一般生殖毒性試驗方法原則課件

第八講

生殖發(fā)育毒性及其試驗與評價方法第八講生殖發(fā)育毒性及其試驗與評價方法2第一節(jié)

概述

哺乳動物的生育繁殖過程外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響外源化學(xué)物對生殖發(fā)育損害作用的特點

2第一節(jié)概述3哺乳動物的生育繁殖過程

生殖發(fā)育是哺乳動物繁衍種族的生理過程，其中包含生殖細(xì)胞發(fā)生（即精子發(fā)生和卵細(xì)胞發(fā)生）、配子的釋放、性周期和性行為、卵細(xì)胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或著床、胚胎形成、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生（或稱器官形成）、胎仔發(fā)育、分娩和哺乳過程。

生殖發(fā)育也可稱繁殖過程。3哺乳動物的生育繁殖過程生殖發(fā)育是哺乳動物繁連續(xù)、完整的生殖發(fā)育過程的六個階段A.從交配前到受孕：檢查成年雄性和雌性生殖功能、配子的發(fā)育與成熟、交配行為、受精。B.從受孕到著床：檢查成年雌性生殖功能、胚胎著床前發(fā)育、著床。C.從著床到硬腭閉合：檢查成年雌性生殖功能、肧體發(fā)育、主要器官形成。D.從硬腭閉合到妊娠結(jié)束：檢查成年雌性生殖功能、胎體的發(fā)育與生長、器官的發(fā)育與生長。E.從出生到斷乳：檢查成年雌性生殖功能、新生仔對宮外生活的適應(yīng)性、斷乳前的發(fā)育與生長。F.從斷乳到性成熟：檢查斷乳后的發(fā)育與生長、對獨立生活的適應(yīng)、達(dá)到完全的性功能。4連續(xù)、完整的生殖發(fā)育過程的六個階段A.從交配前到受孕：檢查成5外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用?？梢酝ㄟ^對內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是對性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經(jīng)系統(tǒng)對內(nèi)分泌功能也有調(diào)節(jié)作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸)兩條途徑作用于生殖發(fā)育過程

。

5外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損6外源化學(xué)物對生殖發(fā)育損害作用的特點

生殖發(fā)育過程較機體其他系統(tǒng)更為敏感；外源化學(xué)物對生殖發(fā)育過程影響的范圍較為廣泛和深遠(yuǎn)。不僅直接涉及雌雄兩性個體，同時還對其第二代甚至以后世代的個體產(chǎn)生影響。

6外源化學(xué)物對生殖發(fā)育損害作用的特點生殖發(fā)育過程較機體其他7第二節(jié)

生殖毒性及其評價

生殖毒性的表現(xiàn)生殖毒性的評價方法7第二節(jié)生殖毒性及其評價81950年美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，懷孕期間服用黃體酮，先后有600多名女嬰出現(xiàn)生殖器男性化畸形

。1956年用于治療妊娠反應(yīng)的反應(yīng)停，1961年后出現(xiàn)近萬例短肢畸形兒(海豹畸形)。二惡英(TCDD)造成的大面積污染及其與人群生殖危害的關(guān)系至今仍不清楚

。過去半個世紀(jì)震驚全球的系列中毒或災(zāi)難事件的發(fā)生，在世界范圍內(nèi)提高了人們對用藥的安全意識，高度關(guān)注新的化學(xué)物對生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)或妊娠結(jié)局的不良影響，促進(jìn)了與生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)安全相關(guān)法律的產(chǎn)生和研究方法指南的問世。

81950年美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，懷孕期間服用黃體酮，先9一、生殖毒性表現(xiàn)

外源化學(xué)物對生殖的過程的損害作用可以表現(xiàn)為性淡漠，性無能或各種形式的性功能減退。雌性可出現(xiàn)排卵規(guī)律改變，月經(jīng)失調(diào)或失經(jīng)，卵巢萎縮，受孕減少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表現(xiàn)為睪丸萎縮或壞死，精子數(shù)目減少。

9一、生殖毒性表現(xiàn)外源化學(xué)物對生殖的過程的損害作對雄性生殖系統(tǒng)的毒作用直接損傷睪丸中的細(xì)胞群對精子發(fā)生的有害作用繼發(fā)性的影響精子發(fā)生改變下丘腦-垂體功能直接影響睪丸細(xì)胞功能精子生成障礙性欲異常，喪失生育能力引起生殖細(xì)胞突變，造成可遺傳損害10對雄性生殖系統(tǒng)的毒作用直接損傷睪丸中的細(xì)胞群對精子發(fā)生的有害對雌性生殖系統(tǒng)的毒作用對卵巢的損害：卵母細(xì)胞數(shù)下降/突變；生長卵泡和成熟卵泡降低，排卵抑制，受孕力下降；干擾卵巢內(nèi)分泌，影響受精/著床/胚胎發(fā)育生殖道的損害：影響運送卵子/受精/受精卵發(fā)育對下丘腦-垂體系統(tǒng)的損害：閉經(jīng)，受孕力降低。11對雌性生殖系統(tǒng)的毒作用對卵巢的損害：卵母細(xì)胞數(shù)下降/突變；生12是檢查外源化學(xué)物對動物生育繁殖機能有無損害作用的試驗。

