醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)

顯微鏡下可見雞血細(xì)胞為橢圓形，有核。白細(xì)胞數(shù)量少，為圓形。3.觀察平滑肌分離裝片低倍鏡下觀察平滑肌分離裝片，可見染成紫紅色呈紡錘形點肌細(xì)胞，細(xì)胞核為橢圓形，位于細(xì)胞的中央，著色很深，在細(xì)胞質(zhì)中有淡紅色的肌原纖維。低倍鏡觀察油鏡下作業(yè)1.思考題為什么使用高倍鏡或油鏡必須從低倍鏡到高倍鏡或從低倍鏡到油鏡的順序進行?如果高倍鏡下找不到物象，應(yīng)從哪些方面找原因，如何解決?2.繪圖截取40×或者油鏡100×下雞紅細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的圖。

實驗三細(xì)胞器的光鏡切片觀察一、實驗?zāi)康挠^察細(xì)胞器中光學(xué)顯微鏡下的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)二、實驗內(nèi)容兩種細(xì)胞器的光鏡切片高爾基復(fù)合體的觀察脊神經(jīng)節(jié)以硝酸鈷固定，再經(jīng)硝酸銀染液浸染制成永久制片。高爾基復(fù)合體能與硝酸銀作用，并具有還原能力，使硝酸銀呈現(xiàn)棕黑色沉淀顏色反應(yīng)，因而顯示高爾基復(fù)合體的形態(tài)和位置。方法：低倍鏡觀察：尋找圓形或橢圓形的被染成黃色或淡黃色的細(xì)胞；轉(zhuǎn)換高倍鏡：中央透亮區(qū)為核所在位置，核周圍棕褐色扭曲呈線狀、顆粒狀結(jié)構(gòu)即為高爾基復(fù)合體。線粒體的觀察原理肝、腎組織細(xì)胞富含線粒體，以重鉻酸鉀固定，再經(jīng)鐵蘇木精染色，制成永久制片。線粒體有雙層膜結(jié)構(gòu)，蛋白、磷脂含量很高，有大量羧基和磷酸基等陰離子基團，含陽離子的鐵蘇木精易與其結(jié)合，使線粒體顯示蘭色反應(yīng)。方法低倍鏡觀察：可見許多被染成深蘭色的細(xì)胞，選擇顏色清晰，密集程度較低的區(qū)域；轉(zhuǎn)換高倍鏡：細(xì)胞核為1-2圓形的不著色的區(qū)域（有深蘭色的核仁），核周圍分布有許多深蘭色顆粒或桿狀小體，即線粒體。附：生物學(xué)實驗繪圖方法與要求繪圖時生物學(xué)實驗報告點一種重要形式，其基本要求如下：1.準(zhǔn)備好3H鉛筆、橡皮、刀、尺子及繪圖紙，將繪圖紙放在觀察物的右邊，紙下不要墊書或紙張。2.繪圖時，特別注意觀察物的形狀、各部分點位置、比例和毗鄰關(guān)系。3.圖點位置、大小要適宜，圖占報告紙左上方2/3點面積，并考慮注字點位置。4.觀察清楚后，選擇典型的細(xì)胞或者組織，左眼看顯微鏡，右眼配合左眼，先用鉛筆在紙上輕輕描出輪廓，使形態(tài)正確，然后再用清晰的線條繪出，線條粗細(xì)要均勻不要重復(fù)。5.用圓點表示明暗和立體感，點的點大小要均勻，不能涂陰影。6.圖繪好后，要在圖點右側(cè)注明各部分結(jié)構(gòu)名稱，引線要直而平行，長短適度，各引線不能交叉，各線右端上下對齊，注字要用正楷，不能潦草，要自左向右寫。7.每一個圖下面要注明圖的點名稱、放大倍數(shù)。8.繪圖紙上所有注字（包括姓名、實驗日期、題目等）均用鉛筆書寫，不能用其他筆寫。作業(yè).繪圖截取40×或者油鏡100×下高爾基體和線粒體

