhì)，幾乎都可以利用酸堿滴定法進(jìn)行測定。常用的酸堿指示劑（acid-baseindicator）是一些有機(jī)的弱酸或弱堿，其共軛酸或者共軛堿具有不同的結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)不同的顏色。共軛酸堿+

質(zhì)子

當(dāng)?shù)味ǖ浇K點(diǎn)時(shí)，溶液的pH應(yīng)在指示劑變色范圍之內(nèi)，常用指示劑的變色范圍：甲基橙：（紅）－3.1-橙色-4.4－（黃）酚酞：（無）－8.2-粉紅色-10.0－（紅）石蕊：（紅）－5.0-紫色-8.0－（藍(lán)）（二）生化與分子生物學(xué)中常用的滴定法1.酸堿滴定法26指示劑的選擇強(qiáng)酸滴定弱堿選甲基橙強(qiáng)堿滴定弱酸選酚酞強(qiáng)酸滴定強(qiáng)堿酚酞或甲基橙滴定終點(diǎn)的判斷強(qiáng)酸滴定強(qiáng)堿強(qiáng)堿滴定強(qiáng)酸甲基橙由黃橙酚酞由紅無色甲基橙由紅橙酚酞由無色粉紅指示劑的選擇甲基橙由黃橙酚酞由紅無27（1）直接法利用酸或堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定被測的堿性物質(zhì)或酸性物質(zhì)。（1）酸類：強(qiáng)酸、ka大于10-8的弱酸、混合酸、多元酸等都可以用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液直接滴定。如礦酸、脂肪酸和芳香酸等。（2）堿類：強(qiáng)堿、Kb大于10-8的弱堿可用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液直接滴定。如各種生物堿、有機(jī)堿類等。（1）直接法28（2）間接法有些物質(zhì)具有酸性或堿性，但難溶于水，這時(shí)可先加入準(zhǔn)確過量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待作用完全后，再用另一種標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴。應(yīng)用實(shí)例

硼酸的測定:硼酸是很弱的酸，不能用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定。但是，硼酸與多元醇生成絡(luò)合酸后酸強(qiáng)度增加。如硼酸和甘油生成的絡(luò)合酸可用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。

氮的測定:測定硫酸銨的含氮量時(shí)，硫酸銨作為弱酸，直接滴定有困難，可加入濃NaOH溶液，用蒸餾法將NH3吸收在過量的HCl或H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液中，過量的酸用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴，用甲基紅或甲基橙作為指示劑。（2）間接法292.氧化還原滴定法以氧化還原反應(yīng)為基礎(chǔ)的容量分析方法。因?yàn)槎喾N元素具有氧化態(tài)，所以選用合適的氧化劑作為滴定劑，可以測定許多還原性物質(zhì)；也可以用適合的還原劑測定氧化性物質(zhì)。生物化學(xué)與分子生物學(xué)中常用的氧化還原滴定法有：（1）重鉻酸鉀法（2）高錳酸鉀法（3）碘量法2.氧化還原滴定法30

常用指示劑自身指示劑：有些標(biāo)準(zhǔn)溶液本身有很深的顏色，滴定時(shí)無需另加指示劑，只要標(biāo)準(zhǔn)溶液稍微過量一點(diǎn)，即可顯示終點(diǎn)的到達(dá)。如：用K2MnO4滴定還原性物質(zhì)時(shí)，只要過量的K2MnO4濃度達(dá)到2×10-6mol/L,就能由紫紅色變?yōu)榉奂t色。特殊指示劑：有些指示劑本身不具有氧化還原性，但能與氧化劑或還原劑產(chǎn)生特殊的顏色，從而可以指示滴定終點(diǎn)。淀粉就是一種特殊指示劑：淀粉溶液遇I3-產(chǎn)生深藍(lán)色，反應(yīng)極為靈敏。在直接碘量法和間接碘量法中均可應(yīng)用。氧化還原指示劑：指示劑本身是一種弱氧化劑或弱還原劑，它的氧化型和還原型具有不同的顏色。是氧化還原滴定法的常用指示劑，對各種氧化還原反應(yīng)普遍適用，用途廣泛。選擇氧化還原指示劑的原則：指示劑的顏色變化應(yīng)發(fā)生在滴定的電位突躍范圍。常用指示劑31滴定曲線氧化還原滴定可以畫出一條曲線，以表示滴定過程中氧化劑和還原劑濃度變化情況。因?yàn)檠趸瘎┗蜻€原劑濃度的變化,溶液中氧化還原對的電位也隨之改變，所以氧化還原滴定曲線通常以氧化還原對的電位為縱坐標(biāo)，加入滴定劑的體積或百分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)繪制。滴定曲線32（1）重鉻酸鉀法用重鉻酸鉀作為氧化劑，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，來測定還原性物質(zhì)的一種氧化還原滴定法。重鉻酸鉀中的Cr6+在酸性介質(zhì)中可以被還原劑還原成為Cr3+。由于Cr3+易水解，滴定要求在酸性介質(zhì)中進(jìn)行重鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)溶液配好后非常穩(wěn)定，長期放置濃度不變。在酸性介質(zhì)中，橙色的鉻酸根還原后生成綠色的Cr3+。但重鉻酸鉀本身不能作為指示劑，與它聯(lián)用的是二苯胺磺酸鈉和鄰苯氨基苯甲酸。重鉻酸鉀法最重要的應(yīng)用是測定樣品中鐵的含量。（1）重鉻酸鉀法33（2）高錳酸鉀法高錳酸鉀是強(qiáng)氧化劑之一。在酸性溶液中能被還原成二價(jià)錳。溶液的酸度以控制在1-2mol/L為宜。MnO4-+8H++5eMn2++4H2O在中性或微酸性溶液中，高錳酸鉀也可以被還原，獲得3個(gè)電子還原為二氧化錳。MnO4-+2H2O+3eMnO2+4OH-（2）高錳酸鉀法34（3）碘量法