評定的主要依據(jù)是交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過程情況（正常妊娠率）、子代動物分娩出生情況（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及斷奶后發(fā)育情況等。二、生殖毒性的評價

12是檢查外源化學(xué)物對動物生育繁殖機能有無損害作用的試驗。三段生殖毒性試驗主要是根據(jù)發(fā)育階段的區(qū)別來設(shè)計的，每一段試驗大致相當(dāng)于上述兩個階段。Ⅰ段：生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗（一般生殖毒性試驗）主要反映妊娠前及妊娠初期的情況Ⅱ段：肧體-胎體毒性試驗（致畸試驗）Ⅲ段：出生前后發(fā)育毒性試驗（圍生期毒性試驗）

反映外源化合物對胚胎發(fā)育后期、母代分娩過程、哺乳期的影響。13三段生殖毒性試驗主要是根據(jù)發(fā)育階段的區(qū)別來設(shè)計的，每一段試驗Ⅰ段：生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗

（一般生殖毒性試驗）目的：評價受試物對配子成熟、交配行為、生育力、胚

胎著床的影響（前述生殖周期的A和B階段）。給藥期：雄性從交配前4周開始染毒，并持續(xù)至交配成功；雌性交配前2周開始染毒（以覆蓋3～4個動情周期），至妊娠第6天受精卵著床。14Ⅰ段：生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗?zāi)康模涸u價受試物對配子成熟15受試動物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔

劑量分組：一般設(shè)立三個劑量組和兩個對照組高劑量組產(chǎn)生輕微毒性癥狀，但其死亡率不大于10%，也不能完全喪失生育能力。相當(dāng)于1/10LD50。低劑量組則不應(yīng)產(chǎn)生任何可觀察到的損害效應(yīng)。相當(dāng)于高劑量組的1/30。中劑量組應(yīng)僅能出現(xiàn)極為輕微的中毒癥狀。如果1000mg/kg體重劑量對生育力無損害作用，或最高劑量可引起親代動物表現(xiàn)一般毒性作用，但對生育力無不利影響，則可不進(jìn)行其他劑量實驗。一般生殖毒性試驗方法原則15受試動物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔一般生殖毒染毒途徑:動物接觸受試物的方法應(yīng)參照人類實際接觸途徑。

交配前雄性動物應(yīng)染毒4-10周，雌性動物2周

一般可混入飼料或飲水中，也可采用灌胃或膠囊法。動物:至少采用一種動物，推薦用大鼠；每組雌雄各20只；雌性動物妊娠13-15天處死，雄性交配成功處死。16染毒途徑:動物接觸受試物的方法應(yīng)參照人類實際接觸途徑。16評價方法1.雄性生殖毒性評價（動物試驗）精子生成分析（精子計數(shù)、形態(tài)學(xué)及其活率）精子功能檢測睪丸標(biāo)志酶活性檢測交配實驗顯性致死試驗17評價方法1.雄性生殖毒性評價（動物試驗）171818191920三代兩窩

2.雌性生殖毒性評價F０（斷奶或出生8周）

F３bF３aF１bF２bF２aF１a給予受試物8到12周

第一次交配第二次交配觀察三個月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況

21天斷乳后給予受試物8到12周

觀察三個月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況

21天斷乳后給予受試物8到12周

20三代兩窩2.雌性生殖毒性評價F０（斷奶或出生8周）21兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗

F２斷奶，檢查發(fā)育情況F２出生，每窩留８只幼仔F１交配斷奶，給予受試物F１（每窩選留幼仔８只，雌雄各半）第１６-１９周雌雄交配出生第８周給予受試物（F０）21兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗F２斷奶，檢查發(fā)育情況F22受孕率:反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況

受孕率＝妊娠雌性動物數(shù)／交配雌性動物數(shù)×100％正常分娩率:

反映雌性動物妊娠過程是否受到影響

幼子出生存活率＝正常分娩雌性動物數(shù)／妊娠動物數(shù)×100％幼仔出生存活率:

反映雌性動物分娩過程是否正常

幼子出生存活率＝出生后4天存活幼子數(shù)／分娩時出生幼子數(shù)×100％幼仔哺育成活率:

反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力

幼子哺乳成活率＝21天斷乳幼子存活數(shù)／出生后4天幼子存活數(shù)×100％觀察指標(biāo)：22受孕率:反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況觀察指

生殖是對親代動物而言，從配子生成、受精到胎體分娩是一生殖過程。

發(fā)育主要是對子代而言，從受精卵到性成熟的青春期甚至一直到衰老都屬于發(fā)育過程。發(fā)育毒性也稱為胚胎毒性。23Ⅱ段：胚體-胎體毒性試驗（致畸試驗）生殖是對親代動物而言，從配子生成、受精到胎體分娩是一24基本概念