實驗四動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動物體內(nèi)的組織(或器官)取出，模擬動物體內(nèi)的生理條件，在體外進行培養(yǎng)。使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細(xì)胞的生長、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過程的生命現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對細(xì)胞生長發(fā)育和分化等的影響；二是細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞骨架等)、細(xì)胞生長及發(fā)育等過程的觀察。因而細(xì)胞培養(yǎng)是探索和指示細(xì)胞生命活動規(guī)律的—種簡便易行的實驗技術(shù)，同時我們也不可忽略的另一個因素，那就是它脫離了生物機體后的—些變化。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等Ⅰ清洗與滅菌一、實驗?zāi)康?.了解細(xì)胞原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)的基本操作方法；2.掌握細(xì)胞培養(yǎng)過程中的無菌操作技術(shù)；3.學(xué)習(xí)倒置顯微鏡的使用及培養(yǎng)細(xì)胞的觀察。二、實驗原理清洗與消毒是組織培養(yǎng)實驗的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，也可能影響細(xì)胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價值、生物學(xué)特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。三、實驗材料、用品材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0.22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0.22μm，過濾器(直徑25)。藥品：70％或75％酒精，0.1％新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0.5％過氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))，DEPC水[體積分?jǐn)?shù)0.1％的焦炭酸二乙酯。儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。四、實驗步驟(一)清洗1.新玻璃器皿的清洗先用自來水刷洗，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì)。2.使用過的玻璃器皿的清洗(1)使用過的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗。(2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液過夜。(4)從酸性洗液撈出后自來水沖洗10~15次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。(5)包裝(牛皮紙或一般紙)。(6)高壓(15磅20min)或干熱(17(7)貯存?zhèn)溆谩?.膠塞的處理(1)新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0.2％NaOH煮沸l(wèi)0-20min。(2)自來水清洗10次。(3)再用1％稀鹽酸浸泡30min。(4)自來水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。（二）消毒1.物理消毒法(1)紫外線消毒用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。(2)干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱至160℃，保溫90~120min。用于RNA提取實驗的用品則需180℃，保溫5~8h。(3)濕熱滅菌此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手動高壓滅菌鍋操作如下：①首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足，放人物品蓋好蓋。②加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣5~10min，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。③待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121℃)30min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115℃)20min。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力。④停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。(4)濾過除菌用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號的金屬濾器(直徑90mm、100mm、142mm……等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動的塑料小濾器(直徑20mm、25mm等)。濾膜孔徑有0.60μm、0.45μm、0.35μm、0.22μm、0.10μm等，以0.22μm除菌最為保險，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。①在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0.22μm。②用布包好，濕熱滅菌后使用。2.化學(xué)消毒法常用的消毒液有如下幾種：(1)70％(或75％)酒精：超凈臺里常備70％酒精棉球(衛(wèi)生級酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺面的消毒。(2)0.1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的清潔。超凈臺旁應(yīng)常備盛有0.1％新潔爾滅溶液的容器及紗布。(3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細(xì)胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上說明。(4)0.5％過氧乙酸：是強效消毒劑，10min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進行。(5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉1—3d?？蓪⒖諝庵衅〉奈⑸餁⑺?。(6)37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3d后方可達到消毒空氣的目的。3.煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。五、注意事項1.清洗玻璃制品時，浸酸之后一定要用自來水沖洗10—15次。因為殘存的洗液對細(xì)胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細(xì)胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。2.干熱滅菌時，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當(dāng)溫度超過100℃時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。.3.高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。4.牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。5.濾過除菌時，濾器在使用前先裝好濾膜(有時可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進行。過濾時壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時位置要準(zhǔn)確。另外濾器包裝時，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。6.使用化學(xué)消毒法時，配制75％酒精應(yīng)用衛(wèi)生級，不要用化學(xué)純、分析純和優(yōu)質(zhì)純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性?？諝庀緯r，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因為甲醛或乳酸加熱后放出的蒸氣對人的角膜和呼吸道上皮有嚴(yán)重的刺激和傷害作用。六、思考題1.哪些物品適合于高壓滅菌，并說明理由。2.紫外線消毒的適用范圍和目的是什么?II、原代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察一、實驗?zāi)康?.了解細(xì)胞原代培養(yǎng)基本操作方法；2.掌握細(xì)胞培養(yǎng)過程中的無菌操作技術(shù)；3.學(xué)習(xí)倒置顯微鏡的使用及培養(yǎng)細(xì)胞的觀察。二、實驗原理動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物機體中取出相關(guān)的組織，使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶將它分散成單個細(xì)胞后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。三、實驗用品1、器材解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9.9xl04Pa(15磅)滅菌30min備用。此外，還有顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)器、血細(xì)胞計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標(biāo)記筆、解剖板等。2、試劑磷酸鹽緩沖液(PBS)、無鈣、鎂溶液、細(xì)胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTADMEM液3、材料乳鼠四、實驗方法操作步驟方法一：胰酶消化法洗手，用酒精擦手。點燃酒精燈，將所需用品擺放整齊，方便自己操作。取一只乳鼠，浸入75%乙醇中2~3s，然后取出來，放在滅菌好的培養(yǎng)皿中。取材：取出無菌的手術(shù)器械，如果乳鼠還沒有死亡，用鑷子夾其頭部處死乳鼠。用鑷子提起腹部皮膚，用解剖剪充分剪開腹腔，將肝臟組織取下來，放入一個滅菌好的青霉素瓶中，用無菌吸管吸取3mlHanks液清洗2~3次，直至去掉血污為止。消化：將洗凈的組織塊移入干凈的無菌的青霉素瓶中，將剪刀伸入瓶內(nèi)反復(fù)剪切組織塊，直至剪到0.5~1mm3大小的塊狀為止。加入2ml0.25%胰蛋白酶，輕輕晃動，去掉胰酶溶液，重新加入3ml胰酶溶液，蓋好蓋子，放在37℃水浴中消化20~30min，注意每間隔5min振搖一次。視組織塊變得疏松，顏色略變白時隨即從水浴中取出，放入超凈臺內(nèi)，用吸管反復(fù)吹打，使大部分組織塊分散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞，加入1~2ml培養(yǎng)液終止胰酶消化，靜止片刻，讓未被消化完的組織自然沉降，然后用吸管將細(xì)胞懸液移入無菌青霉素瓶中，蓋好蓋子。離心：將青霉素瓶做好標(biāo)記，平衡后以1000r/min離心8min。在超凈臺內(nèi)棄上清，加入3ml培養(yǎng)液，吹打混勻后，取1滴去鏡檢，適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞密度。細(xì)胞培養(yǎng)：取1ml細(xì)胞懸液至一干凈的培養(yǎng)皿中，再添加1~2ml培養(yǎng)液，蓋上蓋子后，輕輕搖勻，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察：每天對培養(yǎng)的細(xì)胞做常規(guī)檢查，觀察的主要內(nèi)容是：污染與否、細(xì)胞生長狀態(tài)和pH（培養(yǎng)液顏色變化）等情況。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變?yōu)闄幟庶S又顯渾濁，表明可能被污染，細(xì)胞也就不易貼壁生長而逐漸死亡。如培養(yǎng)液顏色為橘紅色，一般說明細(xì)胞生長狀態(tài)良好。接種24h后，可見到許多細(xì)胞貼壁（由圓形懸浮狀態(tài)的細(xì)胞延展成扁平狀）。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞生長繁殖數(shù)量增加，培養(yǎng)液會逐漸變?yōu)辄S色，這時可進行傳代培養(yǎng)。方法二：1~4步驟同胰酶消化法5.將洗凈的組織塊移入消毒的青霉素瓶中，用眼科剪刀剪切成0.5mm的小塊，然后加入1~2滴培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻。用吸管分次吸取組織漿塊，放入培養(yǎng)瓶壁上散開，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使貼服組織面朝上，加入3~4ml培養(yǎng)液，加蓋，做標(biāo)記后，放置一段時間后，待組織小塊略干燥能牢固貼于瓶壁時，再慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（動作一定要輕，減少振動，防止組織塊脫落），使組織塊浸泡在培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)。6.觀察：同胰酶消化法。=3\*ROMANIII.傳代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察一、實驗?zāi)康牧私鈧鞔?xì)胞的傳代方法及操作過程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況。二、實驗原理傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。這種培養(yǎng)，第一步也是制備細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞長成致密單層時，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破壞。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸鹽)的混合物，做為消化液。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。三、實驗用品1、器材解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9.9xl04Pa(15磅)滅菌30min備用。此外，還有顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)器、血細(xì)胞計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標(biāo)記筆、解剖板等。2、試劑磷酸鹽緩沖液(PBS)無鈣、鎂溶液細(xì)胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTADMEM液3、材料雞胚細(xì)胞四、實驗方法在做傳代細(xì)胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞是否已長成致密單層，如已長成單層，即可進行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。1.營養(yǎng)液配制:EMEM液

