基因工程-第6章-基因文庫的構建與目的基因的獲得課件

第六章基因文庫的構建與目的基因的獲得第六章基因文庫的構建與目的基因的獲得1基因工程主要是通過人工的方法分離、改造、擴增并表達生物的特定基因，從而深入開展核酸遺傳研究或者獲取有價值的基因產(chǎn)物。通常將那些已被或者準備要被分離、改造、擴增或表達的特定基因或DNA片段，稱為目的基因。要從數(shù)以萬計的核苷酸序列中挑選出非常小的所感興趣的目的基因，是基因工程中的第一個難題。欲想獲得某個目的基因，必須對其有所了解，然后根據(jù)目的基因的性質制定分離的方案?；蚬こ讨饕峭ㄟ^人工的方法分離、改造、擴增并表達生物的特定2

目前主要應用化學合成法、目的基因的直接分離法和逆轉錄法來分離、獲得目的基因。PCR技術的問世及其在基因工程中廣泛應用，已經(jīng)大大簡化了構建和篩選cDNA文庫的工作。此外，新發(fā)展起來的轉座子標簽法（transposontagging）、mRNA差異顯示法（mRNAdifferentialdisply）、RFLP及ESTs等技術也已經(jīng)在分子克隆工作中展現(xiàn)出廣闊的前景。目前主要應用化學合成法、目的基因的直接分離法和逆轉錄法來分36.1基因文庫的構建基因組文庫（genomicDNAlibrary）是指將基因組DNA通過限制性內切酶部分酶切后（必要時對這些DNA片段進行密度梯度離心或經(jīng)制備型凝膠電泳進行分級分離，以選擇長度適合于插入載體的片段）所產(chǎn)生的基因組片段隨機地同相應的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。6.1基因文庫的構建41975年，Clarke和Carbon提出了計算文庫中任一DNA序列重組子數(shù)目的公式，即N=ln(1-P)/ln(1-f)N為所需要的重組體的數(shù)目，P為選出某一基因的期望概率（通常期望為99%），f為單個重組體中的平均插入片段與基因組DNA總量之比。1975年，Clarke和Carbon提出了計算文庫中任一D5例如要在一哺乳動物基因組（3×109bp）的17kb片段的文庫中，使含有一給定DNA序列達99%的概率，則需N=ln(1-0.99)/ln[1-(1.7×104bp/3×109bp)]=8.1×105即所建的文庫至少含有8.1×105以上的重組體，才能代表整個的基因組。

例如要在一哺乳動物基因組（3×109bp）的17kb片段的文6基因組DNA文庫有著非常廣泛的用途。如用以分析、分離特定的基因片段；通過染色體步行（chromasomewalking）研究基因的組織結構；用于基因表達調空研究；用于人類及動、植物基因組工程的研究等等?；蚪M文庫的構建一般包括下列基本步驟：（1）細胞染色體大分子DNA的提取和大片段的制備；（2）載體DNA的制備；（3）載體與外源大片段的連接；（4）體外包裝及基因組DNA文庫的擴增；（5）重組DNA的篩選和鑒定。基因組DNA文庫有著非常廣泛的用途。如用以分析、分離特定的基7基因工程-第6章-基因文庫的構建與目的基因的獲得課件86.2cDNA的合成和克隆6.2.1cDNA文庫（cDNAlibrary）的構建和基因的分離cDNA的克隆對于特定基因的分離和特性研究是極有價值的工具。cDNA文庫最關鍵的特征是它包括在特定的組織或細胞類型中已經(jīng)被轉錄成mRNA的那些基因序列，這樣使得cDNA文庫的復雜性要比基因組文庫要低得多。由于不同的細胞類型、發(fā)育階段以及細胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達所決定的，因此各自的mRNA的種類就不同，由此而產(chǎn)生獨特的cDNA文庫。6.2cDNA的合成和克隆9