碘量法是以點(diǎn)作為氧化劑，或用碘化物作為還原劑，進(jìn)行氧化還原滴定的方法。用I2作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，直接進(jìn)行滴定稱為直接碘量法。I2+2e2I-用碘化物作為還原劑，通過Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定生成I2，或用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定剩余的I2，稱為間接碘量法。I2+2S2O32-2I-+S4O62-（3）碘量法35（三）滴定方式（1）直接滴定法所用化學(xué)反應(yīng)能滿足滴定要求時(shí)，可直接用標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，稱為直接滴定法。如用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定氫氧化鈉試樣溶液等。（2）返滴定法又稱回滴定法。如反應(yīng)速度較慢或反應(yīng)物是固體，滴定劑加入樣品后反應(yīng)無法在瞬間定量完成，可先加入一定量的過量標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品溶解后再用滴定劑滴定。如測定固體碳酸鈣先加入過量鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解樣品，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液返滴定剩余的鹽酸。（三）滴定方式36（3）置換滴定法對于不按照化學(xué)計(jì)量關(guān)系反應(yīng)的物質(zhì)可通過其他化學(xué)反應(yīng)間接進(jìn)行滴定。置換滴定法是加入適當(dāng)試劑與待測物質(zhì)反應(yīng)，使其被定量的置換成另外一種可直接滴定的物質(zhì)，再用標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定此生成物。（4）間接滴定法除了返滴定法和置換滴定法，有時(shí)還用其它化學(xué)反應(yīng)間接進(jìn)行測定。如Ca2+可通過沉淀CaC2O4，溶于酸后，用高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定間接測定Ca2+含量。（3）置換滴定法37二、標(biāo)準(zhǔn)溶液（一）標(biāo)準(zhǔn)溶液與基準(zhǔn)物質(zhì)1.直接配置法：準(zhǔn)確稱取一定量的物質(zhì)，溶解后轉(zhuǎn)移到容量瓶中，稀釋至刻度。根據(jù)物質(zhì)的質(zhì)量和容量瓶的體積，算出該標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確濃度?？梢杂脕碇苯优渲脴?biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)稱為“基準(zhǔn)物質(zhì)”（standardsubstance)。必須符合下列條件：A:試劑的組成與化學(xué)式完全相符；B:試劑的純度一般應(yīng)在99.9%以上；C:性質(zhì)穩(wěn)定。加熱干燥時(shí)不分解，稱量時(shí)不吸濕，不吸收空氣中CO2，不被空氣氧化等；D:試劑最好有較大的摩爾質(zhì)量，以便減少稱量誤差。二、標(biāo)準(zhǔn)溶液（一）標(biāo)準(zhǔn)溶液與基準(zhǔn)物質(zhì)382.間接配置法也稱標(biāo)定法。許多化學(xué)試劑不符合基準(zhǔn)物質(zhì)的要求，如：HCl易揮發(fā)，NaOH易吸收空氣中的水分和CO2，這時(shí)候需要先配制成大致濃度的溶液，再利用該物質(zhì)與基準(zhǔn)物質(zhì)或另一種已知濃度的溶液的反應(yīng)測定出該溶液的準(zhǔn)確濃度。可用于標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的基準(zhǔn)物質(zhì)如下：無水碳酸鈉（酸）、十水合碳酸鈉（酸）、二水合草酸（堿或高錳酸鉀）、硼砂（酸）、鄰苯二甲酸氫鉀（堿）、重鉻酸鉀（還原劑）、氧化鋅（EDTA）等。2.間接配置法39（二）標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的表示方法（1）物質(zhì)的量濃度（molarity):指單位體積溶液VB中所含溶質(zhì)B的物質(zhì)的量nB，以符號CB表示

CB=nB/VB

（mol/L或mmol/L）若物質(zhì)的質(zhì)量為mB，其摩爾質(zhì)量為MB，則物質(zhì)的量表示為：

nB=mB/MBCB=mB/（MB·VB）（二）標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的表示方法40標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)定（1）基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定法稱取一定量的基準(zhǔn)物質(zhì)，溶解后用待標(biāo)定的溶液滴定，根據(jù)基準(zhǔn)物質(zhì)的量和待標(biāo)定溶液消耗的體積，即可計(jì)算出該溶液的濃度。大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)溶液是通過“標(biāo)定”測定其準(zhǔn)確濃度的。（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液比較法準(zhǔn)確吸取一定量的待標(biāo)定溶液，用已知準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根據(jù)兩種溶液所消耗的體積及標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，計(jì)算出待標(biāo)定溶液的濃度。這種方法稱為“比較法”，不如用基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定法好。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)定412.滴定度（titer）:

指每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液中，所含溶質(zhì)的量（g/ml或mg/ml），以符號T表示。有以下兩種表示方法：（1）以每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含的溶質(zhì)的質(zhì)量表示。如TNaOH=0.0400g/ml，表示1mlNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有0.0400gNaOH。（2）以每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液所能滴定的被測物質(zhì)的質(zhì)量表示。如TNaOH/HCl=0.0036g/ml，表示每毫升NaOH恰好能與0.0036gHCl反應(yīng)。一般表示為TT/A，T為滴定劑，A為被測物質(zhì)。在生產(chǎn)實(shí)踐中使用這種濃度可以省去很多計(jì)算，很快得出分析結(jié)果，應(yīng)用方便。2.滴定度（titer）:42三、滴定分析的計(jì)算對于任何一個(gè)滴定反應(yīng)，都是用標(biāo)準(zhǔn)溶液（滴定劑T）去滴定待測物質(zhì)（A），生成P。在化學(xué)計(jì)量點(diǎn)，待測物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)的量必定相當(dāng)。

tT+aA→P

以n來表示物質(zhì)的摩爾數(shù)，則

nT:nA=t:a則nA=（a/t）·nT若待測溶液體積為VA，摩爾濃度為CA，到達(dá)化學(xué)計(jì)量點(diǎn)時(shí)用去濃度為CT的滴定劑體積VT。則