90%犢牛血清

10%雙抗(1萬單位／m1)

加至約100單位／m17.4％NaHCO3

調(diào)pH至6.8~7.02.換液:在酒精燈旁打開瓶塞，倒去瓶中的細(xì)胞營養(yǎng)液。3.消化與分裝在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動，將溶液倒出。重復(fù)上述動作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml十o.5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細(xì)胞為宜，置于室溫，停留1—2min后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細(xì)胞單層是否出現(xiàn)縫隙(針孔大小的空隙)，如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時，可倒去消化液，加入新配制的營養(yǎng)液20m1。4.培養(yǎng)分裝好的細(xì)胞瓶上，做好標(biāo)志，注明細(xì)胞代號、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細(xì)胞均勻分布，以免堆積成團。然后置于37℃5.觀察(1)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的幾個問題；細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進行觀察，觀察的重點如下：A.首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度B.觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細(xì)胞是否生長。C.如細(xì)胞已生長，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段。觀察時可參照(2)的描述進行。D.觀察完畢，可用臺盤藍(lán)染液對細(xì)胞進行染色。以確定死、活細(xì)胞的比例。(2)細(xì)胞的生長階段及其形態(tài)特征傳代培養(yǎng)的細(xì)胞需逐日進行觀察，注意細(xì)胞有無污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細(xì)胞生長的情況?！阒袑优囵B(yǎng)的細(xì)胞，從培養(yǎng)開始，經(jīng)過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個連續(xù)的生長過程，但為了觀察及描述，人為地將其分為5個時期，但各期間無明顯絕對界限。現(xiàn)分別描述如下：A.游離期：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)消化分散成單個細(xì)胞后，由于細(xì)胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細(xì)胞膜的彈性。所以，此時細(xì)胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)小時。B.吸附期(貼壁)：由于細(xì)胞的附壁持性，細(xì)胞懸液靜置培養(yǎng)一段時間(約7—8h)后，便附著在瓶壁上(此期不同細(xì)胞所需時間不同)。在顯微鏡下觀察時可見瓶壁上有各種形態(tài)的細(xì)胞，如圓形、扁形、短菱形。細(xì)胞的特點，大多立體感強，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，透明。C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細(xì)胞進入繁殖期，加速了細(xì)胞生長和分裂。此期包括由幾個細(xì)胞形成的細(xì)胞島(即由少數(shù)細(xì)胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細(xì)胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到細(xì)胞鋪滿整個瓶壁(即所謂形成細(xì)胞單層)的過程。此期細(xì)胞形態(tài)為多角形(呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞的特征)。細(xì)胞特點：透明，顆粒較少，細(xì)胞間界限清楚，并可隱約見到細(xì)胞核。根據(jù)細(xì)胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長狀況分為四級。以“十”的多少表示如下：十：細(xì)胞占瓶壁有效面積(也就是細(xì)胞能生長的瓶壁面積)的25％以內(nèi)有新生細(xì)胞。一般要觀察3—5個視野內(nèi)的細(xì)胞生長狀況，然后加以綜合分析判斷。十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的25—75％以內(nèi)具新生細(xì)胞。十十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的75—95％具新生細(xì)胞。細(xì)胞排列致密。但仍有空隙。十十十十：細(xì)胞占瓶壁95％以上，細(xì)胞已長滿或接近長滿單層，細(xì)胞致密，透明度好。從十十一十十十十為細(xì)胞的對數(shù)增長期(或稱為指數(shù)增長期)。D.維持期：當(dāng)細(xì)胞形成良好單層后，細(xì)胞的生長與分裂都減緩，并逐漸停止生長，這種現(xiàn)象被稱為細(xì)胞生長的接觸抑制。此時細(xì)胞界限逐漸模糊，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時營養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。E.衰退期：由于溶液中營養(yǎng)的減少和日齡的增長，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時細(xì)胞間可出現(xiàn)空隙，細(xì)胞中顆粒進一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細(xì)胞經(jīng)固定染色處理后，可見細(xì)胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，細(xì)胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來。五、思考題1.簡述細(xì)胞原代與傳代培養(yǎng)的操作程序及注意事項。3.細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么?3.簡述體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征及其生長階段。

實驗五ABO血型鑒定與交叉配血一、實驗原理與目的血型就是紅細(xì)胞膜上特異抗原的類型。在ABO血型系統(tǒng)中，紅細(xì)胞膜上抗原分A和B兩種抗原，而血清抗體分抗A和抗B兩種抗體。A抗原加抗A抗體或B抗原加抗B抗體，則產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。血型鑒定是將受試者的紅細(xì)胞加入標(biāo)準(zhǔn)A型血清（含有抗B抗體）與標(biāo)準(zhǔn)B型血清（含有抗A抗體）中，觀察有無凝集現(xiàn)象，從而測知受試者紅細(xì)胞膜上有無A或/和B抗原。在ABO血型系統(tǒng)，根據(jù)紅細(xì)胞膜上是否含A、B抗原而分為A、B、AB、O四型。（見下表）ABO血型中的抗原和抗體血型紅細(xì)胞膜上所含的抗原血清中所含的抗體O無A和B抗A和抗BAA抗BBB抗AABA和B無抗A和抗B

