放射免疫檢測技術(shù)

關(guān)于放射免疫檢測技術(shù)第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日基本內(nèi)容一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理二、放射免疫分析（RIA）三、免疫放射分析（IRMA）四、RIA與IRMA的比較五、放射免疫分析中造成測量誤差的因素六、核廢物的處理七、應(yīng)用八、課堂小結(jié)九、作業(yè)第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理1、7個基本概念2、常用的放射性核素3、放射性核素的選擇原則4、放射性標(biāo)記的抗原或抗體的要求5、制備放射性核素標(biāo)記物6、放射性標(biāo)記物的純化7、理想的分離技術(shù)8、免疫復(fù)合物分離常用方法9、核射線探測儀器的探測原理第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日1、7個基本概念⑴放射性核素：是指原子核能自發(fā)地產(chǎn)生成分或能級的變化，在變化時伴有射線的發(fā)射（放射性），然后變成另一種元素的核素。

一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理放射量單位有:①放射性活度②放射性比活度③放射性濃度第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日1、7個基本概念⑵放射性活度：一定量的放射性核素在單位時間內(nèi)的核衰變數(shù)，即每秒核衰變次數(shù)。單位：貝可勒爾(Becquerel，Bq)1Ci=3.7×1010Bq一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日1、7個基本概念⑶放射性比活度：是指固體樣品的放射性活度，即單位質(zhì)量樣品中所含放射性活度，以Bq/g或Bq/mmol表示。⑷放射性濃度：是指液體樣品的放射性活度，即單位體積溶液中所含放射性活度，以Bq/ml表示。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日1、7個基本概念⑸比活度：是單位質(zhì)量標(biāo)記物的放射強(qiáng)度，單位為Bq/g。

標(biāo)記抗原的比放射性越高，所需標(biāo)記抗原量越少，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的敏感度越高。但過高的比放射性可能會損傷抗原的免疫活性。如碘標(biāo)記化合物以單碘標(biāo)記為宜。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日1、7個基本概念⑹放射化學(xué)純度：是指結(jié)合于抗原上的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率。

影響因素:①被標(biāo)記物不純，雜質(zhì)也被放射性核素標(biāo)記；②標(biāo)記后的分離純化不完全；③標(biāo)記化合物貯存過程中的碘脫落。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日1、7個基本概念⑺免疫活性：指標(biāo)記抗原結(jié)合于抗體的放射強(qiáng)度占總放射強(qiáng)度的百分率。以檢查標(biāo)記后免疫活性損失情況。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日2、常用的放射性核素：放射性核素依據(jù)衰變方式分α、β、γ三種，用于放射性標(biāo)記的有β和γ兩類;分別用液體閃爍計數(shù)器及γ計數(shù)器測定。

β型：3H（最常用）、14C和32P。

γ型：125I（最常用）、131I、51Cr和60Co。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日125I和3H標(biāo)記物特點(diǎn)比較125I標(biāo)記物3H標(biāo)記物標(biāo)記方法方法簡便，易獲得高比放射性標(biāo)記物方法較難，不易獲得高比放射性標(biāo)記物對標(biāo)記化合物影響標(biāo)記時以I代替H1改變物質(zhì)結(jié)構(gòu)，可影響抗原免疫學(xué)活性不改變抗原結(jié)構(gòu)，一般不影響抗原免疫活性測量方法方法簡便、效率高方法復(fù)雜，效率低測量儀器γ計數(shù)器液體閃爍計數(shù)器半衰期60.2天約11年廢棄物處理容易較難第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日3、放射性核素選擇原則高比活度、適宜半衰期、對抗原或抗體沒損害、容易標(biāo)記。4、放射性標(biāo)記的抗原或抗體的要求純度高、靈敏、有足夠或完整的免疫活性、高親和常數(shù)、特異性強(qiáng)、交叉反應(yīng)率低。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日5、制備放射性核素標(biāo)記物⑴直接標(biāo)記法將125I直接結(jié)合在蛋白質(zhì)側(cè)鏈的酪氨酸殘基苯環(huán)上，形成單碘酪氨酸或雙碘酪氨酸。操作簡便，結(jié)合效率高，但只能標(biāo)記含酪氨酸的化合物，有時可能會損害蛋白質(zhì)的活性。⑵間接標(biāo)記法先將放射性碘連接到一個小分子載體上，再將這個小分子載體與蛋白質(zhì)結(jié)合。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日6、放射性標(biāo)記物的純化可用葡聚糖凝膠過濾法或薄層層析法、紙層析法、電泳法、高效液相層析法等。

