菌種保藏的方法課件

任務1-7

菌種的保藏任務1-7

菌種的保藏1一、菌種保藏的目的

①菌種存活，不丟失，不污染

②防止優(yōu)良性狀喪失

③隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種一、菌種保藏的目的2二、菌種保藏的原理：首先，選用優(yōu)良的純種（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等）其次，創(chuàng)造微生物代謝不活波，生長繁殖受抑制，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)以及添加保護劑等）

再次，添加保護劑或酸堿中和劑，避免保藏過程中細胞受傷。二、菌種保藏的原理：首先，選用優(yōu)良的純種（最好是休眠體，如分3三、菌種保藏的方法斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷凍保藏法液氮保藏法低溫保藏法三、菌種保藏的方法斜面保藏法4斜面低溫保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏原理：低溫下，微生物代謝強度明顯下降適用：各大類保藏期：3-6個月缺點：保存期短，傳代多，易退化斜面低溫保藏法5菌種保藏的方法課件6

半固體穿刺保藏法方法：適宜半固體→培養(yǎng)→4℃保藏原理：缺氧、低溫適用：好氣性細菌，酵母等保藏期：6-12個月步驟：用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，至培養(yǎng)基的1/2處，待微生物生長良好后覆蓋2-3mm無菌液體石蠟.石蠟可防止培養(yǎng)基失水又隔絕氧氣,降低代謝.但不適用于可以石蠟為碳源的微生物.半固體穿刺保藏法7菌種保藏的方法課件8

砂土管干燥保藏法方法：將干燥砂粒與細土混合后滅菌制成砂土管，然后接種保藏。原理：無營養(yǎng)，缺氧，干燥適用：產(chǎn)孢子的絲狀真菌、放線菌；有芽孢的細菌保藏期：2-10年或更長砂土管干燥保藏法9河沙60目篩棄去大顆粒及雜質80目篩去掉細沙吸鐵石吸去鐵質10％～20％的鹽酸浸泡24h去除有機物水洗至中性烘干或曬干土：取地面下40～60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過篩，水洗至中性，烘干。

將處理后的沙、土按質量比2∶1混合?；靹虻纳惩练盅b入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃高壓間歇滅菌2-3次，烘干備用。孢子或芽孢懸液→加入無菌砂土管中→干燥→封口→4-6℃保藏步驟：沙：河沙60目篩棄去大顆粒及雜質80目篩去掉細沙吸鐵石吸去鐵質110無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出菌落后再轉接一次?；蛉∩惩亮Ｓ谶m宜的液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后再轉接斜面。沙土管恢復培養(yǎng)無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出11真空冷凍干燥保藏法：方法：菌種培養(yǎng)→用保護劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結（-25—-40℃）→抽真空→真空封口→4-5℃保藏措施：低溫、干燥，缺氧，保護劑適用：各大類保藏期：5-10年或更長真空冷凍干燥保藏法：方法：菌種培養(yǎng)→用保護劑懸浮→12步驟1安瓿管的處理

直徑8-10mm，長度不小于100mm，洗凈高壓滅菌備用。2保護劑

低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖類、蛋白質等。常用的是脫脂奶和血清。3菌懸液制備

最適培養(yǎng)條件、生長后期。產(chǎn)孢子的微生物須適當延長培養(yǎng)時間以獲得成熟的孢子。4冷凍干燥5安瓿管的保藏

4-5℃保藏步驟1安瓿管的處理直徑8-10mm，長度不小于100m13復蘇方法：——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，——將安瓿管頂部燒熱，——用無菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現(xiàn)裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，——用無菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進行適溫培養(yǎng)。復蘇方法：14菌種保藏的方法課件15

液氮超低溫保藏法方法：菌懸液→加入保護劑→分裝至安醅管中（0.2-1cm菌懸液）→逐步降溫至-25℃→液氮罐（-196℃）保藏措施：低溫、加保護劑（10%甘油）適用：范圍廣泛保藏期：一般2～3年，長則9年。液氮超低溫保藏法方法：菌懸液→加入保護劑→分裝至16菌種的準備可采用下列幾種方法：刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻后加入凍存管內；接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內；將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng)，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻后加入凍存管內；在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養(yǎng)基，接種菌種，培養(yǎng)2-10天后，加入保護劑，待保藏。菌種的準備可采用下列幾種方法：17復蘇方法：

從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。復蘇方法：18菌種凍存管菌種凍存管19四、菌種保藏的注意事項菌種在保藏前所處的狀態(tài)：孢子或芽孢菌種保藏所用的基質：碳源操作過程對細胞結構的損害四、菌種保藏的注意事項菌種在保藏前所處的狀態(tài)：孢子或芽孢207種常用菌種保藏方法的比較方法主要措施適宜菌種保藏期評價斜面低溫保藏法低溫（4℃）各大類約1～6月簡便冰箱保藏法（半固體）低溫（4℃），避氧細菌，酵母菌約6～12月簡便液體石蠟封藏法低溫（4℃），阻氧各大類約1～2年簡便砂土干燥保藏法干燥，無營養(yǎng)產(chǎn)孢子的微生物約1～10年簡便有效甘油懸液保藏法低溫（－70℃），保護劑（15～50％甘油）細菌，酵母菌約10年較簡便冷凍干燥保藏法干燥、低溫、無氧，有保護劑各大類>5~15年繁而高效液氮保藏法超低溫（－196℃），有保護劑各大類>15年繁而高效7種常用菌種保藏方法的比較方法主要措施適宜菌種保藏期評價斜面21菌種保藏機構Ex：美國的標準菌種保藏所（ATCC）美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務部（ARS）英國國立標準菌種保藏所（NCTC）我國：1