交叉配血是將受血者的紅細(xì)胞與血清分別同供血者的血清與紅細(xì)胞混合，觀察有無凝集現(xiàn)象。輸血時，一般主要考慮供血者的紅細(xì)胞不要被受血者的血清所凝集；其次才考慮受血者的紅細(xì)胞不被供血者的血清所凝集。前者叫交叉配血試驗的主側(cè)（也叫直接配血），后者叫交叉配血的次側(cè)（也叫間接配血）。只有主側(cè)和次側(cè)均無凝集，稱為“配血相合”，才能進行輸血；如果主側(cè)凝集，稱為“配血不合”或“配血禁忌”，絕對不能輸血；如果主側(cè)不凝集，而次側(cè)凝集，可以認(rèn)為“基本相合”，但輸血要特別謹(jǐn)慎，不宜過快過多，密切注視有無輸血反應(yīng)。本實驗的目的是學(xué)習(xí)ABO血型鑒定的原理、方法以及交叉配血方法。二、實驗對象學(xué)生三、實驗器材和藥品1．儀器顯微鏡，離心機。2．器械采血針，消毒注射器，雙凹玻片，小試管，竹簽，棉球，臘筆。3．藥品標(biāo)準(zhǔn)A血清，標(biāo)準(zhǔn)B血清，生理鹽水，75％酒精，碘酒。四、實驗步驟和觀察指標(biāo)交叉配血示意圖（一）ABO血型鑒定1.玻片法（1）取雙凹玻片一塊，用干凈紗布輕拭使之潔凈，在玻片兩端用臘筆標(biāo)明A及B，并分別各滴入A及B標(biāo)準(zhǔn)血清一滴。（2）細(xì)胞懸液制備從指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理鹽水的小試管內(nèi)，混勻，即得約5％紅細(xì)胞懸液。采血時應(yīng)注意先用75％酒精消毒指尖或耳垂。（3）用滴管吸取紅細(xì)胞懸液，分別各滴一滴于玻片兩端的血清上，注意勿使滴管與血清相接觸。（4）竹簽兩頭分別混合，攪勻。（5）10～30min后觀察結(jié)果。如有凝集反應(yīng)可見到呈紅色點狀或小片狀凝集塊浮起。先用肉眼看有無凝集現(xiàn)象，肉眼不易分辨時，則在低倍顯微鏡下觀察，如有凝集反應(yīng)，可見紅細(xì)胞聚集成團。（6）判斷血型根據(jù)被試者紅細(xì)胞是否被A，B型標(biāo)準(zhǔn)血清所凝集，判斷其血型。玻片法鑒定ABO血型2.試管法（1）取試管2只，分別標(biāo)明A，B字樣，分別加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)血清2滴，各管加入受試者的紅細(xì)胞懸液1~2滴搖勻。（2）將上述二試管用1000轉(zhuǎn)/分離心1min。（3）取出小試管，輕彈底部，如沉淀物呈團塊狀浮起為凝集，呈散在煙霧狀上浮進而恢復(fù)原混懸狀為無凝集。（二）交叉配血1.玻片法（1）用碘酒，75%酒精棉球消毒皮膚后，用消毒干燥注射器抽取受血者及供血者靜脈血各2ml，各用一滴制備紅細(xì)胞懸液，分別標(biāo)明供血者與受血者。余下血分別注入干凈小試管，也標(biāo)明供血者與受血者，待其凝固后析出血清備用。（2）左兩凹玻片左側(cè)標(biāo)上“主”（即主側(cè)）；右側(cè)標(biāo)上“次”（即次側(cè)）。主側(cè)滴入供血者紅細(xì)胞懸液一滴和受血者血清一滴；次則滴入受血者紅細(xì)胞懸液一滴和供血者血清一滴。分別用竹簽混勻。（3）15～30min后，觀察結(jié)果。如兩側(cè)均無凝集現(xiàn)象，可多量輸血；如主側(cè)無凝集而次側(cè)有凝集只可考慮少量輸血；如主側(cè)凝集則不能輸血。2.試管法取二試管，分別注明“主”、“次”字樣，管內(nèi)所加內(nèi)容物同玻片法，混勻后1000rpm離心1min，取出觀察結(jié)果。注意事項1.所用雙凹玻片的試管實驗前必須清洗干凈，以免出現(xiàn)假凝集現(xiàn)象。2.A及B標(biāo)準(zhǔn)血清絕對不能相混，所用滴管上貼橡皮膏標(biāo)明A及B、紅細(xì)胞懸液滴管頭不能接觸標(biāo)準(zhǔn)血清液面，竹簽一端去混勻一側(cè)就不能去接觸另一側(cè)。思考題1.在無標(biāo)準(zhǔn)血清情況下已如某人為A或B型，能否用其血去檢查未知血型？如何作？2.交叉配血時為何主側(cè)不凝集而次側(cè)凝集時，可以少量輸血？還需注意些什么？