CA·VA=（a/t）·(CT·VT)若以質(zhì)量計(jì)算

mA=（a/t）·(CT·VT·MA)滴定分析中體積以ml計(jì)算，所以

mA=（a/t）·(CT·VT）·（MA/1000)因此，滴定度TT/A=（a/t）·CT·(MA/1000)三、滴定分析的計(jì)算43四、減小滴定誤差的方法1.絕對誤差和相對誤差任何測量都是測量者通過某種儀器進(jìn)行的。由于受分析方法、測量儀器、試劑和分析工作者的主觀因素等方面的限制，得到的測量結(jié)果不可能和真實(shí)值完全一致。在一定條件下，測量結(jié)果只能接近真實(shí)值，而不能達(dá)到真實(shí)值。進(jìn)行定量分析時(shí)，必須根據(jù)對結(jié)果準(zhǔn)確度的要求，合理的安排實(shí)驗(yàn)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性做出合理判斷并予以正確表達(dá)。誤差的大小是衡量一個(gè)測量值不準(zhǔn)確性的尺度。誤差越小，說明測量的準(zhǔn)確性越高。測量中的誤差，可以用兩種方法表示：絕對誤差（absoluteerror）和相對誤差（relativeerror）四、減小滴定誤差的方法44絕對誤差（absoluteerror）：絕對誤差是測量值與真實(shí)值之差。δ=x?μ(δ：絕對誤差；x：測量值；μ：真實(shí)值）絕對誤差是以測量值的單位為單位，可以是正值，也可以是負(fù)值。測量值越接近真實(shí)值，絕對誤差越小。真實(shí)值是一個(gè)可以接近而不可達(dá)到的理論值。上式可以寫成：

μ=x-δ說明在已知絕對誤差值的情況下，真實(shí)值可以從測定值減去絕對誤差而求得。絕對誤差（absoluteerror）：45相對誤差（relativeerror）：為了反映誤差在測量結(jié)果中所占的比例，分析工作中經(jīng)常使用相對誤差。相對誤差是以真實(shí)值的大小為基礎(chǔ)表示的誤差值，沒有單位。

δ/μ=(x-μ)/μ通常以%，‰或ppm表示。例如：測定純NaCl中Cl的百分含量為60.52%，而其真實(shí)含量（理論值）為60.66%。則絕對誤差=60.52%?60.66%=-0.14%相對誤差=[（60.52%?60.66%）/60.66%]×1000‰=-2.3‰

相對誤差（relativeerror）：46

如果不知道真實(shí)值，而知道絕對誤差值，則相對誤差也可以表示為：

相對誤差=δ

×

100%x例如：用分析天平稱兩個(gè)重量，一個(gè)是0.0021g，另一個(gè)是0.5432g，兩個(gè)重量的絕對誤差都是0.0001g，可是相對誤差卻大不相同，一個(gè)是（1/21）×100%，另一個(gè)是（1/5432）×100%?？梢?，由于兩個(gè)被測組分含量高低不同，即使絕對誤差相同，相對誤差也不同。對高含量組分測定的相對誤差應(yīng)當(dāng)要求小些，低含量組分測定的相對誤差要求允許大些。例如：用重量法和滴定法測量樣品主要成分，相對誤差需要達(dá)到千分之一，而用比色法測定樣品重微量成分時(shí)，相對誤差只要求達(dá)到百分之幾即可。如果不知道真實(shí)值，而知道絕對誤差值，472.系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差（systematicerror）也叫“可定誤差”，是由某種確定的原因引起的，一般有固定的方向（正或負(fù)）和大小，重復(fù)測定時(shí)重復(fù)出現(xiàn)。根據(jù)系統(tǒng)誤差的來源，可分為：（1）方法誤差方法誤差是由于不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或所選方法不恰當(dāng)所引起的，通常影響較大。比如：滴定分析中終點(diǎn)與化學(xué)計(jì)量點(diǎn)不相符合、重量分析中沉淀的溶解度過大或有共沉淀等，都會產(chǎn)生誤差。（2）儀器或試劑誤差是由于儀器未經(jīng)校準(zhǔn)或試劑不合規(guī)格引起的。例如：天平砝碼不準(zhǔn)、容量儀器刻度不準(zhǔn)或試劑不純等，均能產(chǎn)生這種誤差。2.系統(tǒng)誤差48（3）操作誤差

操作誤差是由于分析者操作不符合要求引起的。例如：分析者對滴定終點(diǎn)顏色改變的判斷能力不夠高，總是偏深或偏淺，便會產(chǎn)生誤差。由于系統(tǒng)誤差是重復(fù)的以固定方向和大小出現(xiàn)，所以能用加校正值的方法加以消除，但不能用增加平行測定次數(shù)的方法消除。（3）操作誤差493.隨機(jī)誤差（accidentalerror):也稱偶然誤差，是由于偶然的原因，如測量條件、實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度等變動而未能得到控制的條件波動引起的，其大小和正負(fù)都不固定。偶然誤差的出現(xiàn)看起來似乎沒有規(guī)律，但多次測量就會發(fā)現(xiàn)絕對值相同的正負(fù)偶然誤差出現(xiàn)的概率大致相等，它們之間能完全或部分抵消。因此通過增加平行測定次數(shù)，就可以減免測定結(jié)果中這種誤差。也可以通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法估計(jì)出偶然誤差值，并在測定結(jié)果中予以正確表達(dá)。系統(tǒng)誤差和偶然誤差往往不能區(qū)分。比如：在觀察滴定終點(diǎn)的顏色變化時(shí)，有人總是偏深，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。但多次測定中偏深程度不一樣，又必然有偶然誤差。3.隨機(jī)誤差（accidentalerror):504.準(zhǔn)確度和精密度（1）準(zhǔn)確度（accuracy）：表示分析結(jié)果與真實(shí)值接近的程度。準(zhǔn)確度的大小，用誤差表示。誤差越大，準(zhǔn)確度越低。（2）精密度（precision）：表示平行測量的各測量值之間的相互接近程度,表示測量的重現(xiàn)性。用以下幾個(gè)指標(biāo)表示:A.偏差d=Xi-X平均B.平均偏差：各個(gè)偏差絕對值的平均值,即平均偏差=∑偏差/nC.相對平均偏差S=（平均偏差/X平均）×100%。D.標(biāo)準(zhǔn)偏差:各個(gè)偏差的平方值和除以樣本個(gè)數(shù)n?1，再開平方。即

