基因工程基因操作的工具酶

3.3DNA聚合酶DNA聚合酶：能夠催化脫氧核糖核苷酸連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的游離3’-OH末端，使核苷酸發(fā)生聚合作用，而不從模板上解離。反應(yīng)特點(diǎn)：(1)以四種三磷酸脫氧核糖核苷（dNTP）為底物(2)反應(yīng)需要模板的指導(dǎo)，加入的核苷酸由模板鏈所決定(3)聚合反應(yīng)需要有引物存在，且引物要有3’-OH游離基團(tuán)(4)DNA鏈的生長(zhǎng)方向?yàn)?’3’(5)產(chǎn)物DNA鏈的性質(zhì)與模板相同（半保留復(fù)制）

DNA聚合酶只能在已有的核酸鏈上延伸DNA鏈，而不能從無(wú)到有開始DNA鏈的合成。種類：到目前為止，已從E.coli中發(fā)現(xiàn)了PolI、PolII、PolIII三種DNA聚合酶。其中PolI和PolII的主要功能是參與DNA的修復(fù)過(guò)程，PolIII與DNA的復(fù)制有關(guān)。三種聚合酶中，只有PolI同分子克隆關(guān)系密切。3.3.1大腸桿菌DNA聚合酶I（E.coliDNAPolI）

DNAPolI是從大腸桿菌細(xì)胞中分離得到的，該酶是由單一多肽組成的球蛋白，MW=109000，直徑=65?DNAPolI已得到高度純化，從100kg大腸桿菌中可以分離到約500mg純化的酶蛋白。每個(gè)成熟的大腸桿菌細(xì)胞中約有400個(gè)分子的PolI。1.DNAPolI在空間結(jié)構(gòu)上有三個(gè)位點(diǎn)：(1) DNA模板結(jié)合位點(diǎn)——結(jié)合模板(2) 核苷酸-磷酸結(jié)合位點(diǎn)——結(jié)合引物(3) dNTP結(jié)合位點(diǎn)——結(jié)合底物2.DNAPolI是一種多功能酶：(1)5’3’的聚合酶活性催化單核苷酸逐個(gè)地結(jié)合到DNA模板的3’-OH末端，沿著引物的3’-OH方向按模板順序從5’3’延伸。每分子DNApolI每分鐘可以催化約1000個(gè)核苷酸的聚合。(2)5’3’的外切酶活性只作用于雙鏈DNA（dsDNA），從5’端切割下一個(gè)個(gè)單核苷酸。(3)3’5’的外切酶活性能從游離的3’末端降解單鏈DNA（ssDNA）成為單核苷酸，通常對(duì)雙鏈DNA不作用。在正常聚合條件下，該酶對(duì)dsDNA的3’5’外切酶活性受到5’3’聚合酶活性的抑制。但一旦出現(xiàn)錯(cuò)配堿基時(shí)，聚合反應(yīng)立即停止，由3’5’外切酶迅速除去錯(cuò)誤進(jìn)入的核苷酸，然后聚合反應(yīng)才得以繼續(xù)進(jìn)行下去。所以3’5’核酸外切酶活力被認(rèn)為起著校對(duì)功能，對(duì)DNA復(fù)制的忠實(shí)性極為重要。3.E.coliDNAPolI在基因工程中的用途:(1)可用于填補(bǔ)dsDNA上的缺口，以便有效地進(jìn)行DNA重組(2)用于DNA序列分析(3)用于制備DNA探針在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶I的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個(gè)5’核苷酸后，聚合作用就會(huì)在缺口的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，5’一側(cè)的核苷酸不斷地被移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序地增補(bǔ)，于是缺口便沿著DNA分子按合成的方向移動(dòng)——缺口平移（NickTranslation）。應(yīng)用缺口平移法制備DNA雜交探針，其典型的反應(yīng)體系是：在25

l總體積中含有1g純化的特定的DNA片段，并加入適量的DNaseI、polI、32PdNTP和未標(biāo)記的dNTP。

脫氧核糖核苷酸酶I（DNaseI）是一種內(nèi)切酶，它能夠水解單鏈或雙鏈DNA，形成帶有5’-磷酸末端的單（寡）核苷酸。