實驗六血涂片的制作與讀片一．涂片（一）血液涂片的制作（1）需載玻片2張，分別稱為玻片1和玻片2（推片）。（2）用玻片1一端接約3mm直徑的血滴，將此玻片1保持水平。（3）取另一邊緣平整的載玻片2（推片），將其前端放在血滴前，與片1保持30°角并稍向后移與血滴接觸，即見血液沿片2（推片）下緣散開，使血液展開并充滿整個推片的寬度。（4）立刻將推片與載玻片呈30°角，邊輕壓推片邊將血液按下圖的箭頭方向推動涂抹，至血液鋪完血膜為止。（5）揮動片1使血膜吹干，用蠟筆將血膜邊緣圈畫備染色。（6）每只動物涂片一張。（7）一張良好的血片，要求厚薄適宜，頭、體、尾分明。（8）置30min～1h后較利于觀察紅細(xì)胞的形態(tài)。注意事項：如標(biāo)本本身太短，可觀察的部分會受局限，故以在離開載玻片另一端2cm地方涂抹為宜。載玻片、推片的角度越小、血液越?。煌磕ㄋ俣仍铰?、也越薄。在涂抹貧血病人的血液時，將推片稍豎起（不是30°而是35°～40°左右），以較快的速度推比較好，而對紅細(xì)胞增高的病人則相反。如用力過猛白細(xì)胞容易破損。二．染色血液涂片的染色（1）將待染涂片平放于染色架上。（2）用滴管將染液滴于涂片上，覆蓋整張涂片，放置1～3分鐘。（3）加入等量的磷酸緩沖液或蒸餾水，與染液混勻，可以用滴管從一端吸入，另一端放出，混勻為止，或用嘴來回輕輕吹之，使之混勻，室溫下染色5～10分鐘（白細(xì)胞數(shù)多或骨髓標(biāo)本時間應(yīng)長一些，如20～30min）。（4）染色結(jié)束時，先用蒸餾水或緩沖液洗將涂片上的染液直接沖掉。（5）再將片子用自來水溫和沖洗，至血液膜呈淡紅色。（6）甩干或晾干玻片。（7）封片。血涂片的觀察方法1．肉眼觀察在觀察染色標(biāo)本時，首先用肉眼對顏色進行觀察。如果是正常的末梢血液則呈粉紅色，白血病時白細(xì)胞高度增加或骨髓瘤的高γ球蛋白血癥等情況下，血涂片會帶有藍(lán)色，此時應(yīng)意識到為異常標(biāo)本。2．高倍鏡下觀察首先觀察血涂片制備和染色是否良好、細(xì)胞分布是否均勻，同時可估計白細(xì)胞數(shù)量增減情況。最后對血涂片的體尾交界的區(qū)域進行觀察，選擇細(xì)胞分布均勻不重疊、標(biāo)本不太厚容易觀察的地方進行油鏡觀察。3．油鏡下觀察邊移動視野邊觀察下列各項：1）染色是否良好：如果血涂片染色確實不好，應(yīng)重新染色。2）觀察紅細(xì)胞形態(tài)：（1）有無人為造成的變形，此外有時載玻片上的堿性物質(zhì)的溶出（玻璃效應(yīng)）會導(dǎo)致紅細(xì)胞呈嚴(yán)重的棘形紅細(xì)胞。如固定不良（固定液中含有水分時）會導(dǎo)致呈面包圈形紅細(xì)胞，從而無法觀察紅細(xì)胞的形態(tài)。（2）大小如何，是大細(xì)胞還是小細(xì)胞，有無紅細(xì)胞大小不一。（3）形態(tài)如何，注意有無畸形紅細(xì)胞、球形紅細(xì)胞、橢圓新紅細(xì)胞、靶形紅細(xì)胞、口形紅細(xì)胞（唇形紅細(xì)胞）、中心淡染色紅細(xì)胞、棘形紅細(xì)胞、膽狀紅細(xì)胞、皺縮紅細(xì)胞、淚滴狀紅細(xì)胞、破碎紅細(xì)胞及鐮狀紅細(xì)胞等。（4）是否有染色性的變化，有無嗜多色性紅細(xì)胞，中心淡染紅細(xì)胞。（5）紅細(xì)胞內(nèi)有無異常。觀察是否有嗜堿性點彩、豪-喬小體、卡波環(huán)狀體紅細(xì)胞、幼紅細(xì)胞、帕彭海姆氏小體和瘧原蟲的出現(xiàn)。（6）有關(guān)大小不一，畸形和嗜多色性，可分為輕度±、中度++、高度三個級別。3）觀察白細(xì)胞形態(tài)（1）與紅細(xì)胞比較，判斷白細(xì)胞數(shù)是否正常，是否增加或減少。紅細(xì)胞數(shù)/白細(xì)胞數(shù)約為500：1。（2）有關(guān)白細(xì)胞的種類，要觀察大量的白細(xì)胞后才可判斷是否異常，然后計算白細(xì)胞的百分率。在日常檢查中，一般只計算100個，但是發(fā)現(xiàn)異?；虬准?xì)胞有增加時，盡量增加到200個。計算的白細(xì)胞數(shù)越多，白細(xì)胞百分率的可信度越高。4）觀察血小板形態(tài)（1）通過與紅細(xì)胞的比較，判斷血小板數(shù)量是否正常，是增加或減少。正常情況下每15～20個紅細(xì)胞中有1個血小板。（2）注意大小的變化。（3）觀察未加抗凝劑而直接從毛細(xì)血管采集的標(biāo)本時，要注意血小板的凝集性（觀察由若干血小板凝集的現(xiàn)象。如果呈散在狀，則懷疑為血小板無力癥）。（4）觀察有無寄生蟲，當(dāng)白細(xì)胞減低或白細(xì)胞分類中單核細(xì)胞增多時，應(yīng)注意觀察紅細(xì)胞內(nèi)有無瘧原蟲。各種典型血細(xì)胞的照片（油鏡下）1．血小板2．紅細(xì)胞3．正常白細(xì)胞實驗結(jié)果1．?dāng)?shù)碼拍照（1）依次在低倍（×10）、高倍（×40）、油鏡（×100）下觀察紅細(xì)胞、白細(xì)胞以及血小板正常與異常的變化。（2）用數(shù)碼相機拍攝不同倍數(shù)下的細(xì)胞照片。（3）輸入電腦，比較分析各組間的差異。紅細(xì)胞呈桔紅色，白細(xì)胞核紫色，嗜酸顆粒細(xì)胞鮮紅色，嗜堿顆粒細(xì)胞藍(lán)紫色，中性顆粒細(xì)胞紫或紫紅色，淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞漿藍(lán)灰色，血小板紫色。2．注意事項：1．染色涂片水沖洗后，應(yīng)在空氣中自然干燥或風(fēng)干，不可用火烤干。2．染液量要充足，勿使染液蒸發(fā)干燥。3．細(xì)胞染色過淺或過深，待標(biāo)本干燥后，立即用瑞氏染液或甲醇重新染色數(shù)秒或數(shù)分鐘。4．保存過久的細(xì)胞涂片，細(xì)胞染色會退色，可重新染色。5．新鮮涂片應(yīng)立即染色。作業(yè)繪圖：紅細(xì)胞及各種白細(xì)胞。