理想的放射性標(biāo)記物：高放射化學(xué)純度適當(dāng)?shù)谋确派湫愿叩拿庖呋钚?。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日7、理想的分離技術(shù)①簡便易行，適于大批量樣品分析;②分離效果完全、快速，非特異結(jié)合低;③試劑來源容易、價格低廉、穩(wěn)定性好、可長期保存;④不受外界因素和樣品中其他組分的干擾，對標(biāo)準(zhǔn)品和待測抗原分離效果相同;⑤適合自動化分析的要求。

一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日8、免疫復(fù)合物分離常用方法⑴.吸附法

用吸附劑(如活性炭)吸附小分子的游離。⑵.化學(xué)沉淀法RIA反應(yīng)條件接近抗體的等電點(diǎn)，加入聚乙二醇(PEG)等蛋白質(zhì)沉淀劑可破壞蛋白分子表面的水化層而使蛋白沉淀，從而分離B與F。⑶.雙抗體法

利用抗抗體和※Ag-Ab復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成更大免疫復(fù)合物，離心沉淀即可分離B與F。⑷.PR試劑

將雙抗體法和PEG結(jié)合起來的沉淀法，可彌補(bǔ)各自的不足，分離效果好，適用范圍廣。⑸.固相分離法

將抗體或抗原結(jié)合在固相載體（如磁顆粒、聚苯烯管子或珠等）上，利用固相抗體或抗原分離B和F，具有簡便、快速、適合于自動化分析等特點(diǎn)，已逐步取代傳統(tǒng)的液相分離方法。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日9、核射線探測儀器的探測原理

核射線探測器是個能量轉(zhuǎn)化器，其檢測原理是當(dāng)射線作用于閃爍體，閃爍體吸收了射線的能量而引起閃爍體中的原子或分子激發(fā)，當(dāng)受激的原子或分子退激時，則發(fā)出光子進(jìn)入光電倍增管光陰極，轉(zhuǎn)換為光電子，光電子在光電倍增管電場作用下到達(dá)陽極，形成電脈沖。

轉(zhuǎn)換模式：放射能→光能→電能→脈沖。一、放射免疫檢測技術(shù)的基本原理第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日二、放射免疫分析（RIA）1、基本原理抗原抗體競爭性結(jié)合反應(yīng)，即待測抗原(Ag)和定量的標(biāo)記抗原(※Ag)與限量的抗體(Ab)進(jìn)行特異性反應(yīng)，其中Ab的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)小于Ag＋※Ag的結(jié)合位點(diǎn)總數(shù)，則Ag和※Ag與Ab發(fā)生競爭性結(jié)合。如待測Ag含量多，則Ag-Ab復(fù)合物形成得多，※Ag-Ab復(fù)合物(B)形成少，游離的※Ag（F）多，反之亦然。第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日二、放射免疫分析（RIA）第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日2、分類根據(jù)加樣順序不同，RIA可分為2個類型：①平衡法