由于32PdNTP比較較昂貴，所以以一般都采用用低濃度的32PdNTP（2mol/L））和高濃度的的未標(biāo)記的dNTP（20mol/L））。而且就大大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的的要求，使用用一種32PdNTP就足足夠了，其他他3種均可采采用未標(biāo)記的的dNTP，，或是用適量量的未標(biāo)記的的dNTP稀稀釋每種32PdNTP。改變反應(yīng)體系系中DNaseI的數(shù)數(shù)量，可以控控制32PdNTP的參參入程度，一一般希望有30%左右的的32PdNTP參入入DNA鏈。。大大腸桿菌DNA聚合酶酶I的Klenow片片段（E.coliDNAPolIKlenowfragment））用蛋白酶將DNAPolI作作有限水解，，可得到分子子量為75000dal和36000dal的兩個(gè)片片段，大片段段即稱為Klenow片片段，它具有有5’3’的聚合酶酶活性和3’’5’的核酸外外切酶活性，，但失去了全全酶的5’3’的核酸外外切酶活性。。Klenow聚合酶可以以標(biāo)記DNA片段末端（（5’延伸末末端）。對(duì)于限制性核核酸內(nèi)切酶EcoRI切割后形成的的5’延伸末末端可用32PdATP標(biāo)記記：而BamHI切割后形成成的5’延伸伸末端可用32PdGTP標(biāo)記記：4DNA聚合酶酶是從T4噬菌體感染的的大腸桿菌中中分離純化的的一種特殊的的DNA聚合合酶。1.T4DNA聚合酶酶也是一種多多功能酶：(1)5’’3’的聚合酶酶活性(2)3’’5’的外切酶酶活性其外切酶活性性比E.coliDNAPolI的的活性高200倍。(3)取代反應(yīng)活性性如果在反應(yīng)混混合物中僅存存在一種dNTP，則此此酶的3’5’外切酶活活性將從dsDNA的的3’末端降降解，直到互互補(bǔ)于這個(gè)dNTP的堿堿基出現(xiàn)為止止，然后在這這一位置發(fā)生生取代反應(yīng)。。2.T4DNA聚合酶酶在基因工程程中的應(yīng)用(1)以填填充反應(yīng)標(biāo)記記帶有5’延延伸末端的dsDNA片片段(2)將將DNA的的3’’延伸伸末端端切成成平末末端(3)以以取代代反應(yīng)應(yīng)標(biāo)記記帶有有3’’延伸伸末端端或平平末端端的dsDNA片段段(4)以以部分分消化化dsDNA法法標(biāo)記記DNA片片段作作為雜雜交探探針（（鏈特特異的的探針針）逆逆轉(zhuǎn)錄錄酶是一種種有效效的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄RNA成為為DNA的的酶，，又稱稱RNA依依賴的的DNA聚聚合酶酶，其其產(chǎn)物物DNA稱稱cDNA，即即互補(bǔ)補(bǔ)DNA。。1.逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶酶也是是一個(gè)個(gè)多功功能酶酶：(1)RNA依賴賴的DNA聚合合酶以RNA鏈鏈為模模板，，以帶帶有3’-OH末端端的DNA片段段為引引物，，沿5’3’方方向合合成DNA鏈。。幾乎所所有真真核生生物的的mRNA分子子3’’末端端都有有一段段PolyA，故故加入入寡聚聚dT后，，mRNA就可可以成成為逆逆轉(zhuǎn)錄錄酶很很好的的模板板，由由此可可合成成cDNA。(2)DNA依賴賴的DNA聚合合酶以ssDNA為為模板板，以以帶有有3’’-OH末末端的的DNA片片段為為引物物，沿沿5’’3’方方向合合成DNA鏈。?？稍谛滦潞铣沙傻腄NA鏈上上合成成另一一條互互補(bǔ)DNA。(3)外外切RNA酶活活性底物是是RNA-DNA雜雜交分分子中中的RNA鏈，，其水水解方方向有有兩種種：*從從RNA鏈鏈5’末末端外外切：：稱5’3’外外切RNA酶*從從RNA鏈鏈3’末末端外外切：：稱3’5’外外切RNA酶2.逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶在在基基因因工工程程中中的的應(yīng)應(yīng)用用：：主要要用用途途是是轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄真真核核生生物物的的mRNA成成為為cDNA，，從從而而制制備備基基因因片片段段。。3.商商品品化化的的逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶有有兩兩種種：：(1)禽禽成成髓髓細(xì)細(xì)胞胞瘤瘤病病毒毒（（AMV））逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶(2)Moloney鼠鼠白白血血病病病病毒毒（（Mo-MLV））逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶AMV逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶雖雖能能更更有有效效地地拷拷貝貝復(fù)復(fù)雜雜的的mRNA，，但但它它有有很很強(qiáng)強(qiáng)的的外外切切RNA酶酶活活性性。。