實驗七細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本的制備與形態(tài)觀察一、實驗?zāi)康耐ㄟ^標(biāo)本制備和觀察了解生物體細(xì)胞的無絲分裂、有絲分裂形態(tài)特征及生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂過程。二、實驗用品1、材料和標(biāo)本洋蔥根尖壓片。2、器材和儀器顯微鏡、擦鏡紙、解剖針、眼科鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙、培養(yǎng)皿、冰箱。3、試劑70％乙醇、改良堿性品紅染液。三、實驗內(nèi)容細(xì)胞分裂對生物的個體發(fā)育和生存，對種族綿延有著十分重要的意義，高等生物體內(nèi)細(xì)胞的分裂方式有三種：無絲分裂、有絲分裂和減數(shù)分裂。一、動物細(xì)胞無絲分裂的觀察一蛙血涂片(一)原理無絲分裂不僅是原核生物增殖的方式，而且雷馬克(Remak)于1841年最早在雞胚血細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，因為此過程沒有出現(xiàn)紡錘絲和染色體的變化，故稱無絲分裂(Ami—tosis)。其后無絲分裂又在各種動植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，尤其在分裂旺盛的細(xì)胞中更多見，但遺傳物質(zhì)平均分配否?及其分裂的機制尚不十分清楚。蛙紅細(xì)胞體積較大、數(shù)多，而且有核，是觀察無絲分裂的較好材料。(二)觀察與結(jié)果在高倍鏡下，可見到處于不同階段分裂過程中的蛙紅細(xì)胞，核仁先行分裂，向核的兩端移動，細(xì)胞核伸長呈桿狀；進而，在核的中部從一面或兩面向內(nèi)凹陷，使核成腎形或啞鈴形改變；最后，從細(xì)胞中部直接收縮成兩個相似的子細(xì)胞；子細(xì)胞較成熟的紅細(xì)胞小。二、細(xì)胞有絲分裂的觀察一馬蛔蟲子宮切片、洋蔥根尖壓片(一)原理細(xì)胞有絲分裂(Mitosis)的現(xiàn)象是分別由弗勒明(Flemming，1882)在動物細(xì)胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。有絲分裂過程包括一系列復(fù)雜的核變化，染包體和紡錘體的出現(xiàn)，以及它們平均分配到每個子細(xì)胞的過程。馬蛔蟲受精卵細(xì)胞中只有6條染色體，而洋蔥體細(xì)胞的染色體為16條，因為它們都具有染色體數(shù)目少的特點，所以便于觀察和分析。(二)觀察1．動物細(xì)胞有絲分裂的觀察——馬蛔蟲子宮切片取馬蛔蟲的子宮切片標(biāo)本，先在低倍鏡下觀察，可見馬蛔蟲子宮腔內(nèi)有許多橢圓形的受精卵細(xì)胞，它們均處在不同的細(xì)胞時相。每個卵細(xì)胞都包在卵殼之中，卵殼與卵細(xì)胞之間的腔，叫卵殼腔。細(xì)胞膜的外面或卵殼的內(nèi)面可見有極體附著。尋找和觀察處于分裂間期和有絲分裂不同時期的細(xì)胞形態(tài)變化，并轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察。馬蛔蟲受精卵的有絲分裂間期(Interphase)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有兩個近圓形的細(xì)胞核，一為雌原核，另一為雄原核。兩個原核形態(tài)相似不易分辨，核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻，核膜、核仁清楚，細(xì)胞核附近可見中心粒存在。分裂期(Mitosis)前期(Prophase)雌、雄原核相互趨近,染色質(zhì)逐漸濃縮變粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色體相互混合，兩個中心粒分別向細(xì)胞兩極移動，紡錘體開始形成。中期(Metaphase)染色體聚集排列在細(xì)胞的中央形成赤道板，由于細(xì)胞切面不同，此期有側(cè)面觀和極面觀的兩種不同現(xiàn)象，側(cè)面觀染色體排列在細(xì)胞中央，兩極各有一個中心體，中心體之間的紡錘絲與染色體著絲點相連；極面觀由于染色體平排于赤道面上，六條染色體清晰可數(shù)，此時的染色體已縱裂為二，但尚未分離。洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂后期(Anaphase)紡錘絲變短，縱裂后的染色體被分離為兩組，分別移向細(xì)胞兩極，細(xì)胞膜開始凹陷。末期(Telophase)移向兩極的染色體恢復(fù)染色質(zhì)狀態(tài)，核膜、核仁重新出現(xiàn)，最后細(xì)胞膜橫縊，兩個子細(xì)胞形成。2．植物細(xì)胞有絲分裂的觀察——洋蔥根尖切片將洋蔥根尖切片標(biāo)本先在低倍鏡下觀察，尋找生長區(qū)，這部分的細(xì)胞分裂旺盛，大多處于分裂狀態(tài)，細(xì)胞形狀呈方形。換高倍鏡仔細(xì)觀察不同分裂時期的細(xì)胞形態(tài)特征．與動物細(xì)胞有絲分裂特征比較，找出植物細(xì)胞有絲分裂的特點和兩者的區(qū)別。3.制備蠶豆根尖臨時壓片水解：取出根尖放在1NHCl中60℃水解8min，蒸餾水水洗3次。染色：把處理好的根尖放在載玻片上，切取乳白色的分生區(qū)，用鑷子輕輕搗碎，滴上一滴改良苯酚品紅染液，染色5～10min后，蓋上蓋玻片。壓片：在蓋玻片上面鋪上吸水紙，固定好蓋玻片，用拇指垂直壓片，再用橡皮輕敲擊，使材料壓成均勻的薄層。鏡檢觀察有絲分裂的各期細(xì)胞。實驗報告繪圖：細(xì)胞間期及分裂期圖片