（S)=[∑偏差2/（n－1）]1/2

E.相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=（標(biāo)準(zhǔn)偏差/X平均）×100%。4.準(zhǔn)確度和精密度515.提高分析準(zhǔn)確度的方法（1）選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒ú煌椒ǖ臏?zhǔn)確度和靈敏度不同。重量分析法和容量分析法靈敏度雖然不高，但對常量組分的測定可以獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果，一般相對誤差不超過千分之幾。但對于微量和痕量組分的分析，常常做不出來，談不上精確度。

儀器分析法對測定常量組分無法準(zhǔn)確，但對測定微量和痕量組分靈敏度很高，盡管相對誤差較大，但絕對誤差不大，能符合準(zhǔn)確度的要求?？傊仨毟鶕?jù)分析對象，樣品情況以及對分析結(jié)果的要求，選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒ā?.提高分析準(zhǔn)確度的方法（1）選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒?2（2）減小測量誤差為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，必須盡量減小各步的測量誤差。例如：一般分析天平的稱量誤差為+0.0001g，用減重法稱量兩次，可能引起的最大誤差是+0.0002g，為了使稱量的相對誤差小于0.1%，取樣量就不能小于0.2g。

（2）減小測量誤差53（3）消除測量中的系統(tǒng)誤差A(yù)、校準(zhǔn)儀器：對砝碼、滴定管和移液管進(jìn)行校準(zhǔn)。B、做對照實(shí)驗(yàn)：用含量已知的標(biāo)準(zhǔn)試樣或純物質(zhì)當(dāng)樣品進(jìn)行分析，由分析結(jié)果和其已知含量的差值，確定分析的誤差。C、做空白實(shí)驗(yàn)：在不加樣品的情況下，以與樣品相同的方法、步驟進(jìn)行分析，把所得的結(jié)果作為空白值從樣品分析結(jié)果中減去。這樣可以消除由于試劑不純或容器不符合要求所帶進(jìn)的誤差。（3）消除測量中的系統(tǒng)誤差546.減小滴定誤差的方法滴定分析的準(zhǔn)確度一般在0.2%左右，在滴定分析過程中要盡量減少誤差：（1）量器誤差：滴定分析中所用的滴定管、移液管和容量瓶等，如果嚴(yán)格遵守量器使用規(guī)則，一般誤差不會超過0.2%。在滴定步驟中，一般滴定管讀數(shù)可有+0.01ml的誤差，一次滴定需要讀兩次數(shù)，可能造成的最大誤差是+0.02ml。為使滴定的誤差小于0.1%，消耗滴定劑的體積最好在20ml以上。6.減小滴定誤差的方法滴定分析的準(zhǔn)確度一般在0.2%55（2）方法誤差：主要是終點(diǎn)確定的誤差。a.指示劑終點(diǎn)和化學(xué)計(jì)量點(diǎn)不符合，正確選擇指示劑可以減少這種誤差。b.滴定時(shí)，在接近化學(xué)計(jì)量點(diǎn)時(shí)要半滴半滴的加入。c.若指示劑本身是弱酸或弱堿，氧化劑或還原劑，在滴定過程中會消耗一部分標(biāo)準(zhǔn)溶液，因此，指示劑用量不宜過多。d.某些雜質(zhì)在滴定中會消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液或產(chǎn)生其它副反應(yīng)。（2）方法誤差：56

此外，有一部分由于操作的疏忽所產(chǎn)生的誤差，如：(1)由于溶液混合不勻產(chǎn)生的誤差。容量分析中所用的標(biāo)準(zhǔn)溶液和未知液必須混合均勻，否則取其一部分滴定時(shí)，這一部分的濃度不能代表整個(gè)溶液的濃度。(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液保存不當(dāng)而使?jié)舛雀淖儭?3)由于儀器洗滌不當(dāng)引起的誤差。未洗凈的儀器不但能引入雜質(zhì)，也會造成量出體積不準(zhǔn)(液面不規(guī)則和掛液滴)。所以儀器必須洗至不掛水珠。必須了解哪些儀器要用所取溶液淋洗以防濃度改變，哪些儀器則不能用溶液淋洗。(4)由于操作不當(dāng)引起的誤差。例如，滴定管漏水、未趕去氣泡、滴定速度過快、讀數(shù)方法不正確等。這些誤差只要細(xì)心操作，是可以避免的。除了上述一般誤差外，各類容量分析還有它們特殊的誤差，應(yīng)當(dāng)予以重視。

此外，有一部分由于操作的疏忽所產(chǎn)生的誤差，如：57生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)課件58

8.有效數(shù)字

有效數(shù)字是指分析工作中實(shí)際測到的數(shù)字，允許最后一個(gè)數(shù)字是可疑數(shù)，反映測量值的準(zhǔn)確度，要與測量的方法相適應(yīng)。

一般分析數(shù)據(jù)保留4位有效數(shù)字，保留的位數(shù)太多無實(shí)際意義，反而增加計(jì)算的麻煩。要注意0.0052的有效數(shù)字只有2位，3個(gè)0是用于定位的無效數(shù)字。

修約有效數(shù)字的原則是四舍六入五成雙。如23.455±0.546修約為23.46±0.55，28.445±0.675修約為28.44±0.68，要避免出現(xiàn)0.00002±0.00001之類的數(shù)字，或3658.2543±0.0058之類的數(shù)字。8.有效數(shù)字