構建cDNA文庫通常包括：（1）mRNA的提取及其完整性的確定；（2）cDNA的合成和克隆；（3）目的cDNA的鑒定等步驟。(1)總RNA的提取(2)mRNA的分離(3)mRNA的純化(4)cDNA第一條鏈的合成:①隨機引物法；②oligo-dT(12-18)引物法(5)cDNA第二條鏈的合成(6)cDNA的甲基化和接頭的加入(7)cDNA同載體的連接(8)噬菌體蛋白的體外包裝（9）噬菌斑原位雜交分離基因構建cDNA文庫通常包括：（1）mRNA的提取及其完整性的10基因工程-第6章-基因文庫的構建與目的基因的獲得課件11基因工程-第6章-基因文庫的構建與目的基因的獲得課件12總RNA的提取凡與RNA操作有關的玻璃器皿經(jīng)常規(guī)洗凈后，用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡處理（37℃，2小時），再用滅菌雙蒸水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4小時以上或180℃8小時以上。塑料器材最好使用滅菌的一次性使用的塑料用品，Eppendorf管、微量加樣吸頭最好是新的，使用前進行高壓滅菌。所有溶液應加DEPC至終濃度0.05%-0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理。DEPC易與Tris反應，配制Tris溶液的水應先用0.1%DEPC處理，高壓消毒，配好后再高壓消毒?？俁NA的提取131異硫氰酸胍----熱苯酚法1）將實驗用的全部用品用0.1%的DEPC水浸泡過夜，然后高壓滅菌，玻璃器皿在180℃烘烤8h以上，塑料制品80℃烘干。2）將0.1g組織樣品在研缽中迅速研成粉末，放入裝有1mlGITC試劑的勻漿管中勻漿。勻漿液取出放在1.5ml離心管中，吸打幾次以剪切染色質DNA，60℃溫浴10min。3）加入等體積60℃苯酚，混勻，抽提。4）冰中冷卻，10000rpm離心10min。取上清，用熱苯酚重復抽提一次。1異硫氰酸胍----熱苯酚法145）等體積氯仿在室溫下抽提1-2次后，上清加1/10體積3M乙酸鈉和3倍體積無水乙醇，在－20℃沉淀過夜。6）12000rpm離心15min，沉淀溶于0.5mlSTE中，加蛋白酶K至200μg/ml，56℃消化1h。等體積熱苯酚：氯仿抽提，冷卻離心，重復一次。7）上清加2.5倍體積無水乙醇沉淀過液。離心，70%乙醇洗沉淀，干燥后，溶于適量DEPC水中。5）等體積氯仿在室溫下抽提1-2次后，上清加1/10體積3M152用TRIZOL試劑盒提取總RNA1)勻漿在1ml的TRIZOL試劑中加50-100mg組織，樣本體積不應超過TRIZOL的10%。用勻漿機高速勻漿2分鐘。2)（可選）要分離蛋白、脂肪、多糖或細胞外物質如肌肉、脂肪組織，在勻漿后2-8℃12000g離心10分鐘。將上清勻轉移至一新的Eppendof管。3)分相15-30℃溫育5分鐘，完全解離核蛋白復合體。加0.2ml氯仿，用力搖動15秒，15-30℃放置2-3分鐘。小于12000g2-8℃離心15分鐘。2用TRIZOL試劑盒提取總RNA164)RNA的沉淀轉移水相于一新管。加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘。4-8℃12000g離心10分鐘（離心前RNA通常不可見，在管壁或管底形成膠樣沉淀）。5）RNA沉淀的洗滌棄上清，每1mlTRIZOL至少加1ml75%的乙醇洗滌RNA一次。2-8℃小于7500g離心5分鐘。6）RNA的重溶倒掉乙醇，空氣中干燥或真空干燥5-10分鐘。加適當?shù)腄EPC處理水，吸打幾次，放于55-60℃溶解10分鐘。-70℃保存。4)RNA的沉淀17RNA變性電泳方法Ⅰ在一滅菌微量離心管中混合下列液體，以制備RNA樣品。