1.發(fā)育毒性(developmentaltoxicity)

指出生前經(jīng)父體和(或)母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達(dá)成體之前出現(xiàn)的有害作用，也稱為胚胎毒性。具體表現(xiàn)可分為:生長遲緩:

即胚胎與胎仔的發(fā)育過程在外源化學(xué)物影響下，較正常的發(fā)育過程緩慢。

畸形:

由于外源化學(xué)物干擾，活產(chǎn)胎仔胎兒出生時，某種器官表現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。

功能不全:

即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經(jīng)活動及行為的缺陷或異常。

胚胎死亡:某些外源化學(xué)物在一定劑量范圍內(nèi)，可在胚胎或胎仔發(fā)育期間對胚胎或胎仔具有損害作用，并使其死亡。

24基本概念1.發(fā)育毒性(developmentalto252.畸形、畸胎和致畸物

畸形:器官形態(tài)的異常。

致畸物或致畸原:凡在一定劑量下，能通過母體對胚胎或胎兒正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物。

畸胎:具有畸形的胚胎或胎仔。

致畸試驗:評定外源化學(xué)物是否具有致畸作用的試驗。3.胚胎毒性作用

外源化學(xué)物引起的胎仔生長發(fā)育遲緩和功能缺陷不全的損害作用，對母體無顯著的毒效應(yīng)。

252.畸形、畸胎和致畸物264.母體毒性作用

母體毒性作用是指外源化學(xué)物在一定劑量下，對受孕母體產(chǎn)生的損害作用。具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥伏、直至死亡。母體毒性作用與致畸作用關(guān)系具有致畸作用，但無母體毒性出現(xiàn)。出現(xiàn)致畸作用的同時也表現(xiàn)母體毒性。不具有特定致畸作用機理，但可破壞母體正常生理穩(wěn)態(tài)。僅具有母體毒性，但不具有致畸作用。在一定劑量下，既不呈現(xiàn)母體毒性，也未見致畸作用。

264.母體毒性作用275.畸形與變異在胚胎或胎兒出現(xiàn)器官形態(tài)結(jié)構(gòu)異常稱為畸形。機體的形態(tài)結(jié)構(gòu)或生理功能，在同一物種的子代與親代之間或子代的個體之間，有時出現(xiàn)不完全相同的現(xiàn)象，即為變異。275.畸形與變異28致畸作用的毒理學(xué)特點

器官發(fā)生期的胚胎對致畸物最為敏感劑量與效應(yīng)關(guān)系較為復(fù)雜劑量效應(yīng)關(guān)系復(fù)雜的表現(xiàn)及原因：在一定范圍內(nèi)，畸胎率與劑量成正比，當(dāng)高到一定水平引起胚胎死亡而掩蓋了致畸作用，畸胎率反而會下降。致畸作用的劑量效應(yīng)曲線較為陡峭，斜率很大。

致畸帶：從無作用劑量到胚胎死亡劑量的范圍28致畸作用的毒理學(xué)特點器官發(fā)生期的胚胎對致畸物最為敏感29種屬差異以及個體差異在致畸作用中較為明顯在不同動物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的類型也不一致。種間差異即同一物種中不同品系之間存在的差異，在致畸作用中也極明顯。

致畸作用的毒理學(xué)特點

29種屬差異以及個體差異在致畸作用中較為明顯致畸作用的毒理學(xué)30致畸作用機理

Wilsom(1977)提出了畸形發(fā)生的9種機制，包括突變、染色體斷裂、有絲分裂改變、改變核酸完整性或功能、減少前體或底物的補給、減少能源支持、改變膜特性、滲透壓不平衡和酶抑制作用。近年來在分子水平的研究有很大的進(jìn)展，雖然胚胎有代償機制彌補外源性化學(xué)物的影響，但是，是否產(chǎn)生畸形依賴于在致病過程中的每個步驟在損傷和修復(fù)之間的平衡。

30致畸作用機理Wilsom(1977)提出了Wilson發(fā)育毒理學(xué)基本原理（一）對致畸的易感性取決于孕體的基因型及其與有害環(huán)境因子相互作用的方式。（二）對致畸的易感性隨著對有害因素暴露的發(fā)育時期的不同而變化。（三）致畸物以特異的方式（作用機制）作用于發(fā)育的細(xì)胞和組織，啟動一系列的異常發(fā)育事件（細(xì)胞病理機制）。（四）有害影響能否接近發(fā)育中的組織取決于有害影響本身的性質(zhì)。（五）異常發(fā)育的四種表型是：死亡、畸形、生長遲緩和功能缺陷。（六）隨著劑量的增加，異常發(fā)育表型的頻率和程度也隨之增加，從無毒作用到全部致死。Wilson發(fā)育毒理學(xué)基本原理（一）對致畸的易感性取決于孕體32基因突變引起胚胎發(fā)育異常細(xì)胞死亡和增致速度減慢細(xì)胞間通訊抑制胚胎中間代謝障礙胚胎組織發(fā)育過程的不協(xié)調(diào)

