定位人類基因組計(jì)劃

人類基因組計(jì)劃、基因定位田虹Tel:(O)醫(yī)學(xué)遺傳系

第一節(jié)人類基因組和人類基因組計(jì)劃基因定位:是用一定的方法將基因確定到染色體的實(shí)際位置。將不同的基因確定于染色體的具體位置之后，即可繪制出基因圖(genemap)。每個(gè)單倍體DNA含有3.2×109bp，分布在22條常染色體和X，Y性染色體上。編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因大約有25,000-30，000個(gè)。

人類基因組的組成（3×109bp）第二節(jié)HGP研究在醫(yī)學(xué)研究中的意義1特殊疾病基因的定位2有利于優(yōu)生和產(chǎn)前診斷3加強(qiáng)對(duì)癌癥的認(rèn)識(shí)和治療4有利于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究P206人類基因組4張圖譜之間的關(guān)系第三節(jié)人類基因組研究的主要內(nèi)容（一）遺傳圖譜（geneticmap）連鎖圖譜(linkagemap)17cM11cMXg（血型基因）ich（普通魚(yú)鱗?。㎡A(眼白化癥)遺傳圖譜舉例：重組頻率用于X染色體上基因的連鎖和定位（二）物理圖譜（physicalmap）

確立各遺傳標(biāo)記之間的物理距離，以堿基對(duì)（bp）為單位：1、獲得分布于整個(gè)基因組的30,000個(gè)序列標(biāo)記位點(diǎn)（sequencetaggedsite,STS）；2、包括構(gòu)建覆蓋每條染色體的相互重疊的大片段DNA克隆群或稱跨疊克隆群（contig）；3、根據(jù)contig的大小估算STS間的距離。物理圖譜的意義：物理圖譜是進(jìn)行DNA序列分析和基因組結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。Bluntends–RsaⅠbluntendsstickyendssingle-strandedoverhangattheendBamHⅠ5`3`RestrictionFragmentLength

PolymorphismsAB應(yīng)用RFLP進(jìn)行臨床診斷微衛(wèi)星DNA標(biāo)記簡(jiǎn)短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat,STR)。1-4個(gè)堿基的重復(fù),如(A)n,(CA)n,(CAG)n和(CATG)n。微衛(wèi)星DNA數(shù)量多且均勻分布在基因組中。據(jù)估計(jì)，在基因組中平均30—50kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星。微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性。PCR方法對(duì)個(gè)體進(jìn)行微衛(wèi)星(CArepeat)多態(tài)性分型PCR或DNA復(fù)制過(guò)程中的鏈滑(strandslippage)機(jī)制當(dāng)比較兩個(gè)隨機(jī)個(gè)體的7號(hào)染色體上的一段DNA序列時(shí)，在2200個(gè)核甘酸中出現(xiàn)兩個(gè)單核甘酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)。人基因組中，平均約每1200個(gè)堿基就會(huì)有一個(gè)堿基的不同。

單核甘酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記（a）在多個(gè)個(gè)體的DNA樣品中鑒定單核苷酸多態(tài)性（SNPs）；（b）將群體中頻率大于1%的那些共同遺傳的相鄰SNPs組合成單體型；（c）在單體型中找出用于識(shí)別這些單體型的標(biāo)簽SNPs。通過(guò)對(duì)圖中的三個(gè)標(biāo)簽SNPs進(jìn)行基因分型，研究者可以確定每個(gè)個(gè)體擁有圖示的四個(gè)單體型中的哪一個(gè)。Fortheindicatedindividuals,thegenotypes(inbrackets)areasfollows:1(3,6);2(1,5);3(3,5);4(2,5);5(3,6);6(2,5);7(3,5);8(3,6);9(3,5);10(5,7);11(3,3);12(2,4);13(3,3);14(3,6);15(3,3);16(3,4).D17S800(CArepeat)標(biāo)記對(duì)一個(gè)家系的16成員進(jìn)行多態(tài)分型Thefigureshowshaplotypeanalysisintwopedigreeswithadominantlyinheritedskindisorder,Darier-Whitedisease,whichhadpreviouslybeenmappedto12q.（三）轉(zhuǎn)錄圖譜（transcriptionmap）基因圖譜構(gòu)建轉(zhuǎn)錄圖的前提條件是獲得大量基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，通過(guò)逆向轉(zhuǎn)錄，即可得到cDNA，表達(dá)序列標(biāo)鑒（expressedsequencetag，EST），為部分cDNA序列，300-500bp。將mRNA和EST與基因組DNA序列對(duì)比，就可找出同源序列，再將其進(jìn)行標(biāo)示即成轉(zhuǎn)錄圖譜。

轉(zhuǎn)錄圖譜的意義1、能為估計(jì)人類基因的數(shù)目提供可靠的依據(jù)。2、提供不同組織、不同時(shí)期基因表達(dá)的信息（數(shù)目、種類及結(jié)構(gòu)功能）。3、提供結(jié)構(gòu)基因的標(biāo)記，可以作為篩選基因的探針。

（四）序列圖譜最終目標(biāo)：30億bp的全序列圖。起始材料：跨疊克隆群（contig）全序列測(cè)定的基本路線：1、將所有染色體DNA片段一次性克隆進(jìn)入YAC或BAC