有效數(shù)字是59五、生物化學(xué)常用緩沖液（一）基本概念

⑴Bronsted-Lowry酸堿理論（酸堿質(zhì)子理論）:1923年由丹麥化學(xué)家J.N.Brφnsted和英國化學(xué)家T.M.Lowry同時(shí)提出了酸堿質(zhì)子學(xué)說，認(rèn)為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4-等）稱為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子（如：H2O，NH3，Cl-等）稱為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質(zhì)子結(jié)合后，形成對應(yīng)的酸，稱為該堿的共軛酸。

如鹽酸在水中的解離：

HClCl-＋H+

HCl是酸，Cl-是它的共軛堿。pH=pKa+log{[質(zhì)子受體]/[質(zhì)子供體]}

五、生物化學(xué)常用緩沖液60⑵緩沖體系的設(shè)計(jì)：1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性：①pKa值在6-8之間；②在水中的溶解度高；③不易穿透生物膜；④鹽效應(yīng)小；⑤離子濃度、溶液組成和溫度對解離的影響??；⑥不與金屬離子生成復(fù)合物或沉淀；⑦該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定；⑧紫外和可見光波長范圍內(nèi)光吸收??；⑨易制得高純度的鹽。⑵緩沖體系的設(shè)計(jì)：61（二）生物化學(xué)常用緩沖液

⑴磷酸鹽緩沖液：磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級解離，有二個(gè)pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬：NaH2PO4：pKa1＝2.12，pKa2＝7.21Na2HPO4：pKa1＝7.21，pKa2＝12.32配酸性緩沖液：用NaH2PO4，pH＝1-4，配中性緩沖液：用混合的兩種磷酸鹽，pH＝6-8，配堿性緩沖液：用Na2HPO4，pH＝10-12。用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)镾DS（十二烷基硫酸鈉）會與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。（二）生物化學(xué)常用緩沖液62磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：①容易配制成各種濃度的緩沖液；②適用的pH范圍寬；③pH受溫度的影響小；④緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。其缺點(diǎn)為：①易與常見的鈣Ca++離子、鎂Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀；②會抑制某些生物化學(xué)過程，如對某些酶的催化作用會產(chǎn)生某種程度的抑制作用。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：63⑵Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液：Tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如：Tris-HCl緩沖液：pH＝7.5-8.5Tris-磷酸鹽緩沖液：pH＝5.0-9.0⑵Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液：64Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是：

①因?yàn)門ris的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；②對生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其缺點(diǎn)是：①緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1；②溫度效應(yīng)大，溫度變化對緩沖液pH值的影響很大，例如：4℃時(shí)緩沖液的pH＝8.4，而37℃時(shí)的pH＝7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0℃-4℃。③易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。④此緩沖液對某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。

Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是：65⑶有機(jī)酸緩沖液：這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH＝3.0-6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：①所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對生化反應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用；②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe3+、Zn++、Mg++等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；③這類緩沖液易與Ca++離子結(jié)合，所以樣品中有Ca++離子時(shí)，不能用這類緩沖液。⑶有機(jī)酸緩沖液：66⑷硼酸鹽緩沖液：常用的有效pH范圍是：pH＝8.5-10.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。⑷硼酸鹽緩沖液：67⑸氨基酸緩沖液：此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0-11.0，例如最常用的有：甘氨酸-HCl緩沖液：pH=2.0-5.0，甘氨酸-NaOH緩沖液：pH=8.0-11.0，甘氨酸-Tris緩沖液：pH=8.0-11.0，（廣泛使用的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液），組氨酸緩沖液：pH=5.5-6.5，

此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。

其缺點(diǎn)是：①與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過程等。②試劑的價(jià)格較高。

⑸氨基酸緩沖液：68⑹兩性離子緩沖液（Good’s緩沖液）：1960年，N.E.Good和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試劑的優(yōu)缺點(diǎn)后認(rèn)為，必須用人為設(shè)計(jì)和人工合成的方法來找到專門用于生命科學(xué)研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應(yīng)具有前面所述的幾條要求和特性。Good’s緩沖液的主要優(yōu)點(diǎn)：不參加和不干擾生物化學(xué)反應(yīng)過程，對酶化學(xué)反應(yīng)等無抑制作用，所以它們專門用于細(xì)胞器和極易變性的、對pH敏感的蛋白質(zhì)和酶的研究工作。

其缺點(diǎn)是：①價(jià)格昂貴，②對測定蛋白質(zhì)含量的雙縮脲法和Lowry法不適用，因?yàn)樗鼈儠箍瞻坠艿念伾由睢?/p>

⑹兩性離子緩沖液（Good’s緩沖液）：69六、pH值的測定測定溶液pH值通常有兩種方法，最簡便但較粗略的方法是用pH試紙，分為廣泛和精密pH試紙兩種。廣泛pH試紙的變色范圍是pH=1-14、9-14等，只能粗略確定溶液的pH值。精密pH試紙，可以較精確地測定溶液的pH值，其變色范圍是2-3個(gè)pH單位，例如有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-13.0等許多種，可根據(jù)待測溶液的酸、堿性選用某一范圍的試紙。測定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙，用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸，試紙變色后與色階板對照，估讀出所測pH值。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。六、pH值的測定測定溶液pH值通常有兩種方法，最簡70精確測定溶液pH值要使用pH計(jì)，其精確度可達(dá)0.005pH單位，關(guān)鍵是要正確選用和校對pH電極。pH計(jì)測定pH值時(shí)會有幾方面的誤差：⑴鈉離子的干擾：多數(shù)復(fù)合電極對Na+和H+都非常敏感，尤其是高pH值的堿性溶液，Na+的干擾更加明顯。⑵濃度效應(yīng)：溶液的pH值與溶液中緩沖離子濃度和其他鹽離子濃度有關(guān)，因?yàn)槿芤簆H值取決于溶液中的離子活度而不是濃度，只有在很稀的溶液中，離子的活度才與其濃度相等。稀釋后仍需對其pH進(jìn)行調(diào)整。⑶溫度效應(yīng)：有的緩沖液的pH值受溫度影響很大，如“Tris”緩沖液，因而配制和使用都要在同一溫度下進(jìn)行。