致畸作用機制

32基因突變引起胚胎發(fā)育異常致畸作用機制33外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評價

傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗主要試驗方案：由美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）首先提出。1.三段生殖毒性試驗主要用于評價藥物的生殖發(fā)育毒性。2.一代和多代生殖毒性試驗主要用于評價食品添加劑、農(nóng)藥及其他化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性。3.改進(jìn)的大鼠發(fā)育神經(jīng)毒性的試驗程序。33外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評價傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗34動物選擇:

致畸試驗的動物選擇，除參照毒性試驗中選擇動物的一般原則，即食性和對受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價廉外，還應(yīng)特別注意妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近等特點。

通常采用兩種動物：一種嚙齒類，首選大鼠；另一種非嚙齒類推薦家兔。

34動物選擇:35劑量分組：

一般應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試，目的是找出引起母體中毒的劑量。最少設(shè)3個劑量組，另設(shè)對照組。原則上最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過10%。最低劑量組為無母體和胚胎毒性反應(yīng)；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級數(shù)關(guān)系。

一般最高劑量不超過LD50的1/5～1/3，低劑量可為

1／100～1／30。

35劑量分組：36給藥期：

在胚胎器官形成期連續(xù)給藥（由胚胎著床到硬腭閉合），大鼠孕后6～15天，家兔6～18天。

由于致畸作用有極為明確的敏感期，應(yīng)精確掌握動物接觸受試物的時間，必須在器官發(fā)生期。

36給藥期：37動物交配處理：

每組動物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動物3～4只。

將性成熟雌雄動物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1日。

37動物交配處理：38胎仔檢查：

自然分娩前1-2日將受孕動物處死，剖腹取出子宮及活產(chǎn)胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后約第20天，小鼠第19天，家兔在第29天。38胎仔檢查：39活胎、早期死亡胚胎（包括吸收胚胎）、晚期死亡胚胎的鑒別方法：

（1）活胎：胚胎已完整成形，色鮮紅，有自然運動，機械刺激后有運動反應(yīng)。

（2）早期死亡胚胎：胚胎的大小、外形和色澤可因死亡時間的相對遲早及死后自溶時間的長短變化很大，一般胎盤較小或不明顯，胚胎形體較小，外形不完整，各部位發(fā)育尚未完全，呈紫紅色，無自然動作。39活胎、早期死亡胚胎（包括吸收胚胎）、晚期死亡胚胎的鑒別方40早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外觀，也分不清胚胎和胎盤，僅在子宮內(nèi)膜上隆起如一小瘤，故有人稱它為胎膜瘤；如已完全被吸收，則可稱為吸收點，即為最早的早期死胎。

（3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明顯胎盤，但色澤灰暗，無光澤，無自然運動，機械刺激后亦無運動反應(yīng)。40早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外觀，也分不清胚胎和41下列幾方面進(jìn)行畸形檢查：外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等。畸形檢查只限活產(chǎn)胎仔。

41下列幾方面進(jìn)行畸形檢查：42結(jié)果評定：活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù):即根據(jù)出現(xiàn)的畸形總數(shù)，計算每個活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)的畸形平均數(shù)。活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)＝畸形總數(shù)／活產(chǎn)幼子總數(shù)畸形出現(xiàn)率：即作為畸胎的幼仔在活產(chǎn)幼仔總數(shù)中所占的百分率。

畸胎出現(xiàn)率＝出現(xiàn)畸形的胎仔總數(shù)／活產(chǎn)胎仔總數(shù)母體畸胎出現(xiàn)率:即出現(xiàn)畸形胎仔的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。母體畸胎出現(xiàn)率＝出現(xiàn)畸胎的母體數(shù)／妊娠母體數(shù)42結(jié)果評定：43致畸指數(shù)=母體LD50/最小致畸劑量致畸危險指數(shù)=最大不致畸劑量/最大可能攝入量

致畸指數(shù)可用于判定致畸作用帶的寬窄和致畸性的強弱。致畸指數(shù)小于10者一般不致畸，10～100者為致畸，大于100者為強致畸。對于有害物質(zhì)在食品中存在時人體受害幾率，可計算致畸危害指數(shù)。指數(shù)大于300,對人危害?。?00～300對人危害中等；小于100對人危害大。母體毒性／發(fā)育毒性（對母體最低損害作用劑量A／胎仔最低損害作用劑量D）：比值越大，危險性越高。A／D≥3,具有發(fā)育毒性危險性；A／D<3，相對危險較低或不具危險性。43致畸指數(shù)=母體LD50/最小致畸劑量基準(zhǔn)A類B類C類D類1.最小母體中毒劑量與最小致畸劑量之比值遠(yuǎn)大于1大于1或兩劑量間有很大重疊小于1母體中毒時無致畸2.畸胎率高，與劑量有關(guān)高，與劑量有關(guān)低，但與劑量有關(guān)-3.較低劑量的致畸種類有特定的器官系統(tǒng)一般為多發(fā)性，也可能有某些特點