而而Mo-MLV逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶的的外外切切RNA酶酶活活性性較較弱弱，，更更有有利利于于制制備備全全長(zhǎng)長(zhǎng)的的cDNA。。兩種種逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶均均無(wú)無(wú)3’’5’外外切DNA酶活活性，，故不不具備備校對(duì)對(duì)功能能，在在高濃濃度dNTP和和Mn2+存在下下，容容易出出現(xiàn)核核苷酸酸錯(cuò)誤誤摻入入。3.4DNA和RNA的修修飾酶酶核核酸酶酶SI1.作作用特特點(diǎn)：：此酶是是從米米曲霉霉（Aspergillusoryzae）中提提取的的，可可降解解ssDNA或或ssRNA，，又稱稱單鏈鏈特異異性酶酶，其其降解解產(chǎn)物物是5’-磷酸酸末端端的單單或寡寡核苷苷酸片片段。。核酸酶酶SI對(duì)DNA底物物的活活性比比對(duì)RNA強(qiáng)。。高濃濃度的的核酸酸酶SI可可從缺缺口（（nick）或或小裂裂縫（（gap））處降降解dsDNA。2.作作用用條件件：需要Zn2+作為輔輔助因因子，，最適適pH是4.5，這這是與與基因因工程程的其其它工工具酶酶不同同的兩兩個(gè)特特點(diǎn)。。3.在在基基因工工程中中的應(yīng)應(yīng)用：：由于核核酸酶酶SI能從從DNA片片段中中切除除單鏈鏈尾巴巴，因因而在在質(zhì)粒粒的重重建和和DNA重重組中中被廣廣泛使使用。。切除單單鏈粘粘性末末端，，產(chǎn)生生平末末端，，再用用T4連接酶酶連接接。切除cDNA的的發(fā)夾夾結(jié)構(gòu)構(gòu)。末末端脫脫氧核核苷酸酸轉(zhuǎn)移移酶1.作作用用特點(diǎn)點(diǎn)：此酶是是從小小牛胸胸腺中中提取取的，，可催催化單單核苷苷酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到到另一一個(gè)DNA分子子的3’-OH末端端上，，不需需要模模板，，其引引物是是帶3’-OH末端端的ssDNA（（Mg2+為輔因因子））。平平末端端的dsDNA只有有CO2+存在時(shí)時(shí)才能能作引引物。。2.在基基因工程中中的應(yīng)用：：在連接平末末端DNA片段時(shí)加加上互補(bǔ)的的同源多聚聚物（同聚聚物加尾法法）。3.4.3外核酸酸酶III1.作用用特點(diǎn)：此酶是從E.coli中分離得到到的，是一一種從dsDNA的的3’-OH末端降降解產(chǎn)生5’單核苷苷酸的外切切酶。2.在基基因工程中中的應(yīng)用：：產(chǎn)生具有5’延伸末末端的DNA片段制備特異的的DNA探探針3.4.4外核酸酸酶Bal311.作用用特點(diǎn)：此酶是從乳乳白短桿菌菌（Brevibaceriumaldidum）中提取的的。能以漸漸進(jìn)的方式式從線型DNA分子子的3’，，5’兩端端同時(shí)降解解，產(chǎn)物是是單核苷酸酸或寡核苷苷酸片段。。底物可以以是帶延伸伸末端或是是平末端的的dsDNA，對(duì)3’、5’’兩端的降降解速度相相同。2.作用用條件：降解時(shí)需要要Ca2+作輔助因子子，以EDTA作螯螯合劑，可可使Bal31失失活。3.在基基因工程中中的應(yīng)用：：可用于組建建DNA的的物理圖譜譜，以及造造成克隆DNA分子子的末端缺缺失。3.4.5T4多核苷酸激激酶1.作用用特點(diǎn)：此酶是從噬噬菌體T4感染的E.coli中分離的。。能催化ATP的γγ-磷酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’’-OH末末端上。2.在基基因工程中中的應(yīng)用：：可用于缺乏乏5’-磷磷酸的待連連接DNA片段的5’端磷酸酸化：反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄mRNA生成的的cDNA、人工合合成的DNA片段及及PCR擴(kuò)擴(kuò)增得到的的DNA都都缺少5’’-磷酸基基，在與克克隆載體連連接之前，，需用T4多核苷酸激激酶將DNA的5’’-磷酸化化。3.4.6堿性磷磷酸化酶（（堿性磷酸酸酯酶）1.作用用特點(diǎn)：從細(xì)菌中分分離的堿性性磷酸化酶酶簡(jiǎn)稱BAP，從小小牛腸中分分離的簡(jiǎn)稱稱CAP。。