實驗八蝗蟲精巢減數(shù)分裂壓片標(biāo)本的制備與觀察一、實驗?zāi)康耐ㄟ^標(biāo)本制備和觀察了解生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂過程。二、實驗用品1、材料和標(biāo)本蝗蟲精巢。2、器材和儀器顯微鏡、擦鏡紙、解剖針、眼科鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙、培養(yǎng)皿、冰箱。三、實驗試劑70％乙醇、改良堿性品紅染液。四、實驗內(nèi)容(一)原理減數(shù)分裂(Meiosis)是配子發(fā)生過程中的一種特殊有絲分裂，即染色體復(fù)制一次，而細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，結(jié)果使染色體數(shù)日減半的過程。減數(shù)分裂過程中體現(xiàn)了遺傳三定律，所以說減數(shù)分裂在穩(wěn)定種的遺傳性狀和繁殖中均起著重要作用?；认x精巢取材方便，標(biāo)本制備方法簡單，染色體數(shù)日較少，例如，蝗蟲初級精母細(xì)胞染色體數(shù)2n=22+X，經(jīng)過減數(shù)分裂形成四個精細(xì)胞，每個精細(xì)胞的染色體數(shù)為n=ll+X或n=11(注：蝗蟲的性別決定與人類不同，雌性有兩條X染色體、雄性為XO，即只有一條X染色體，沒有Y染色體)，一般多采用它來研究觀察減數(shù)分裂染色體形態(tài)變化。(二)蝗蟲精巢壓片標(biāo)本的制備l．采集采集到各期分裂相的標(biāo)本是實驗成功的關(guān)鍵，解決這一關(guān)鍵要把握兩點(1)時間：湖北地區(qū)采集，一般在7月15至25日為宜；(2)蟲體特征：雄蟲翹膀長到剛好蓋住腹部一半時，正好是雄蟲精子發(fā)生的峰季，采集最適。在公園、田埂、河邊、路旁的草叢中均可采到。2．取材將采到的雄蟲，用大頭針固定在木板或紙盒上，沿腹部背中線剪開體壁，見消化管背側(cè)的淺黃色結(jié)構(gòu)即是精巢，用鑷子分離出來。3．固定把取出的精巢立即放入Carnoy固定液中，固定1小時，在期間用大頭針小心分離精細(xì)管，加速固定，促進脂肪溶解。固定后移入70％乙醇中存放于4℃4．染色取固定好的精細(xì)管2～3條，置于干凈載玻片中央，用45％醋酸處理5分鐘，用吸水紙吸干后，加1～2滴醋酸洋紅染色15分鐘。5．壓片在染色材料上蓋上蓋玻片，再在蓋玻片上放一塊吸水紙，用大拇指垂直在蓋玻片上適力下壓(壓片時不要滑動蓋片)使精細(xì)管破裂細(xì)胞平展開，吸去溢出的染液，即可觀察。(三)蝗蟲精子發(fā)生過程減數(shù)分裂的鏡下觀察(參照照片)蝗蟲精巢是由多條圓柱形的精細(xì)管組成，每條精細(xì)管由于生殖細(xì)胞發(fā)育階段的差別可分成若干區(qū)，良好壓片可見到從游離的頂端起始依次為精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞及精子等各發(fā)育階段的區(qū)域。1．精原細(xì)胞(Spermatogonia)位于精細(xì)管的游離端，胞體較小，由有絲分裂來增殖，其染色體較粗短、染色較濃。2．減數(shù)分裂I(MeioticdivisionI)減數(shù)分裂Il是從初級精母細(xì)胞到次級精母細(xì)胞的一次分裂。(1)前期I(ProphaseI)在減數(shù)分裂中，以前期I最有特征性、核的變化復(fù)雜，依染色體變化，又可分為下列各期：細(xì)線期(Leptotenestage)染色體呈細(xì)長的絲，稱為染色線。彎曲繞成一團，排列無規(guī)則，染色線上有大小不一的染色粒，形似念珠，核仁清楚。偶線期（zygotenestage）同源染色體開始配對，同時出現(xiàn)極化現(xiàn)象，各以一端聚集于細(xì)胞核的一側(cè)，另一端則散開，形成花束狀。粗線期（Pachytenestage）每對同源染色體聯(lián)合完成，縮短成較粗的線狀，稱為雙價染色體，因其由四條染單體組成，又叫四分體。雙線期(Diplotenestage)染色體縮的更短些，同源染色體開始有彼此分開的趨勢，但因兩者相互絞纏，有多點交叉，所以這時的染色體呈現(xiàn)麻花狀。終變期(Diakinesis)染色體更為粗短，形成Y、V、O等形狀，終變期末核膜、核仁消失。(2)中期I(MetaphaseI)核膜和核仁消失，紡錘體形成，雙價染色體排列于赤道面，著絲點與紡錘絲相連。這時的染色體組居細(xì)胞中央，側(cè)面觀呈板狀，極面觀呈空心花狀。(3)后期I(AnaphaseI)由于紡錘絲的解聚變短，同源的兩條染色體彼此分開，分別向兩極移動。但每條染色體的著絲粒尚未分裂，故兩條姐妹染色單體仍連在一起同去一極。(4)末期I(TelophaseI>移動到兩極的染色體，呈聚合狀態(tài)，并解旋，同時核膜形成，胞質(zhì)也均分為二，即形成兩個次級精母細(xì)胞，這時每個新核所含染色體的數(shù)目只是原來的一半。到此減數(shù)分裂I結(jié)束。3．減數(shù)分裂Ⅱ(MeioticdivisisonⅡ)減數(shù)分裂Ⅱ類似一般的有絲分裂，但從細(xì)胞形態(tài)上看，可見胞體明顯變小，染色體數(shù)目少。(1)前期Ⅱ(ProphaseⅡ)末期I的細(xì)胞進入前期Ⅱ狀態(tài)，每條染色體的兩個單體顯示分開的趨勢，染色體象花瓣狀排列，使前期Ⅱ的細(xì)胞呈實心花狀。(2)中期Ⅱ(MetaphaseⅡ)紡錘體再次出現(xiàn)，染色體排列于赤道面。(3)后期Ⅱ(AnaphaseⅡ)著絲?？v裂，每條染色體的兩條單體彼此分離，各成一子染色體，分別移向兩極。(4)末期Ⅱ(TelophaseⅡ)移到兩極的染色體分別組成新核，新細(xì)胞的核具單倍數(shù)(n)的染色體組，胞質(zhì)再次分裂，這樣，通過減數(shù)分裂每個初級精母細(xì)胞就形成了四個精細(xì)胞。4．精子形成在兩次精母細(xì)胞分裂過程中，各種細(xì)胞器，如，線粒體、高爾基體等也大致平均地分到四個精細(xì)胞中，精細(xì)胞經(jīng)一系列的分化成熟為精子。鏡下精子頭部呈梭形，由細(xì)胞核及頂體共同組成，尾部細(xì)長呈線狀。實驗報告小結(jié)有絲分裂與減數(shù)分裂過程的異同點。繪圖：減數(shù)分裂I中前期I的各個時期。