無特異性，廣泛多發(fā)-4.靶細(xì)胞特定細(xì)胞特定細(xì)胞泛化，非特定細(xì)胞不詳5.安全系數(shù)范圍～400～300～250～100化學(xué)物致畸能力分類44基準(zhǔn)A類B類C類D類1.最小母體中毒劑量與最小致畸劑量之比值45確定受試物是否具有致畸作用時需注意以下幾點：任何結(jié)果必須通過統(tǒng)計計算方法進(jìn)行劑量組與對照組對比；必須具有統(tǒng)計學(xué)意義才能認(rèn)為是陽性結(jié)果。

應(yīng)該掌握所用實驗動物品系的自然畸形發(fā)生率。致畸作用中動物物種和品系差異較為顯著，因此要求在兩種動物進(jìn)行試驗。由于物種差異，對動物不具有致畸作用的外源化學(xué)物對人是否致畸的問題，應(yīng)格外認(rèn)真對待。45確定受試物是否具有致畸作用時需注意以下幾點：46發(fā)育毒性的替代試驗

大鼠全胚胎培養(yǎng)

胚胎細(xì)胞微團培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞試驗發(fā)育毒性的體內(nèi)預(yù)篩試驗(C.K.試驗)46發(fā)育毒性的替代試驗Ⅲ段：出生前后發(fā)育毒性試驗（圍生期毒性試驗）目的：評價母體從著床至斷乳期間接觸受試物對妊娠/哺乳母體和對胎仔及仔代直至性成熟的有害效應(yīng)。受試動物：多用大鼠，也可用小鼠或家兔

給藥期：雌性動物給藥期應(yīng)從胚胎硬腭閉合至哺乳結(jié)束，通常大小鼠為妊娠第15天開始至分娩28天和21天，家兔于妊娠第22天至分娩后31天。動物處理：雌性動物分娩并飼養(yǎng)其子代至離乳，每窩選擇雌、雄子代各1只，飼養(yǎng)至成年，然后進(jìn)行交配檢測其生殖能力。47Ⅲ段：出生前后發(fā)育毒性試驗（圍生期毒性試驗）目的：評價母體從48Thanks！48Thanks！第八講

生殖發(fā)育毒性及其試驗與評價方法第八講生殖發(fā)育毒性及其試驗與評價方法50第一節(jié)

概述

哺乳動物的生育繁殖過程外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響外源化學(xué)物對生殖發(fā)育損害作用的特點

2第一節(jié)概述51哺乳動物的生育繁殖過程

生殖發(fā)育是哺乳動物繁衍種族的生理過程，其中包含生殖細(xì)胞發(fā)生（即精子發(fā)生和卵細(xì)胞發(fā)生）、配子的釋放、性周期和性行為、卵細(xì)胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或著床、胚胎形成、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生（或稱器官形成）、胎仔發(fā)育、分娩和哺乳過程。

生殖發(fā)育也可稱繁殖過程。3哺乳動物的生育繁殖過程生殖發(fā)育是哺乳動物繁連續(xù)、完整的生殖發(fā)育過程的六個階段A.從交配前到受孕：檢查成年雄性和雌性生殖功能、配子的發(fā)育與成熟、交配行為、受精。B.從受孕到著床：檢查成年雌性生殖功能、胚胎著床前發(fā)育、著床。C.從著床到硬腭閉合：檢查成年雌性生殖功能、肧體發(fā)育、主要器官形成。D.從硬腭閉合到妊娠結(jié)束：檢查成年雌性生殖功能、胎體的發(fā)育與生長、器官的發(fā)育與生長。E.從出生到斷乳：檢查成年雌性生殖功能、新生仔對宮外生活的適應(yīng)性、斷乳前的發(fā)育與生長。F.從斷乳到性成熟：檢查斷乳后的發(fā)育與生長、對獨立生活的適應(yīng)、達(dá)到完全的性功能。52連續(xù)、完整的生殖發(fā)育過程的六個階段A.從交配前到受孕：檢查成53外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用?？梢酝ㄟ^對內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是對性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經(jīng)系統(tǒng)對內(nèi)分泌功能也有調(diào)節(jié)作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸)兩條途徑作用于生殖發(fā)育過程

。

5外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損54外源化學(xué)物對生殖發(fā)育損害作用的特點

生殖發(fā)育過程較機體其他系統(tǒng)更為敏感；外源化學(xué)物對生殖發(fā)育過程影響的范圍較為廣泛和深遠(yuǎn)。不僅直接涉及雌雄兩性個體，同時還對其第二代甚至以后世代的個體產(chǎn)生影響。