它能特異異性地切去去DNA或或RNA的的5’-磷磷酸。底物物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也也可以是核核糖或脫氧氧核糖核苷苷三磷酸。。2.在基基因工程中中的應(yīng)用：：在用32P標(biāo)記DNA的5’’末端之前前，除去磷磷酸。在DNA重重組技術(shù)中中，除去DNA片段段的5’-磷磷酸，阻阻止質(zhì)粒粒自身環(huán)環(huán)化，提提高轉(zhuǎn)化化效率。。形成帶有有兩個(gè)缺缺口的開開環(huán)分子子，由于于環(huán)狀DNA（（即使是是有缺口口的環(huán)狀狀DNA）的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效率率比線狀狀質(zhì)粒DNA片片段高得得多，因因此絕大大多數(shù)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子都都含有重重組質(zhì)粒粒，并且且這樣的的缺口在在寄主細(xì)細(xì)胞內(nèi)可可自行補(bǔ)補(bǔ)上。9、靜夜四無(wú)鄰鄰，荒居舊業(yè)業(yè)貧。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃葉樹樹，燈下白頭頭人。。05:56:0405:56:0405:5612/23/20225:56:04AM11、以我我獨(dú)沈沈久，，愧君君相見見頻。。。12月月-2205:56:0405:56Dec-2223-Dec-2212、故人江海海別，幾度度隔山川。。。05:56:0405:56:0405:56Friday,December23,202213、乍乍見見翻翻疑疑夢(mèng)夢(mèng)，，相相悲悲各各問(wèn)問(wèn)年年。。。。12月月-2212月月-2205:56:0405:56:04December23,202214、他他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生生白白發(fā)發(fā)，，舊舊國(guó)國(guó)見見青青山山。。。。23十十二二月月20225:56:04上上午午05:56:0412月月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月225:56上上午12月-2205:56December23,202216、行動(dòng)動(dòng)出成成果，，工作作出財(cái)財(cái)富。。。2022/12/235:56:0405:56:0423December202217、做前，能夠夠環(huán)視四周；；做時(shí)，你只只能或者最好好沿著以腳為為起點(diǎn)的射線線向前。。5:56:04上午5:56上上午05:56:0412月-229、沒有有失敗敗，只只有暫暫時(shí)停停止成成功?。?。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、很多多事情情努力力了未未必有有結(jié)果果，但但是不不努力力卻什什么改改變也也沒有有。。。05:56:0405:56:0405:5612/23/20225:56:04AM11、成功就就是日復(fù)復(fù)一日那那一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小努努力的積積累。。。12月-2205:56:0405:56Dec-2223-Dec-2212、世間成成事，不不求其絕絕對(duì)圓滿滿，留一一份不足足，可得得無(wú)限完完美。。。05:56:0405:56:0405:56Friday,December23,202213、不知香積寺寺，數(shù)里入云云峰。。12月-2212月-2205:56:0405:56:04December23,202214、意志堅(jiān)強(qiáng)的的人能把世界界放在手中像像泥塊一樣任任意揉捏。23十二月月20225:56:04上午05:56:0412月-2215、楚塞三湘接接，荊門九派派通。。。十二月225:56上上午12月-2205:56December23,202216、少年十五二二十時(shí)，步行行奪得胡馬騎騎。。2022/12/235:56:0405:56:0423December202217、空空山山新新雨雨后后，，天天氣氣晚晚來(lái)來(lái)秋秋。。。。5:56:04上上午午5:56上上午午05:56:0412月月-229、楊楊柳柳散散和和風(fēng)風(fēng)，，青青山山澹澹吾吾慮慮。。。