精確測定溶液pH值要使用pH計(jì)，其精確度可達(dá)0.0071第二節(jié)紫外可見分光光度法第二節(jié)紫外可見分光光度法72一、基本原理（一）Beer-Lambert定律當(dāng)一束單色光通過溶液時(shí)，由于溶液吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就會減弱。設(shè)入射光的強(qiáng)度為I0，透過濃度為c，液層厚度為b的溶液后，透射光的強(qiáng)度I必定小于I0，隨濃度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的強(qiáng)度則減小。透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值，稱為透光度(transmittance)，以T表示。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)液層厚度b和溶液濃度c按算術(shù)級數(shù)增加時(shí)，透光度T按幾何級數(shù)減小，數(shù)學(xué)式為：

A＝-lgT＝abc

A：吸光度，又稱光密度“O.D”；T：透光度，T＝I/I。；a：吸光系數(shù)（L·mol－1·cm－1）；b：樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，則b=1cm；c：樣品濃度（mol/L）。當(dāng)a、c一定時(shí)，吸光度A與液層厚度b成正比，稱為朗伯定律(Lambert′slaw)。當(dāng)a、b一定時(shí)，吸光度A與溶液濃度c成正比，稱為比爾定律(Beer′slaw)。吸光度與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，稱為朗伯—比爾定律，簡稱比爾定律，即光的吸收定律。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=abc

一、基本原理（一）Beer-Lambert定律73式中的a為比例常數(shù)，稱吸光系數(shù)，有兩種表示方式：1.摩爾吸光系數(shù),是指在一定波長時(shí)，溶液濃度為1mol/L，厚度為1cm的吸光度，用ε或EM表示。2.百分吸光系數(shù)或稱比吸光系數(shù),是指在一定波長時(shí)，溶液濃度為1%(W/V)，厚度為1cm的吸光度，用E1%1cm表示。吸光系數(shù)兩種表示方式之間的關(guān)系是：ε=Mr/10×E1%1cm摩爾吸光系數(shù)是物質(zhì)對某波長的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越強(qiáng)，相應(yīng)的分光度法測定的靈敏度就越高。ε值越大，說明電子躍遷的幾率大，通常ε＝10-105：一般認(rèn)為ε＞104為強(qiáng)吸收；ε＝103-104為較強(qiáng)吸收；ε＜102為弱吸收，此時(shí)分光光度法不靈敏。因?yàn)橥ǔＪ褂梅止夤舛扔?jì)可檢測出的最小吸光度A＝0.001,所以，當(dāng)b＝1cm,ε＝105時(shí)，可檢測的溶液最小濃度是C＝10-8mol/L。ε的值很難直接測定，通常要先測出E1%1cm再按公式計(jì)算求得。式中的a為比例常數(shù)，稱吸光系數(shù)，有兩種表示方式：74吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性：即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)ε相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定260nm的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，已知其摩爾吸光系數(shù)=8.2×103M-1cm，計(jì)算其摩爾濃度。L）?！逜＝εbC∵A＝（溶劑加樣品的吸光度）－（溶劑的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580

∵b＝1cm∴C==7.1×10-5mol/L吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性：753.影響吸光系數(shù)的因素吸光系數(shù)的大小，取決于物質(zhì)(溶質(zhì)、溶劑)的本性和光的波長。1.物質(zhì)不同，則吸光系數(shù)不同。以吸光系數(shù)可作為物質(zhì)的特性常數(shù)。在分光光度法中，常用摩爾吸光系數(shù)ε來衡量顯色反應(yīng)的靈敏度，ε值越大，靈敏度越高。2.溶劑不同，其吸光系數(shù)亦不同。所以在說明某一物質(zhì)的吸光系數(shù)時(shí)，應(yīng)注明溶劑。3.光的波長不同，其吸光系數(shù)亦不同。如將不同波長的單色光依次通過被分析物質(zhì)，分別測得吸光度，然后繪制吸光度—波長曲線，稱為吸收曲線(absorptioncurve)，又稱吸收光譜(absorptionspectrum)。由吸收曲線可以看出物質(zhì)的吸收特征。吸收曲線上有極大值的部分，稱為吸收峰。吸收峰所對應(yīng)的波長，稱為最大吸收波長，以符號λmax表示，這是物質(zhì)定性的依據(jù)之一。物質(zhì)的定量也常選擇在λmax處測定其吸光度，因?yàn)樵诖颂帨y定的靈敏度最高。4.單色光的純度也影響吸光系數(shù)。單色光越純，即經(jīng)單色器分光后的波長范圍越窄，其吸光系數(shù)越大。嚴(yán)格說來，朗伯—比爾定律只有當(dāng)入射光是單色光時(shí)才完全適用，但實(shí)際上不管儀器中光學(xué)系統(tǒng)的質(zhì)量怎樣高，單色化以后的光還是具有一定的寬度，這取決于儀器的精確程度。濾光片的分光本領(lǐng)較差，故一般測得的吸光系數(shù)要比真值小得多。3.影響吸光系數(shù)的因素吸光系數(shù)的大小，取決于物質(zhì)(溶質(zhì)76二、分光光度計(jì)的主要部件1.光源：理想光源的條件是：①能提供連續(xù)的輻射；②光強(qiáng)度足夠大；③在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長有明顯變化；④光譜范圍寬；⑤使用壽命長，價(jià)格低。用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogenlamp），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長范圍是320-1100nm。由于能量輸出的波動為電壓波動的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuteriumlamp），適用波長范圍是195-400nm，由于氘燈壽命有限，國產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時(shí)左右，要注意節(jié)約燈時(shí)。