6外源化學(xué)物對生殖發(fā)育損害作用的特點生殖發(fā)育過程較機體其他55第二節(jié)

生殖毒性及其評價

生殖毒性的表現(xiàn)生殖毒性的評價方法7第二節(jié)生殖毒性及其評價561950年美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，懷孕期間服用黃體酮，先后有600多名女嬰出現(xiàn)生殖器男性化畸形

。1956年用于治療妊娠反應(yīng)的反應(yīng)停，1961年后出現(xiàn)近萬例短肢畸形兒(海豹畸形)。二惡英(TCDD)造成的大面積污染及其與人群生殖危害的關(guān)系至今仍不清楚

。過去半個世紀(jì)震驚全球的系列中毒或災(zāi)難事件的發(fā)生，在世界范圍內(nèi)提高了人們對用藥的安全意識，高度關(guān)注新的化學(xué)物對生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)或妊娠結(jié)局的不良影響，促進(jìn)了與生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)安全相關(guān)法律的產(chǎn)生和研究方法指南的問世。

81950年美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，懷孕期間服用黃體酮，先57一、生殖毒性表現(xiàn)

外源化學(xué)物對生殖的過程的損害作用可以表現(xiàn)為性淡漠，性無能或各種形式的性功能減退。雌性可出現(xiàn)排卵規(guī)律改變，月經(jīng)失調(diào)或失經(jīng)，卵巢萎縮，受孕減少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表現(xiàn)為睪丸萎縮或壞死，精子數(shù)目減少。

9一、生殖毒性表現(xiàn)外源化學(xué)物對生殖的過程的損害作對雄性生殖系統(tǒng)的毒作用直接損傷睪丸中的細(xì)胞群對精子發(fā)生的有害作用繼發(fā)性的影響精子發(fā)生改變下丘腦-垂體功能直接影響睪丸細(xì)胞功能精子生成障礙性欲異常，喪失生育能力引起生殖細(xì)胞突變，造成可遺傳損害58對雄性生殖系統(tǒng)的毒作用直接損傷睪丸中的細(xì)胞群對精子發(fā)生的有害對雌性生殖系統(tǒng)的毒作用對卵巢的損害：卵母細(xì)胞數(shù)下降/突變；生長卵泡和成熟卵泡降低，排卵抑制，受孕力下降；干擾卵巢內(nèi)分泌，影響受精/著床/胚胎發(fā)育生殖道的損害：影響運送卵子/受精/受精卵發(fā)育對下丘腦-垂體系統(tǒng)的損害：閉經(jīng)，受孕力降低。59對雌性生殖系統(tǒng)的毒作用對卵巢的損害：卵母細(xì)胞數(shù)下降/突變；生60是檢查外源化學(xué)物對動物生育繁殖機能有無損害作用的試驗。

評定的主要依據(jù)是交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過程情況（正常妊娠率）、子代動物分娩出生情況（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及斷奶后發(fā)育情況等。二、生殖毒性的評價

12是檢查外源化學(xué)物對動物生育繁殖機能有無損害作用的試驗。三段生殖毒性試驗主要是根據(jù)發(fā)育階段的區(qū)別來設(shè)計的，每一段試驗大致相當(dāng)于上述兩個階段。Ⅰ段：生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗（一般生殖毒性試驗）主要反映妊娠前及妊娠初期的情況Ⅱ段：肧體-胎體毒性試驗（致畸試驗）Ⅲ段：出生前后發(fā)育毒性試驗（圍生期毒性試驗）

反映外源化合物對胚胎發(fā)育后期、母代分娩過程、哺乳期的影響。61三段生殖毒性試驗主要是根據(jù)發(fā)育階段的區(qū)別來設(shè)計的，每一段試驗Ⅰ段：生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗

（一般生殖毒性試驗）目的：評價受試物對配子成熟、交配行為、生育力、胚

胎著床的影響（前述生殖周期的A和B階段）。給藥期：雄性從交配前4周開始染毒，并持續(xù)至交配成功；雌性交配前2周開始染毒（以覆蓋3～4個動情周期），至妊娠第6天受精卵著床。62Ⅰ段：生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗?zāi)康模涸u價受試物對配子成熟63受試動物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔

劑量分組：一般設(shè)立三個劑量組和兩個對照組高劑量組產(chǎn)生輕微毒性癥狀，但其死亡率不大于10%，也不能完全喪失生育能力。相當(dāng)于1/10LD50。低劑量組則不應(yīng)產(chǎn)生任何可觀察到的損害效應(yīng)。相當(dāng)于高劑量組的1/30。中劑量組應(yīng)僅能出現(xiàn)極為輕微的中毒癥狀。如果1000mg/kg體重劑量對生育力無損害作用，或最高劑量可引起親代動物表現(xiàn)一般毒性作用，但對生育力無不利影響，則可不進(jìn)行其他劑量實驗。一般生殖毒性試驗方法原則15受試動物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔一般生殖毒染毒途徑:動物接觸受試物的方法應(yīng)參照人類實際接觸途徑。