實驗九人外周血染色體制備一、實驗原理

人外周血小淋巴細(xì)胞，通常都處在G1期（或G0期），一般情況下不進行分裂。如在培養(yǎng)液中加入植物血凝素（PHA），這種小淋巴細(xì)胞受到刺激可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進入有絲分裂。短期培養(yǎng)后，經(jīng)秋水仙素處理，低滲和固定，即可得到大量的有絲分裂細(xì)胞。人體的1ml外周血內(nèi)一般含有約1×106～3×106個小淋巴細(xì)胞，足夠染色體標(biāo)本制備和分析之用。

二、實驗用品和試劑

1．5ml注射器（7號針尖），培養(yǎng)瓶、刻度吸管，需15磅滅菌20分鐘。離心管、吸管、量筒、載玻片，經(jīng)洗液按常規(guī)清洗、烘干備用。

2．超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，天平，離心機、顯微鏡等。

3．試劑：

（1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO32.0克/1000ml以緩沖pH。完全溶解后經(jīng)0.22μm滅菌濾膜抽濾除菌。

（2）肝素鈉（肝素）：稱取0.2g溶于100ml雙蒸水中，濃度為0.2%，15磅20分鐘滅菌。

（3）秋水仙堿（秋水仙素〕，生理鹽水配制成10μg/ml濃度，15磅20分鐘滅菌，分裝，置－20℃。

（4）低滲液：0.35％KCl。

（5）固定液（Carnoy固定液）甲醇∶冰乙酸（3∶l），臨時配制。

（6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸緩沖液，臨時配制。

（7）磷酸緩沖液：1/15MNa2HPO4、1/15MKH2PO4等體積混和。

（8）5%NaHCO3滅菌濾器抽濾備用。

三、實驗操作步驟

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

1．培養(yǎng)基的配制：

在超凈工作臺中，100ml培養(yǎng)基含以下成分和比例：

RPMI-1640

84ml

小牛血清

15ml

PHA

3支

肝素鈉

1ml

雙抗

終濃度為100單位/ml

以5%NaHCO3（無菌）或1mol/LHCl調(diào)pH至7.2－7.4。

用刻度吸管將培養(yǎng)液分裝入培養(yǎng)瓶（10ml/瓶），4℃?zhèn)溆谩?/p>

2．采血：酒精消毒皮膚，肘靜脈采血0.3—0.5ml，立刻將注射針直接穿過培養(yǎng)瓶的橡膠塞，向10ml培養(yǎng)基中注入30—40滴全血，輕搖勻后置37℃恒溫箱培養(yǎng)。

3．培養(yǎng)：時間為68~72小時。培養(yǎng)期間，定期輕搖勻，使細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基。

4．秋水仙素處理：終止培養(yǎng)前2~4小時，在培養(yǎng)液中加入秋水仙堿（用1ml注射器5號針尖滴加2滴，使終濃度為0.08μg/ml）。

以上步驟均需無菌操作

（二）染色體制備

1．收集細(xì)胞：將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入潔凈離心管中，以1000rpm離心8~10分鐘，棄上清液。

2．低滲處理：向刻度離心管中加入預(yù)溫37℃的低滲液8ml，用滴管混勻，置37℃恒溫水浴中低滲15~25分鐘。

3．預(yù)固定：低滲后加入0.5ml固定液，輕輕混勻后1000rpm離心8~10分鐘。

4．一固定：棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘。1000rpm離心，棄上清液。

5．二固定、三固定：同一固定。

6．制懸液：棄上清液后，視細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞懸液。

7．滴片：吸取細(xì)胞懸液自10~20cm高滴在一張干燥潔凈的載玻片上，輕吹散，氣干。

8．染色：1:10Giemsa染色5~10分鐘，細(xì)水洗去多余染液，氣干。

9．鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態(tài)并計數(shù)。

四、注意事項

l．培養(yǎng)溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在37±0.5℃，培養(yǎng)液最適合pH為7.2~7.4。

2．秋水仙素處理時間過長，分裂細(xì)胞多，染色體短小；反之，則少而細(xì)長。都不宜觀察形態(tài)及計數(shù)。故秋水仙素的濃度及時間要準(zhǔn)確掌握。

3．低滲使紅細(xì)胞膜破裂，淋巴細(xì)胞膨脹，低滲處理濃度及時間要適當(dāng)。且低滲后混勻細(xì)胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。

4．離心前配平，離心速度過高，細(xì)胞團不易打散；反之，細(xì)胞易丟失。

5．固定液應(yīng)在使用前臨時配制。

6．載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。

五、問題思考：

1.為什么要在培養(yǎng)基中加入PHA?2.秋水仙素的作用是什么?3.繪制人染色體中期圖。

實驗十正常人非顯帶染色體的核型分析一、目的要求

1.熟悉正常人類染色體的數(shù)目及形態(tài)特征。

2.掌握非顯帶染色體的核型分析方法。二、實驗材料

正常人外周血淋巴細(xì)胞染色體制片顯微鏡三、實驗原理

人類非顯帶染色體核型分析是染色體研究中的基本方法。它