人工染色體，建立相連片段群。2、先用流式細(xì)胞儀將24條染色體逐一分開(kāi)，然后將其分別克隆，建立染色體特異的相連片段群。3、利用STS或EST將各克隆排序、定位。4、大規(guī)模DNA序列分析。第四節(jié)人類基因組研究的方法和策略大片段外源DNA克隆體系構(gòu)建contig的運(yùn)載體(vector)2人類基因組研究的基本思路大規(guī)模測(cè)序的基本策略DNA切下的片段插入（連接）到載體中疊連群測(cè)序后得出一致序列大量的重疊片段gtatgtacatttttaaaatctcattttaaaaggccagttaaaatgggtatgtacatttttaa

ttttaaaatctcattttaatttaaaaggccagttaagttaaaatgg運(yùn)載體(Vector)運(yùn)載體是能將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并可自我復(fù)制和增殖的工具。分子量小。有多種限制酶切位點(diǎn)。有可供選擇的標(biāo)記基因或報(bào)道基因。克隆載體有復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體有啟動(dòng)子。運(yùn)載體載體插入片段大小Plasmid0~10kbInsertionλvector0~10kbReplacementλvector9~23kbCosmid33~44kbP1phage70~100kbPAC130~150kbBAC300kbYAC0.2~2.0Mb質(zhì)粒(plasmid)agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcatpUC192686bpOriApRLacZEcoRⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠXbaⅠBamHⅠSalⅠSphⅠPstⅠHindⅢ噬菌體載體1、噬菌體；2、噬菌體DNA；3、噬菌體DNA中間基因簇；4、將連接物體外包裝后感染細(xì)菌，制備基因庫(kù)（用于基因庫(kù)構(gòu)建）246135粘粒(cosmid)可環(huán)化，不會(huì)裂解宿主細(xì)胞(λphage)可自我復(fù)制(plasmid)45kb外源DNA可與同源序列質(zhì)粒重組pJB85.4kbBamHⅠClaⅠ

HindⅢcosOriAmpRSalⅠP1噬菌體&PAC，噬菌體人工染色體BAC,細(xì)菌人工染色體YAC,酵母人工染色體著絲粒端粒自主復(fù)制元件（autonomouslyreplicationsequences，ARS）大片段DNA克隆載體1、逐個(gè)克隆法（clonybyclony）：將YAC、BAC克隆逐一序列分析，然后排列組裝。2、鳥(niǎo)槍法（shotgunapproach）：隨機(jī)挑取克隆測(cè)序，然后通過(guò)計(jì)算機(jī)排序并接，

Celera公司首創(chuàng)。大規(guī)模測(cè)序的基本策略㈢確定特定的基因通過(guò)基因的表現(xiàn)型來(lái)鑒定基因是最有效的手段之一這些技術(shù)主要包括以下幾類：1通過(guò)DNA全序列分析確定基因——結(jié)構(gòu)、功能2定位克?。╬ositionalcloning）：已知位子（染色體缺失、易位、連鎖分析）或DNA標(biāo)記，尋找基因

Obesity基因和Huntington舞蹈癥的基因；3功能克?。╢unctionalcloning）：分離與該功能相關(guān)的蛋白質(zhì)氨基酸—mRNA—cDNADNA鐮刀狀貧血基因4鑒定基因基因定位的方法1、體細(xì)胞雜交（somaticcellhybridization）又稱細(xì)胞融合（cellfusion），是將來(lái)源不同的兩種體細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞。大多數(shù)體細(xì)胞雜交是用人的細(xì)胞與小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠的體細(xì)胞進(jìn)行雜交。這種新產(chǎn)生的融合細(xì)胞稱為雜種細(xì)胞（hybridcell）。雜種細(xì)胞有一個(gè)重要的特點(diǎn)是在其繁殖傳代過(guò)程中出現(xiàn)保留嚙齒類一方染色體而人類染色體則逐漸丟失，最后只剩一條或幾條。Miller等培育出一種雜種細(xì)胞，此類雜種細(xì)胞的存活需要胸苷激酶（TK）。后來(lái)發(fā)現(xiàn)凡含有人第17號(hào)染色體的雜種細(xì)胞都因有TK活性而存活，反之則死亡。從而推斷TK基因定位于第17號(hào)染色體上。這是首例用細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。2、克隆嵌板法（clonepanelmethod

）應(yīng)用雜種細(xì)胞保留或丟失人類染色體有時(shí)有重疊現(xiàn)象而設(shè)計(jì)的一種簡(jiǎn)便有用的基因定位方法。

克隆嵌板示意雜種克隆保留的人染色體12345678A++++----B++--++--C+-+-+-+-半乳糖激酶（GK）、尿苷-磷酸激酶（UMPK）和氨基己糖苷酶A（HEXA）的基因就是用此法分別定位于人的17號(hào)、1號(hào)和15號(hào)染色體上的。3、染色體原位雜交（chromosomeinsituhybridization）

是分子雜交技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，也是一種直接進(jìn)行基因定位的方法。4、連鎖分析(linkageanalysis)在減數(shù)分裂時(shí)，一對(duì)同源染色體上的兩個(gè)相鄰的基因可發(fā)生交換，距離較遠(yuǎn)，發(fā)生交換的機(jī)會(huì)較多，則出現(xiàn)基因重組；若兩者較近，重組機(jī)會(huì)較少。一些相互鄰近的基因或遺傳標(biāo)記趨向于在一起共同遺傳或相互連鎖構(gòu)成單體型(haplotype)。利用某個(gè)擬定位的基因是否與某個(gè)遺傳標(biāo)記或單體型存在連鎖關(guān)系，就能將該基因定位到染色體的一定部位。

在人類基因組中存在大量的微衛(wèi)星(microsatellite)標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)標(biāo)記。有足夠數(shù)量的家系。5、染色體缺失X連鎖和常染色體微小缺失綜合征最小重疊區(qū)最小重疊區(qū)最小重疊區(qū)最小重疊區(qū)對(duì)多個(gè)RB患者Chr缺失鑒