RNA9μl10×TAE4μl甲醛7μl甲酰胺20μl總體積40μl

混勻后，65℃溫育15min，取出置冰上。加入RNA上樣緩沖液，用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳buffer為1×TAE。RNA變性電泳18mRNA的分離和純化具體操作按OligotexmRNAMiniKit說明進行。500μg總RNA于1.5ml離心管中用DEPC處理過的水調至500μl。加OBB500μl和OligotexSuspension45μl,充分混勻。70℃30分鐘取出反應，室溫放置10分鐘。12000rpm離心2分鐘，沉淀。用OW2400μl重懸沉淀，然后移到一小離心柱中，12000rpm,離心１分鐘。mRNA的分離和純化19總RNA和mRNA總RNA和mRNA20將這小離心柱移入一新1.5ml離心管中，加400μlOW2，12000rpm,離心１分鐘。將這小離心柱移入一新1.5ml離心管中，加20μl熱（70℃）OEB到離心柱中，用槍上下吹吸３－４次，12000rpm,離心１分鐘。再加2５μl熱（70℃）OEB到離心柱中，用槍上下吹吸３－４次，12000rpm,離心１分鐘。將這小離心柱移入一新1.5ml離心管中，加400μlOW221第一鏈的合成在1.5ml離心管中，按順序加入以下試劑：10×firststrandbuffer5.0μlFirststrandMethylNucleotidemixture5.0μlLinker-primer(1.4μg/μl)2.0μlDEPCwater30.5μlRNaseBlockRibonucleaseInhibitor(40u/μl)1.0μl第一鏈的合成22振蕩混勻，然后加入5μl（5μg）mRNA,混勻。室溫放置10分鐘，以便模板和引物退火。加入3.5μlMMLV-RT(20u/μl),終體積50μl，混勻，稍離心。取出5ｕL放于含有0.5ｕLα-32PdATP的離心管做對照反應。37℃溫育1小時同時準備16℃水浴。將第一鏈反應液取出，放置在冰上振蕩混勻，然后加入5μl（5μg）mRNA,混勻。23第二鏈的合成在冰上按順序往第一鏈反應液中加入以下試劑：10×Secondstrandbuffer20.0μlSecondstranddNTPs6.0μlddH2O108.2μlα-32PdATP2μl稍混勻，離心后加入RNaseH（0.9u/μl）3.5μlDNApolymeraseI(9.0u/μl)11.1μl迅速振蕩管子以混勻，稍離心后，在16℃溫育2.5小時，然后取出放在冰上。注意：在操作過程中必須保證溫度不超過16℃，否則會引起發(fā)夾結構的形成，影響cDNA的克隆。第二鏈的合成24cDNA第一鏈和cDNA第二鏈堿變性瓊脂糖凝膠電泳的同位素X光片cDNA第一鏈和cDNA第二鏈堿變性瓊脂糖凝膠電泳的同位素X25cDNA第一鏈和雙鏈cDNA凝膠電泳cDNA第一鏈和雙鏈cDNA凝膠電泳26

cDNA末端的補平在反應管中加入BlutingdNTPmix23μlpfuDNApolymerase(2.5u/μl)2.0μl混勻后，72℃溫育30分鐘，注意：不能超過30分鐘。取出反應管，加200μl苯酚：氯仿（1：1）抽提。12000rpm室溫離心2分鐘，取上清，用等體積氯仿再抽提1次。取上清，加入20μl3MNaAc(PH5.2)，400μl無水乙醇，-20℃過夜沉淀。12000rpm，4℃，離心60分鐘。70%乙醇洗沉淀，吸出乙醇后，干燥沉淀。將沉淀溶于9.0μl的EcoRIadapters溶液中。4℃放置至少30分鐘，使cDNA完全溶解。cDNA末端的補平27EcoRIadapters的連接在含有cDNA和EcoRIadapters的管中加入10×Ligasebuffer1.0μl10mMrATP1.0μlT4DNAligase(4μg/μl)1.0μl4℃連接兩天，將管放在70℃水欲中30分鐘，以滅活連接酶。EcoRIadapters的連接28EcoRI末端的激活在反應管中加入10×Ligasebuffer1.0μl10mMrATP2.0μl滅菌水6.0μlT4polynucleotidekinase10μg/μl)1.0μl37℃溫育30分鐘。70℃溫育30分鐘以滅活T4polynucleotidekinase1，稍離心。EcoRI末端的激活29