二、分光光度計(jì)的主要部件772.單色器：單色器是分光光度計(jì)的心臟部分，它的作用是把來自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長。它的主要組成部件和作用是：①入射狹縫:限制雜散光進(jìn)入。②色散元件:即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。③準(zhǔn)直鏡:把來自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。④出射狹縫:只讓額定波長的光射出單色器。轉(zhuǎn)動棱鏡或光柵的波長盤，可以改變單色器出射光束的波長；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。2.單色器：78⑶樣品室:包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為0.1℃，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達(dá)0.05℃。吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學(xué)玻璃杯因?yàn)槠胀ü鈱W(xué)玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見光，適用波長范圍是400nm-2000nm。石英玻璃杯可透過紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm-3000nm。⑶樣品室:79吸收池使用注意事項(xiàng)：①要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時(shí)可放在1％洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時(shí)用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個(gè)小刷子清洗杯子。②嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。③嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。吸收池使用注意事項(xiàng)：804.檢測器:檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強(qiáng)度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電二極管等三種。①光電管：光電管可檢測10微微安（10-11A）的光電流，管內(nèi)抽真空充入惰性氣體.②光電倍增管：它是檢測弱光的最靈敏最常用的光電元件，其靈敏度比光電管高200多倍，光電子由陰極到陽極重復(fù)發(fā)射9次以上，每一個(gè)光電子最后可產(chǎn)生106-107個(gè)電子，因此總放大倍數(shù)可達(dá)106-107倍，光電倍增管的響應(yīng)時(shí)間極短，能檢測10-8-10-9秒級的脈沖光。其靈敏度與光電管一樣受到暗電流的限制，暗電流主要來自陰極發(fā)射的熱電子和電極間的漏電。③光電二極管：其原理是這種硅二極管受紫外-近紅外輻射照射時(shí)，其導(dǎo)電性增強(qiáng)的大小與光強(qiáng)或正比。近年來分光光度計(jì)使用光電二極管作檢測器在增加，雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定性更好，使用壽命更長，價(jià)格便宜，因而許多著名品牌的高檔分光光度計(jì)都在使用它作檢測器。

4.檢測器:815.顯示裝置:低檔分光光度計(jì)現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機(jī)?，F(xiàn)代高性能分光光度計(jì)均可以連接微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)，有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便。5.顯示裝置:82三、分光光度法的定性與定量方法（一）定性方法：

一系列不同波長的單色光照射待測溶液，可測的一系列相應(yīng)的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)作圖，可以得到待測物質(zhì)的吸收曲線。通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較而定性。實(shí)際工作中常用λmax和ε來定性，λmax可以從吸收曲線中吸收峰所對應(yīng)的波長直接找出；ε通常需配置待測物質(zhì)三種不同濃度的溶液，在1cm的吸收池中，在λmax處分別測定其吸光度，根據(jù)A=εbc,即ε=A/bc，計(jì)算出ε，將三次結(jié)果平均，即是該物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)。三、分光光度法的定性與定量方法83從吸受光譜中初步推斷官能團(tuán)：一個(gè)化合物在220-800nm范圍內(nèi)無吸收（ε<1），它可能是脂肪族飽和碳?xì)浠衔铩⒋?、醚、羧酸、胺等，不含直鏈或環(huán)狀共軛體，沒有醛、酮等基團(tuán)。在210-250nm有吸收帶，可能含量2個(gè)共軛單位250-300nm有弱吸收帶，表示有羰基存在。異構(gòu)體的推定：許多異構(gòu)體可以利用雙鍵位置不同，通過紫外吸收光譜推斷異構(gòu)體結(jié)構(gòu)?；衔锕羌艿耐贫ǎ何粗衔锱c已知化合物的紫外吸收光譜一致時(shí)，可以認(rèn)定兩者具有同樣的發(fā)色團(tuán)。通過這個(gè)原理可以推定未知化合物的骨架。從吸受光譜中初步推斷官能團(tuán)：84（二）定量方法：根據(jù)比爾定律，物質(zhì)在一定波長處的吸光度與濃度之間有線性關(guān)系。因此，只要選擇一定的波長測定溶液的吸光度，即可求出濃度。1.吸光系數(shù)法（絕對法）：根據(jù)比爾定律A=εcl，若l和吸光系數(shù)ε或E1%1cm已知，即可根據(jù)測得的A，求出被測物的濃度。

C=A/εl

通常ε或E1%1cm可以在手冊或文獻(xiàn)中查到。示例見課本P10.（二）定量方法：852.標(biāo)準(zhǔn)曲線法:在有些情況下，如單色光不純等情況，測得的吸光值隨所用儀器不同而有相當(dāng)大的變化。若此時(shí)用吸光系數(shù)換算成濃度，將產(chǎn)生很大的誤差。但如果只用一臺固定的儀器，則可認(rèn)定在固定的工作狀態(tài)和測定條件下，濃度與吸光度之間的關(guān)系在許多情況下是線性關(guān)系或接近于線性關(guān)系。

A=KC(K只為比例常數(shù)，而非物質(zhì)常數(shù)）依據(jù)上式的關(guān)系進(jìn)行定量是分光光度法中比較簡便易行的方法。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法:86標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）在測定條件相同的情況下，分別測定其吸光度。（3）以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（不必考慮顯色劑等引起的濃度變化），以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖。（4）在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。AC0AxCx如Folin酚試劑法(Lowry法)測定蛋白質(zhì)含量取14只試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(250μg/mL)，用水補(bǔ)足到1mL，加入5mL試劑甲，混勻，于20-25℃放置10分鐘。再加入0.5mL試劑乙(Folin氏試劑)，立即振搖均勻，在20-25℃保溫30分鐘，然后于500nm處比色。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量的依據(jù)。橫坐標(biāo)的蛋白質(zhì)濃度分別為0，25，50，100，150，200，250，單位為μg/mL，不可將上述數(shù)字再除以6.5，將數(shù)字變成一個(gè)小數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作AC0AxCx如Folin酚試劑法(Lowr873.對照法:在同樣條件下配置標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，在選定波長處，分別測量吸光度，根據(jù)定律