交配前雄性動物應(yīng)染毒4-10周，雌性動物2周

一般可混入飼料或飲水中，也可采用灌胃或膠囊法。動物:至少采用一種動物，推薦用大鼠；每組雌雄各20只；雌性動物妊娠13-15天處死，雄性交配成功處死。64染毒途徑:動物接觸受試物的方法應(yīng)參照人類實際接觸途徑。16評價方法1.雄性生殖毒性評價（動物試驗）精子生成分析（精子計數(shù)、形態(tài)學(xué)及其活率）精子功能檢測睪丸標(biāo)志酶活性檢測交配實驗顯性致死試驗65評價方法1.雄性生殖毒性評價（動物試驗）176618671968三代兩窩

2.雌性生殖毒性評價F０（斷奶或出生8周）

F３bF３aF１bF２bF２aF１a給予受試物8到12周

第一次交配第二次交配觀察三個月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況

21天斷乳后給予受試物8到12周

觀察三個月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況

21天斷乳后給予受試物8到12周

20三代兩窩2.雌性生殖毒性評價F０（斷奶或出生8周）69兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗

F２斷奶，檢查發(fā)育情況F２出生，每窩留８只幼仔F１交配斷奶，給予受試物F１（每窩選留幼仔８只，雌雄各半）第１６-１９周雌雄交配出生第８周給予受試物（F０）21兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗F２斷奶，檢查發(fā)育情況F70受孕率:反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況

受孕率＝妊娠雌性動物數(shù)／交配雌性動物數(shù)×100％正常分娩率:

反映雌性動物妊娠過程是否受到影響

幼子出生存活率＝正常分娩雌性動物數(shù)／妊娠動物數(shù)×100％幼仔出生存活率:

反映雌性動物分娩過程是否正常

幼子出生存活率＝出生后4天存活幼子數(shù)／分娩時出生幼子數(shù)×100％幼仔哺育成活率:

反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力

幼子哺乳成活率＝21天斷乳幼子存活數(shù)／出生后4天幼子存活數(shù)×100％觀察指標(biāo)：22受孕率:反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況觀察指

生殖是對親代動物而言，從配子生成、受精到胎體分娩是一生殖過程。

發(fā)育主要是對子代而言，從受精卵到性成熟的青春期甚至一直到衰老都屬于發(fā)育過程。發(fā)育毒性也稱為胚胎毒性。71Ⅱ段：胚體-胎體毒性試驗（致畸試驗）生殖是對親代動物而言，從配子生成、受精到胎體分娩是一72基本概念

1.發(fā)育毒性(developmentaltoxicity)

指出生前經(jīng)父體和(或)母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達(dá)成體之前出現(xiàn)的有害作用，也稱為胚胎毒性。具體表現(xiàn)可分為:生長遲緩:

即胚胎與胎仔的發(fā)育過程在外源化學(xué)物影響下，較正常的發(fā)育過程緩慢。

畸形:

由于外源化學(xué)物干擾，活產(chǎn)胎仔胎兒出生時，某種器官表現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。

功能不全:

即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經(jīng)活動及行為的缺陷或異常。

胚胎死亡:某些外源化學(xué)物在一定劑量范圍內(nèi)，可在胚胎或胎仔發(fā)育期間對胚胎或胎仔具有損害作用，并使其死亡。

24基本概念1.發(fā)育毒性(developmentalto732.畸形、畸胎和致畸物

畸形:器官形態(tài)的異常。

致畸物或致畸原:凡在一定劑量下，能通過母體對胚胎或胎兒正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物。

畸胎:具有畸形的胚胎或胎仔。

致畸試驗:評定外源化學(xué)物是否具有致畸作用的試驗。3.胚胎毒性作用

外源化學(xué)物引起的胎仔生長發(fā)育遲緩和功能缺陷不全的損害作用，對母體無顯著的毒效應(yīng)。

252.畸形、畸胎和致畸物744.母體毒性作用

母體毒性作用是指外源化學(xué)物在一定劑量下，對受孕母體產(chǎn)生的損害作用。具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥伏、直至死亡。母體毒性作用與致畸作用關(guān)系具有致畸作用，但無母體毒性出現(xiàn)。出現(xiàn)致畸作用的同時也表現(xiàn)母體毒性。不具有特定致畸作用機理，但可破壞母體正常生理穩(wěn)態(tài)。僅具有母體毒性，但不具有致畸作用。在一定劑量下，既不呈現(xiàn)母體毒性，也未見致畸作用。

264.母體毒性作用755.畸形與變異在胚胎或胎兒出現(xiàn)器官形態(tài)結(jié)構(gòu)異常稱為畸形。機體的形態(tài)結(jié)構(gòu)或生理功能，在同一物種的子代與親代之間或子代的個體之間，有時出現(xiàn)不完全相同的現(xiàn)象，即為變異。275.畸形與變異76致畸作用的毒理學(xué)特點