XhoI消化在反映管中加入28.0μlXhoIbuffer,3.0μlXhoI,37℃消化2小時。冷卻至室溫，加入5.0μl10×STEbuffer。這時的cDNA可以進行片段分離了。XhoI消化30cDNA不同大小片段的分離將SepharoseCL-2B和10×STEbuffer從4℃冰箱中取出，平衡至室溫。準備50ml的1×STEbuffer。將柱子固定在一個支架上，輕輕混勻SepharoseCL-2B，用1ml移液器將其加入柱子中。加入10ml1×STEbuffer平衡柱子。當在樹脂液面上剩大約50μlSTE時，立即加入cDNA樣。一旦樣品進入SepharoseCL-2B，用移液槍將連接管加滿1×STEbuffer。當染料達到柱子管壁刻度為-.4ml時開始接收cDNA，每3滴接一管。當染料達到柱子管壁刻度為.3ml時停止接收cDNA，大約接收12管。cDNA不同大小片段的分離31從每管中取8μl跑5%的非變性丙烯酰胺凝膠電泳。將非變性丙烯酰胺凝膠壓片，決定哪幾管用于將來與載體的連接。將大于400bp的接收的cDNA合并成一管，用芬：仿（1：1）抽提。12000rpm,室溫離心2分鐘。取上清，加入等體積的氯仿抽提。12000rpm,室溫離心2分鐘。取上清，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃過液。從-20℃取出沉淀反應，4℃，12000rpm，離心60分鐘。去上清，用80%乙醇洗沉淀，室溫，12000rpm，離心2分鐘。去上清，干燥沉淀，溶于5μl滅菌水中。從每管中取8μl跑5%的非變性丙烯酰胺凝膠電泳。32cDNA片段與載體的連接及噬菌體蛋白的包裝按下列比例將合成的cDNA連接到載體上去。Uni-ZAPXRvector(1μg/μl)1.0μl10×ligasebuffer0.5μl10mMrATP0.5μlcDNAsample～100ngT4DNAligase0.5μl加水至5.0μl4℃連接2天。cDNA片段與載體的連接及噬菌體蛋白的包裝33取出1μl連接產(chǎn)物，加入GigapackIII包裝蛋白進行包裝。22℃溫育2小時，然后加500μlSM緩沖液，20μl氯仿混勻后稍離心，將管子儲存于4℃。準備XL1-BLUEMRF’宿主細菌。取1μl文庫，用SM緩沖液將其稀釋至102、104、105倍等3個梯度，在每個梯度中分別取lμl放入200μlXL1-BLUEMRF’感受態(tài)細胞中。取出1μl連接產(chǎn)物，加入GigapackIII包裝蛋白進3437℃培養(yǎng)15分鐘。然后加入：2-3mlNZY頂層培養(yǎng)基、15μlIPTG和50μlX-gal。IPTG（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷）立即鋪入NZY固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，測定文庫的滴度。文庫的滴度計算公式為：文庫滴度（pfu/ml）＝（噬菌斑數(shù)／加入μl數(shù)）*稀釋倍數(shù)*103μl/ml37℃培養(yǎng)15分鐘。35cDNA文庫噬菌斑照片cDNA文庫噬菌斑照片36cDNA文庫噬菌體PCR電泳圖cDNA文庫噬菌體PCR電泳圖376.2.2從蛋白質已知序列推知C末端5-6個氨基酸的相應DNA序列，合成一組寡聚脫氧核苷酸片段作為引物。在總mRNA中這組引物只與該蛋白質的mRNA可以氫鍵配對，以此引物進行逆轉錄，得到特性cDNA。6.2.3利用RT-PCR技術可以得到特定的cDNA。6.3PCR技術分離基因6.2.2從蛋白質已知序列推知C末端5-6個氨基酸的386.4化學法合成目的基因隨著寡核苷酸的化學合成的自動化，基因的化學合成變的更經(jīng)濟、容易和準確?；瘜W合成基因對那些其他技術方法不易分離的基因尤為重要。6.4.1基因片段的全化學合成首先合成一個基因的所有片段，相鄰的片段間有4-6個堿基的重疊互補，在適當?shù)臈l件下（主要是溫度條件）經(jīng)退火后，用T4DNA連接酶將各片段以磷酸二酯鍵的共價鍵形式連接成一個完整的基因。6.4化學法合成目的基因396.4.2基因的化學-酶促合成此方法是不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相鄰的3’末端有一短的順序相互補，在適當?shù)臈l件下通過退火形成模板-引物復合體（template-primercomplex），然后在存在四種dNTP的條件下，用E.coli的DNA聚合酶I大片段去填補片段之間的缺口，最后用T4DNA連接酶及適當?shù)南拗菩詢惹忻盖懈詈笾亟M入載體。6.4.2基因的化學-酶促合成40第六章基因文庫的構建與目的基因的獲得第六章基因文庫的構建與目的基因的獲得41基因工程主要是通過人工的方法分離、改造、擴增并表達生物的特定基因，從而深入開展核酸遺傳研究或者獲取有價值的基因產(chǎn)物。通常將那些已被或者準備要被分離、改造、擴增或表達的特定基因或DNA片段，稱為目的基因。要從數(shù)以萬計的核苷酸序列中挑選出非常小的所感興趣的目的基因，是基因工程中的第一個難題。欲想獲得某個目的基因，必須對其有所了解，然后根據(jù)目的基因的性質制定分離的方案。基因工程主要是通過人工的方法分離、改造、擴增并表達生物的特定42