A標(biāo)=EC標(biāo)lA樣=EC樣l在同種物質(zhì)、同臺儀器及同一波長測定的條件下l和E均為定值，所以：

A標(biāo)/A樣=C標(biāo)/C樣C樣=C標(biāo)·（A樣/A標(biāo)）3.對照法:88四、減小測定誤差的方法1.選擇合適的顯色劑，使顯色反應(yīng)的靈敏度高、選擇性好、顯色產(chǎn)物穩(wěn)定。2.通過條件試驗(yàn)，找出最佳的試劑加入量、酸度、溫度和顯色時(shí)間。并使樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在盡可能完全相同的條件下進(jìn)行測定。3.通過加掩蔽劑和控制pH值，消除共存離子的干擾。4.盡可能在吸光度0.1-1.0范圍內(nèi)測定，以減小吸光度誤差。A<0.1的溶液，盡量用摩爾吸光系數(shù)大的顯色反應(yīng)，在最大吸收波長出進(jìn)行測定，吸收池厚度大一些，溶液可通過萃取、濃縮、增大取樣量來增加吸光度。A>1.0的溶液，可通過稀釋或用薄的吸收池來降低吸光度。5.減小儀器誤差。用穩(wěn)壓器穩(wěn)定電源以使入射光強(qiáng)度保持不變；吸收池厚度應(yīng)一致，透光性好，不要用手摸透光面；吸收池與入射光線應(yīng)垂直，否則會因光程增大而發(fā)生誤差。

四、減小測定誤差的方法1.選擇合適的顯色劑，使顯色反89第三節(jié)熒光分析法第三節(jié)熒光分析法90一.基本原理1.基本概念某些物質(zhì)被一定波長的光照射時(shí)，其分子吸收能量，會在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出波長比入射光長的光，這種光就稱為熒光。1852年，Stokes闡明了熒光發(fā)射的機(jī)制，認(rèn)為熒光是由于物質(zhì)吸收了光能而重新發(fā)出的波長不同的光，并由一種能發(fā)熒光的礦物

螢石(fluospar)而定名為熒光。我們通常所說的熒光，是指物質(zhì)在吸收紫外光后發(fā)出的波長較長的紫外熒光或可見熒光，以及吸收波長較短的可見光后發(fā)出波長較長的可見熒光。除了紫外熒光和可見熒光，還有紅外熒光、X射線熒光等。根據(jù)熒光的光譜和熒光強(qiáng)度，對物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的方法，稱為熒光分析法(fluoresc-enceanalysis)。一.基本原理912.熒光分析法的特點(diǎn)：（1）熒光光譜第一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、需樣量少：由于熒光輻射的波長比激發(fā)光波長長，因此測量到的熒光頻率與入射光的頻率不同。另外，由于熒光光譜是發(fā)射光譜，可以在與入射光成直角的方向上檢測，這樣，熒光不受來自激發(fā)光的本底的干擾，靈敏度大大高于紫外-可見吸收光譜，測量用的樣品量很少，且測量方法簡便。（2）熒光光譜第二個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是信息量大：熒光光譜能提供較多的信息，例如激發(fā)譜、發(fā)射譜、峰位、峰強(qiáng)度、熒光壽命等。熒光光譜還可以檢測一些紫外-可見吸收光譜檢測不到的時(shí)間過程過程。熒光產(chǎn)生包括兩個(gè)過程：吸收以及隨之而來的發(fā)射。兩個(gè)過程中有一個(gè)時(shí)間延擱，大約為10-9秒，由于熒光有一定的壽命，因此可以檢測一些時(shí)間過程與其壽命相當(dāng)?shù)倪^程。例如，生色團(tuán)及其環(huán)境的變化過程在紫外吸收的10-15秒的過程中基本上是靜止不變的，因此無法用紫外吸收光譜檢測，但可以用熒光光譜檢測。2.熒光分析法的特點(diǎn)：923.熒光的產(chǎn)生：

在室溫下分子大都處在基態(tài)的最低振動能級，當(dāng)受到光的照射時(shí)，便吸收與它的特征頻率相一致的光線，其中某些電子由原來的基態(tài)能級躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)中的各個(gè)不同振動能級，這就是在分光光度法中所述的吸光現(xiàn)象。吸收外來光子后被激發(fā)到激發(fā)態(tài)的分子，可以通過多種途徑丟失能量，回到基態(tài)，這種過程稱為弛豫。在很多情況下，分子回到基態(tài)時(shí)，能量通過熱量等形式散失到周圍。但是在某些情況下，能量能以光子發(fā)射的形式釋放出來。如果能量以光子形式釋放，則放出的光稱為熒光。這個(gè)過程通常發(fā)生在10-6-10-9秒內(nèi)。3.熒光的產(chǎn)生：93由于熒光的頻率低于入射光的頻率，因此測量到的熒光頻率與入射光的頻率不同。同時(shí)，作為發(fā)射光，熒光是從與入射光成直角的方向上檢測。這樣，熒光不受來自激發(fā)光的本底干擾，可以達(dá)到很高的靈敏度，一般比吸收光譜高兩個(gè)數(shù)量級左右。此外，由于熒光有一定的壽命，且其壽命比紫外吸收的時(shí)間過程(10-15秒)要長，因此一些用紫外觀測不到的變化過程(如生色團(tuán)及其環(huán)境的變化)，恰好可以用熒光來觀測。在紫外吸收的時(shí)間過程(10-15秒)中，生色團(tuán)及其環(huán)境基本上是靜止不變的。而在很多反應(yīng)中，溶劑的重新排列和分子的運(yùn)動過程發(fā)生的時(shí)間與激發(fā)態(tài)的壽命是同一數(shù)量級。由于熒光的頻率低于入射光的頻率，因此測量到的熒光頻率944.激發(fā)譜和發(fā)射譜：熒光光譜包括激發(fā)譜和發(fā)射譜兩種。

激發(fā)譜：是熒光物質(zhì)在不同波長的激發(fā)光作用下測得的某一波長處的熒光強(qiáng)度的變化情況，也就是不同波長的激發(fā)