將Ag和※Ag同時與Ab反應(yīng)，達(dá)到平衡后分離※Ag-Ab和※Ag，方法穩(wěn)定，但敏感度稍差；②順序飽和法

先將待測Ag與Ab充分反應(yīng)，達(dá)平衡后再加入※Ag，敏感度提高，穩(wěn)定性不如平衡法。二、放射免疫分析（RIA）第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日3、數(shù)據(jù)處理⑴根據(jù)放射性核素的類型分別選用液體閃爍計數(shù)儀（β型）和γ計數(shù)儀（γ型），測定各待測標(biāo)本和備抗原標(biāo)準(zhǔn)品的※Ag-Ab放射性強(qiáng)度(B)或游離※Ag放射性強(qiáng)度(F)。⑵制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，縱坐標(biāo)為放射性反應(yīng)參數(shù)，有各種表示方式，可選用B/F、B/（B＋F）、F/B、B/B0（零標(biāo)準(zhǔn)管）等比值或B或F的cpm（脈沖）值，常選用B/B0比值作為參數(shù)。橫坐標(biāo)為已知測定物標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，以算術(shù)數(shù)或?qū)?shù)表示。放射免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線為雙曲線。⑶根據(jù)待測抗原管的放射性強(qiáng)度計算相應(yīng)反應(yīng)參數(shù)值，再從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查得待測抗原相應(yīng)含量。二、放射免疫分析（RIA）第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的類型（1）以測定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、計數(shù)（cpm）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（2）以測定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、cpm為縱坐標(biāo)，曲線呈反S型；(3）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的算術(shù)數(shù)（或?qū)?shù)）為橫坐標(biāo)，F(xiàn)/B（或B0/B）為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（4）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，logitB/B0為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為從左到右的漸降直線。第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日4、方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)

①敏感度高，能測到μg/L，甚至可測到ng/L或pg/水平；②特異性強(qiáng)，與結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)間的交叉反應(yīng)少；③準(zhǔn)確性好，重復(fù)性好，批間批內(nèi)誤差低；④用血量少。缺點(diǎn)①有放射性核素對環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室污染；②放射性核素易衰變以及放射性標(biāo)記物不穩(wěn)定，導(dǎo)致試劑有效期短。二、放射免疫分析（RIA）第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日三、免疫放射分析（IRMA）1、原理屬于非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)。是將放射性同位素標(biāo)記在抗體上，用過量的標(biāo)記抗體(Ab)與待測抗原反應(yīng)，反應(yīng)式為Ag+※Ab=Ag-※Ab+※Ab。待充分反應(yīng)后，除去游離的標(biāo)記抗體，Ag-※Ab結(jié)合物的放射性強(qiáng)度與待測抗原量呈正比關(guān)系，即待測抗原含量越多，則復(fù)合物的計數(shù)率就越高，反之則越低。第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日2、技術(shù)路線抗體包被反應(yīng)管—→待測抗原—→過量的標(biāo)記抗體—→抗原抗體反應(yīng)（溫育）—→平衡—→分離Ag-※Ab+※Ab—→放射性強(qiáng)度測定—→繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線—→計算待測抗原量三、免疫放射分析（IRMA）第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日3、方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)

敏感性高特異性高標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記容易。結(jié)果穩(wěn)定缺點(diǎn)

IRMA抗體用量偏多抗體的特異性純化較難（如用單克隆抗體可克服這些缺點(diǎn)）。三、免疫放射分析（IRMA）第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日四、RIA與IRMA的比較

放射免疫分析（RIA）是放射免疫技術(shù)最經(jīng)典的模式。它是以放射性核素標(biāo)記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競爭性結(jié)合特異性抗體為基本原理來測定待檢樣品中抗原量的一種分析方法。

免疫放射分析（IRMA）是用放射性核素標(biāo)記的過量抗體與待檢測抗原直接結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競爭性放射免疫分析。第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日二者的異同點(diǎn)如下：