目前主要應用化學合成法、目的基因的直接分離法和逆轉錄法來分離、獲得目的基因。PCR技術的問世及其在基因工程中廣泛應用，已經(jīng)大大簡化了構建和篩選cDNA文庫的工作。此外，新發(fā)展起來的轉座子標簽法（transposontagging）、mRNA差異顯示法（mRNAdifferentialdisply）、RFLP及ESTs等技術也已經(jīng)在分子克隆工作中展現(xiàn)出廣闊的前景。目前主要應用化學合成法、目的基因的直接分離法和逆轉錄法來分436.1基因文庫的構建基因組文庫（genomicDNAlibrary）是指將基因組DNA通過限制性內切酶部分酶切后（必要時對這些DNA片段進行密度梯度離心或經(jīng)制備型凝膠電泳進行分級分離，以選擇長度適合于插入載體的片段）所產(chǎn)生的基因組片段隨機地同相應的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。6.1基因文庫的構建441975年，Clarke和Carbon提出了計算文庫中任一DNA序列重組子數(shù)目的公式，即N=ln(1-P)/ln(1-f)N為所需要的重組體的數(shù)目，P為選出某一基因的期望概率（通常期望為99%），f為單個重組體中的平均插入片段與基因組DNA總量之比。1975年，Clarke和Carbon提出了計算文庫中任一D45例如要在一哺乳動物基因組（3×109bp）的17kb片段的文庫中，使含有一給定DNA序列達99%的概率，則需N=ln(1-0.99)/ln[1-(1.7×104bp/3×109bp)]=8.1×105即所建的文庫至少含有8.1×105以上的重組體，才能代表整個的基因組。

例如要在一哺乳動物基因組（3×109bp）的17kb片段的文46基因組DNA文庫有著非常廣泛的用途。如用以分析、分離特定的基因片段；通過染色體步行（chromasomewalking）研究基因的組織結構；用于基因表達調空研究；用于人類及動、植物基因組工程的研究等等?；蚪M文庫的構建一般包括下列基本步驟：（1）細胞染色體大分子DNA的提取和大片段的制備；（2）載體DNA的制備；（3）載體與外源大片段的連接；（4）體外包裝及基因組DNA文庫的擴增；（5）重組DNA的篩選和鑒定?；蚪MDNA文庫有著非常廣泛的用途。如用以分析、分離特定的基47基因工程-第6章-基因文庫的構建與目的基因的獲得課件486.2cDNA的合成和克隆6.2.1cDNA文庫（cDNAlibrary）的構建和基因的分離cDNA的克隆對于特定基因的分離和特性研究是極有價值的工具。cDNA文庫最關鍵的特征是它包括在特定的組織或細胞類型中已經(jīng)被轉錄成mRNA的那些基因序列，這樣使得cDNA文庫的復雜性要比基因組文庫要低得多。由于不同的細胞類型、發(fā)育階段以及細胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達所決定的，因此各自的mRNA的種類就不同，由此而產(chǎn)生獨特的cDNA文庫。6.2cDNA的合成和克隆49

