雙熒光素報告系統(tǒng)課件

RNAi(RNAinterference)即RNA干涉，是由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。在RNAi研究中，我們可以人工合成特定的dsRNA，對目的基因進行干涉。但設(shè)計的dsRNA不同，實際干涉效果差異很大。所以有時候就需要篩選dsRNA片斷。

PsiCHECK載體將RNAi與熒光素酶發(fā)光相偶聯(lián)：當RNAi有效時，轉(zhuǎn)錄的熒光素酶RNA將被降解，無發(fā)光反應(yīng)；當RNAi無效時，轉(zhuǎn)錄的熒光素酶RNA將翻譯為熒光素酶，并參與發(fā)光反應(yīng)。通過檢測發(fā)光即可反應(yīng)RNAi的效果。

以PsiCHECK-2載體為例：將RNAi的靶片段插入到hRlu片段下游的多克隆位點中，然后將構(gòu)建好的載體與特定的dsRNA片段或能轉(zhuǎn)錄dsRNA的載體共轉(zhuǎn)染進細胞；轉(zhuǎn)然后，細胞培養(yǎng)一定時間，裂解細胞使用發(fā)光檢測的方法檢測熒光素酶的表達情況。

RNA干涉（RNAi）效率發(fā)光法檢測

雙報告基因用于實驗系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測,通常一個報告基因作為內(nèi)對照,使另一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達時雙報告基因通常用來瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞，帶有實驗報告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報告基因作為對照的第二個載體。通常實驗報告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動子,研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報告基因表達活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照,使測試不被實驗條件變化所干擾。通過這種方法,可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實驗準確性,比如,培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別,細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。

此前使用螢火蟲熒光素酶，可以結(jié)合氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),β-半乳糖苷酶(β-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)作為雙報告基因。但CAT、β-Gal等的檢測方式復(fù)雜，且靈敏度和可檢測范圍較差，作為內(nèi)參不是很理想。

而使用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶作為雙報告基因有多種好處：

螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶反應(yīng)都為發(fā)光反應(yīng)，檢測方式一致

兩種反應(yīng)檢測靈敏度與檢測范圍近似，可以檢測到更小的量和更大的范圍

兩種發(fā)光反應(yīng)底物不同，不會相互影響

通過方法將兩個檢測串聯(lián)起來，實現(xiàn)同一樣品，兩步檢測，得到兩個檢測結(jié)果。雙熒光素酶報告基因發(fā)光檢測原理：

參考文獻：Kumar,R.,Conklin,D.S.andMittal,V.(2003)High-throughputselectionofeffectiveRNAiprobesforgenesilencing.GenomeRes.13,2333–40.Brummelkamp,T.R.,Bernards,R.andAgami,R.(2002)AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancell.Science296,550–3.miRNA靶基因驗證服務(wù)

一個miRNA對應(yīng)一個基因的費用如下，周期30個工作日靶基因3'UTR是否受miRNA調(diào)控，最直接的證據(jù)可來自于熒光素酶報告系統(tǒng)驗證。雙熒光報告基因檢測系統(tǒng)構(gòu)建包含您所要研究的靶基因3'UTR區(qū)域，并結(jié)合miRNAmimics或inhibitor，進行靶點驗證及鑒定，快速，準確。服務(wù)流程優(yōu)惠價miRNA生物信息學(xué)分析免費靶基因3'UTR雙熒光素酶野生型載體構(gòu)建（3'UTR長度<1kb）2500元靶基因3'UTR雙熒光