器官發(fā)生期的胚胎對致畸物最為敏感劑量與效應(yīng)關(guān)系較為復(fù)雜劑量效應(yīng)關(guān)系復(fù)雜的表現(xiàn)及原因：在一定范圍內(nèi)，畸胎率與劑量成正比，當(dāng)高到一定水平引起胚胎死亡而掩蓋了致畸作用，畸胎率反而會下降。致畸作用的劑量效應(yīng)曲線較為陡峭，斜率很大。

致畸帶：從無作用劑量到胚胎死亡劑量的范圍28致畸作用的毒理學(xué)特點器官發(fā)生期的胚胎對致畸物最為敏感77種屬差異以及個體差異在致畸作用中較為明顯在不同動物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的類型也不一致。種間差異即同一物種中不同品系之間存在的差異，在致畸作用中也極明顯。

致畸作用的毒理學(xué)特點

29種屬差異以及個體差異在致畸作用中較為明顯致畸作用的毒理學(xué)78致畸作用機理

Wilsom(1977)提出了畸形發(fā)生的9種機制，包括突變、染色體斷裂、有絲分裂改變、改變核酸完整性或功能、減少前體或底物的補給、減少能源支持、改變膜特性、滲透壓不平衡和酶抑制作用。近年來在分子水平的研究有很大的進(jìn)展，雖然胚胎有代償機制彌補外源性化學(xué)物的影響，但是，是否產(chǎn)生畸形依賴于在致病過程中的每個步驟在損傷和修復(fù)之間的平衡。

30致畸作用機理Wilsom(1977)提出了Wilson發(fā)育毒理學(xué)基本原理（一）對致畸的易感性取決于孕體的基因型及其與有害環(huán)境因子相互作用的方式。（二）對致畸的易感性隨著對有害因素暴露的發(fā)育時期的不同而變化。（三）致畸物以特異的方式（作用機制）作用于發(fā)育的細(xì)胞和組織，啟動一系列的異常發(fā)育事件（細(xì)胞病理機制）。（四）有害影響能否接近發(fā)育中的組織取決于有害影響本身的性質(zhì)。（五）異常發(fā)育的四種表型是：死亡、畸形、生長遲緩和功能缺陷。（六）隨著劑量的增加，異常發(fā)育表型的頻率和程度也隨之增加，從無毒作用到全部致死。Wilson發(fā)育毒理學(xué)基本原理（一）對致畸的易感性取決于孕體80基因突變引起胚胎發(fā)育異常細(xì)胞死亡和增致速度減慢細(xì)胞間通訊抑制胚胎中間代謝障礙胚胎組織發(fā)育過程的不協(xié)調(diào)

致畸作用機制

32基因突變引起胚胎發(fā)育異常致畸作用機制81外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評價

傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗主要試驗方案：由美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）首先提出。1.三段生殖毒性試驗主要用于評價藥物的生殖發(fā)育毒性。2.一代和多代生殖毒性試驗主要用于評價食品添加劑、農(nóng)藥及其他化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性。3.改進(jìn)的大鼠發(fā)育神經(jīng)毒性的試驗程序。33外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評價傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗82動物選擇:

致畸試驗的動物選擇，除參照毒性試驗中選擇動物的一般原則，即食性和對受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價廉外，還應(yīng)特別注意妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近等特點。

通常采用兩種動物：一種嚙齒類，首選大鼠；另一種非嚙齒類推薦家兔。

34動物選擇:83劑量分組：

一般應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試，目的是找出引起母體中毒的劑量。最少設(shè)3個劑量組，另設(shè)對照組。原則上最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過10%。最低劑量組為無母體和胚胎毒性反應(yīng)；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級數(shù)關(guān)系。

一般最高劑量不超過LD50的1/5～1/3，低劑量可為

1／100～1／30。

35劑量分組：84給藥期：

在胚胎器官形成期連續(xù)給藥（由胚胎著床到硬腭閉合），大鼠孕后6～15天，家兔6～18天。

由于致畸作用有極為明確的敏感期，應(yīng)精確掌握動物接觸受試物的時間，必須在器官發(fā)生期。

36給藥期：85動物交配處理：

每組動物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動物3～4只。

將性成熟雌雄動物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1日。

37動物交配處理：86胎仔檢查：

自然分娩前1-2日將受孕動物處死，剖腹取出子宮及活產(chǎn)胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后約第20天，小鼠第19天，家兔在第29天。38胎仔檢查：87活胎、早期死亡胚胎（包括吸收胚胎）、晚期死亡胚胎的鑒別方法：

（1）活胎：胚胎已完整成形，色鮮紅，有自然運動，機械刺激后有運動反應(yīng)。

（2）早期死亡胚胎：胚胎的大小、外形和色澤可因死亡時間的相對遲早及死后自溶時間的長短變化很大，一般胎盤較小或不明顯，胚胎形體較小，外形不完整，各部位發(fā)育尚