構建cDNA文庫通常包括：（1）mRNA的提取及其完整性的確定；（2）cDNA的合成和克隆；（3）目的cDNA的鑒定等步驟。(1)總RNA的提取(2)mRNA的分離(3)mRNA的純化(4)cDNA第一條鏈的合成:①隨機引物法；②oligo-dT(12-18)引物法(5)cDNA第二條鏈的合成(6)cDNA的甲基化和接頭的加入(7)cDNA同載體的連接(8)噬菌體蛋白的體外包裝（9）噬菌斑原位雜交分離基因構建cDNA文庫通常包括：（1）mRNA的提取及其完整性的50基因工程-第6章-基因文庫的構建與目的基因的獲得課件51基因工程-第6章-基因文庫的構建與目的基因的獲得課件52總RNA的提取凡與RNA操作有關的玻璃器皿經(jīng)常規(guī)洗凈后，用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡處理（37℃，2小時），再用滅菌雙蒸水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4小時以上或180℃8小時以上。塑料器材最好使用滅菌的一次性使用的塑料用品，Eppendorf管、微量加樣吸頭最好是新的，使用前進行高壓滅菌。所有溶液應加DEPC至終濃度0.05%-0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理。DEPC易與Tris反應，配制Tris溶液的水應先用0.1%DEPC處理，高壓消毒，配好后再高壓消毒?？俁NA的提取531異硫氰酸胍----熱苯酚法1）將實驗用的全部用品用0.1%的DEPC水浸泡過夜，然后高壓滅菌，玻璃器皿在180℃烘烤8h以上，塑料制品80℃烘干。2）將0.1g組織樣品在研缽中迅速研成粉末，放入裝有1mlGITC試劑的勻漿管中勻漿。勻漿液取出放在1.5ml離心管中，吸打幾次以剪切染色質DNA，60℃溫浴10min。3）加入等體積60℃苯酚，混勻，抽提。4）冰中冷卻，10000rpm離心10min。取上清，用熱苯酚重復抽提一次。1異硫氰酸胍----熱苯酚法545）等體積氯仿在室溫下抽提1-2次后，上清加1/10體積3M乙酸鈉和3倍體積無水乙醇，在－20℃沉淀過夜。6）12000rpm離心15min，沉淀溶于0.5mlSTE中，加蛋白酶K至200μg/ml，56℃消化1h。等體積熱苯酚：氯仿抽提，冷卻離心，重復一次。7）上清加2.5倍體積無水乙醇沉淀過液。離心，70%乙醇洗沉淀，干燥后，溶于適量DEPC水中。5）等體積氯仿在室溫下抽提1-2次后，上清加1/10體積3M552用TRIZOL試劑盒提取總RNA1)勻漿在1ml的TRIZOL試劑中加50-100mg組織，樣本體積不應超過TRIZOL的10%。用勻漿機高速勻漿2分鐘。2)（可選）要分離蛋白、脂肪、多糖或細胞外物質如肌肉、脂肪組織，在勻漿后2-8℃12000g離心10分鐘。將上清勻轉移至一新的Eppendof管。3)分相15-30℃溫育5分鐘，完全解離核蛋白復合體。加0.2ml氯仿，用力搖動15秒，15-30℃放置2-3分鐘。小于12000g2-8℃離心15分鐘。2用TRIZOL試劑盒提取總RNA564)RNA的沉淀轉移水相于一新管。加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘。4-8℃12000g離心10分鐘（離心前RNA通常不可見，在管壁或管底形成膠樣沉淀）。5）RNA沉淀的洗滌棄上清，每1mlTRIZOL至少加1ml75%的乙醇洗滌RNA一次。2-8℃小于7500g離心5分鐘。6）RNA的重溶倒掉乙醇，空氣中干燥或真空干燥5-10分鐘。加適當?shù)腄EPC處理水，吸打幾次，放于55-60℃溶解10分鐘。-70℃保存。4)RNA的沉淀57RNA變性電泳方法Ⅰ在一滅菌微量離心管中混合下列液體，以制備RNA樣品。