①標(biāo)記物RIA以放射性核素標(biāo)記抗原；IRMA則是標(biāo)記抗體。②反應(yīng)速率IRMA反應(yīng)速度比RIA快。③反應(yīng)原理RIA為競爭抑制性結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待檢抗原量成反相關(guān)；IRMA為非競爭結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待檢抗原成正相關(guān)。④特異性IRMA特異性較RIA高。⑤靈敏度和檢測范圍IRMA測定的靈敏度明顯高于RIA，IRMA標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍較RIA寬1~2個數(shù)量級。⑥其他RIA所用抗體為多克隆抗體，對親和力和特異性要求較高，但用量很少；IRMA為試劑過量的反應(yīng)，對抗體親和力的要求不及RIA，但用量大。此外，RIA可以測量半抗原，但I(xiàn)RMA只能測定至少有兩個以上表位的抗原。四、RIA與IRMA的比較第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日五、放射免疫分析中造成測量誤差的因素

誤差包括系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差。系統(tǒng)誤差發(fā)生在測量過程中由于儀器不準(zhǔn)、試劑不純、標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定等原因，使測定結(jié)果呈傾向性偏大或偏小，這種誤差應(yīng)力求避免。隨機(jī)誤差是測量過程中各種偶然因素造成的，沒有固定的傾向性，這類誤差是不可避免的，必要時做統(tǒng)計學(xué)處理。造成誤差的可能來源有以下幾個方面：

1．各種儀器：設(shè)備的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、效率以及被污染等情況帶來的誤差。如：①由于放射性測量儀器的穩(wěn)定性、效率、樣品試管的材料和均勻性及被測物的放射性強(qiáng)度等原因。②由于樣品的自吸收，本底校正，測定時間，可能的污染等原因。③在試驗(yàn)室中所有的移液管、微量取樣器以及天平的刻度、校準(zhǔn)和使用方法等原因。④由于反應(yīng)試管、移液管以及測定用試管等表面清潔度和所引起的不同吸附等原因都可以對測定結(jié)果帶來誤差。

2．試劑的純度、質(zhì)量和穩(wěn)定性的影響也是造成誤差的重要因素。如標(biāo)記抗原的比度、純度，輻射自分解，抗體的穩(wěn)定性，分離劑、阻斷劑及緩沖液等試劑的純度等。第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日3．在放射免疫分析中一些基本操作，如取樣、提取、沉淀、分離以及保溫條件不適當(dāng)?shù)仍斐傻恼`差。由于工作人員熟練程度不同也常常帶來誤差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹氣與不吹氣等。工作人員草率、不按規(guī)程操作等也都可以造成誤差。4．樣品誤差。樣品的收集方法、貯存溫度、放置條件，微量樣品取樣的準(zhǔn)確度，樣品可能造成的污染以及樣品的變性（如免疫反應(yīng)活性的降低、蛋白質(zhì)的變性等）也都能造成測量的誤差。5．提取及層析分離過程中的丟失。五、放射免疫分析中造成測量誤差的因素

第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日六、核廢物的處理放射性廢物中的放射性物質(zhì)，采用一般的物理、化學(xué)及生物學(xué)的方法都不能將其消滅或破壞，只有通過放射性核素的自身衰變才能使放射性衰減到一定的水平。而許多放射性元素的半衰期十分長，并且衰變的產(chǎn)物又是新的放射性元素，所以放射性廢物與其它廢物相比在處理和處置上有許多不同之處。第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日

1、放射性廢水的處理

放射性廢水的處理方法主要有稀釋排放法、放置衰變法、混凝沉降法、離子變換法、蒸發(fā)法、瀝青固化法、水泥固化法、塑料固化法以及玻璃固化法等。

2、放射性廢氣的處理

(1)鈾礦開采過程中所產(chǎn)生廢氣、粉塵，一般可通過改善操作條件和通風(fēng)系統(tǒng)得到解決。(2)實(shí)驗(yàn)室廢氣，通常是進(jìn)行預(yù)過濾，然后通過高效過濾后再排出。(3)燃料后處理過程的廢氣，大部分是放射性碘和一些惰性氣體。

3、放射性固體廢物的處理和處置

放射性固體廢物主要是被放射性物質(zhì)污染而不能再用的各種物體(1)焚燒(2)壓縮(3)去污(4)包裝六、核廢物的處理第三十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日

七、在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用1.激素的測定

RIA可用于大