RNA9μl10×TAE4μl甲醛7μl甲酰胺20μl總體積40μl

混勻后，65℃溫育15min，取出置冰上。加入RNA上樣緩沖液，用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳buffer為1×TAE。RNA變性電泳58mRNA的分離和純化具體操作按OligotexmRNAMiniKit說明進行。500μg總RNA于1.5ml離心管中用DEPC處理過的水調至500μl。加OBB500μl和OligotexSuspension45μl,充分混勻。70℃30分鐘取出反應，室溫放置10分鐘。12000rpm離心2分鐘，沉淀。用OW2400μl重懸沉淀，然后移到一小離心柱中，12000rpm,離心１分鐘。mRNA的分離和純化59總RNA和mRNA總RNA和mRNA60將這小離心柱移入一新1.5ml離心管中，加400μlOW2，12000rpm,離心１分鐘。將這小離心柱移入一新1.5ml離心管中，加20μl熱（70℃）OEB到離心柱中，用槍上下吹吸３－４次，12000rpm,離心１分鐘。再加2５μl熱（70℃）OEB到離心柱中，用槍上下吹吸３－４次，12000rpm,離心１分鐘。將這小離心柱移入一新1.5ml離心管中，加400μlOW261第一鏈的合成在1.5ml離心管中，按順序加入以下試劑：10×firststrandbuffer5.0μlFirststrandMethylNucleotidemixture5.0μlLinker-primer(1.4μg/μl)2.0μlDEPCwater30.5μlRNaseBlockRibonucleaseInhibitor(40u/μl)1.0μl第一鏈的合成62振蕩混勻，然后加入5μl（5μg）mRNA,混勻。室溫放置10分鐘，以便模板和引物退火。加入3.5μlMMLV-RT(20u/μl),終體積50μl，混勻，稍離心。取出5ｕL放于含有0.5ｕLα-32PdATP的離心管做對照反應。37℃溫育1小時同時準備16℃水浴。將第一鏈反應液取出，放置在冰上振蕩混勻，然后加入5μl（5μg）mRNA,混勻。63第二鏈的合成在冰上按順序往第一鏈反應液中加入以下試劑：10×Secondstrandbuffer20.0μlSecondstranddNTPs6.0μlddH2O108.2μlα-32PdATP2μl稍混勻，離心后加入RNaseH（0.9u/μl）3.5μlDNApolymeraseI(9.0u/μl)11.1μl迅速振蕩管子以混勻，稍離心后，在16℃溫育2.5小時，然后取出放在冰上。注意：在操作過程中必須保證溫度不超過16℃，否則會引起發(fā)夾結構的形成，影響cDNA的克隆。第二鏈的合成64cDNA第一鏈和cDNA第二鏈堿變性瓊脂糖凝膠電泳的同位素X光片cDNA第一鏈和cDNA第二鏈堿變性瓊脂糖凝膠電泳的同位素X65cDNA第一鏈和雙鏈cDNA凝膠電泳cDNA第一鏈和雙鏈cDNA凝膠電泳66

cDNA末端的補平在反應管中加入BlutingdNTPmix23μlpfuDNApolymerase(2.5u/μl)2.0μl混勻后，72℃溫育30分鐘，注意：不能超過30分鐘。取出反應管，加200μl苯酚：氯仿（1：1）抽提。12000rpm室溫離心2分鐘，取上清，用等體積氯仿再抽提1次。取上清，加入20μl3MNaAc(PH5.2)，400μl無水乙醇，-20℃過夜沉淀。12000rpm，4℃，離心60分鐘。70%乙醇洗沉淀，吸出乙醇后，干燥沉淀。將沉淀溶于9.0μl的EcoRIadapters溶液中。4℃放置至少30分鐘，使cDNA完全溶解。cDNA末端的補平67EcoRIadapters的連接在含有cDNA和EcoRIadapters的管中加入10×Ligasebuffer1.0μl10mMrATP1.0μlT4DNAligase(4μg/μl)1.0μl4℃連接兩天，將管放在70℃水欲中30分鐘，以滅活連接酶。EcoRIadapters的連接68EcoRI末端的激活在反應管中加入10×Ligasebuffer1.0μl10mMrATP2.0μl滅菌水6.0μlT4polynucleotidekinase10μg/μl)1.0μl37℃溫育30分鐘。70℃溫育30分鐘以滅活T4polynucleotidekinase1，稍離心。EcoRI末端的激活69

XhoI消化在反映管中加入28.0μlXhoIbuffer,3.0μlXhoI,37℃消化2小時。冷卻至室溫，加入5.0μl10×STEbuffer。這時的cDNA可以進行片段分離了。XhoI消化70cDNA不同大小片段的分離將SepharoseCL-2B和10×STEbuffer從4℃冰箱中取出，平衡至室溫。準備50ml的1×STEbuffer。將柱子固定在一個支架上，輕輕混勻SepharoseCL-2B，用1ml移液器將其加入柱子中。加入10ml1×STEbuffer平衡柱子。當在樹脂液面上剩大約50μlSTE時，立即加入cDNA樣。一旦樣品進入SepharoseCL-2B，用移液槍將連接管加滿1×STEbuffer。當染料達到柱子管壁刻度為-.4ml時開始接收cDNA，每3滴接一管。當染料達到柱子管壁刻度為.3ml時停止接收cDNA，大約接收12管。cDNA不同大小片段的分離71從每管中取8μl跑5%的非變性丙烯酰胺凝膠電泳。將非變性丙烯酰胺凝膠壓片，決定哪幾管用于將來與載體的連接。將大于400bp的接收的cDNA合并成一管，用芬：仿（1：1）抽提。12000rpm,室溫離心2分鐘。取上清，加入等體積的氯仿抽提。12000rpm,室溫離心2分鐘。取上清，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃過液。從-20℃取出沉淀反應，4℃，12000rpm，離心60分鐘。去上清，用80%乙醇洗沉淀，室溫，12