普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）2農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）3工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）4醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）5抗生素菌種保藏管理中心（CACC）6獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）菌種保藏機構22任務1-7

菌種的保藏任務1-7

菌種的保藏23一、菌種保藏的目的

①菌種存活，不丟失，不污染

②防止優(yōu)良性狀喪失

③隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種一、菌種保藏的目的24二、菌種保藏的原理：首先，選用優(yōu)良的純種（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等）其次，創(chuàng)造微生物代謝不活波，生長繁殖受抑制，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)以及添加保護劑等）

再次，添加保護劑或酸堿中和劑，避免保藏過程中細胞受傷。二、菌種保藏的原理：首先，選用優(yōu)良的純種（最好是休眠體，如分25三、菌種保藏的方法斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷凍保藏法液氮保藏法低溫保藏法三、菌種保藏的方法斜面保藏法26斜面低溫保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏原理：低溫下，微生物代謝強度明顯下降適用：各大類保藏期：3-6個月缺點：保存期短，傳代多，易退化斜面低溫保藏法27菌種保藏的方法課件28

半固體穿刺保藏法方法：適宜半固體→培養(yǎng)→4℃保藏原理：缺氧、低溫適用：好氣性細菌，酵母等保藏期：6-12個月步驟：用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，至培養(yǎng)基的1/2處，待微生物生長良好后覆蓋2-3mm無菌液體石蠟.石蠟可防止培養(yǎng)基失水又隔絕氧氣,降低代謝.但不適用于可以石蠟為碳源的微生物.半固體穿刺保藏法29菌種保藏的方法課件30

砂土管干燥保藏法方法：將干燥砂粒與細土混合后滅菌制成砂土管，然后接種保藏。原理：無營養(yǎng)，缺氧，干燥適用：產(chǎn)孢子的絲狀真菌、放線菌；有芽孢的細菌保藏期：2-10年或更長砂土管干燥保藏法31河沙60目篩棄去大顆粒及雜質80目篩去掉細沙吸鐵石吸去鐵質10％～20％的鹽酸浸泡24h去除有機物水洗至中性烘干或曬干土：取地面下40～60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過篩，水洗至中性，烘干。

將處理后的沙、土按質量比2∶1混合。混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃高壓間歇滅菌2-3次，烘干備用。孢子或芽孢懸液→加入無菌砂土管中→干燥→封口→4-6℃保藏步驟：沙：河沙60目篩棄去大顆粒及雜質80目篩去掉細沙吸鐵石吸去鐵質132無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出菌落后再轉接一次?；蛉∩惩亮Ｓ谶m宜的液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后再轉接斜面。沙土管恢復培養(yǎng)無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出33真空冷凍干燥保藏法：方法：菌種培養(yǎng)→用保護劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結（-25—-40℃）→抽真空→真空封口→4-5℃保藏措施：低溫、干燥，缺氧，保護劑適用：各大類保藏期：5-10年或更長真空冷凍干燥保藏法：方法：菌種培養(yǎng)→用保護劑懸浮→34步驟1安瓿管的處理

直徑8-10mm，長度不小于100mm，洗凈高壓滅菌備用。2保護劑

低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖類、蛋白質等。常用的是脫脂奶和血清。3菌懸液制備

最適培養(yǎng)條件、生長后期。產(chǎn)孢子的微生物須適當延長培養(yǎng)時間以獲得成熟的孢子。4冷凍干燥5安瓿管的保藏

4-5℃保藏步驟1安瓿管的處理直徑8-10mm，長度不小于100m35復蘇方法：——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，——將安瓿管頂部燒熱，——用無菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現(xiàn)裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，——用無菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進行適溫培養(yǎng)。復蘇方法：36菌種保藏的方法課件37

液氮超低溫保藏法方法：菌懸液→加入保護劑→分裝至安醅管中（0.2-1cm菌懸液）→逐步降溫至-25℃→液氮罐（-196℃）保藏措施：低溫、加保護劑（10%甘油）適用：范圍廣泛保藏期：一般2～3年，長則9年。液氮超低溫保藏法方法：菌懸液→加入保護劑→分裝至38菌種的準備可采用下列幾種方法：刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻后加入凍存管內；接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內；將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng)，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻后加入凍存管內；在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養(yǎng)基，接種菌種，培養(yǎng)2-10天后，加入保護劑，待保藏。菌種的準備可采用下列幾種方法：39復蘇方法：

從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。復蘇方法：40菌種凍存管菌種凍存管41四、菌種保藏的注意事項菌種在保藏前所處的狀態(tài)：孢子或芽孢菌種保藏所用的基質：碳源操作過程對細胞結構的損害四、菌種保藏的注意事項菌種在保藏前所處的狀態(tài)：孢子或芽孢427種常用菌種保藏方法的比較方法主要措施適宜菌種保藏期評價斜面低溫保藏法低溫（4℃）各大類約1～6月簡便冰箱保藏法（半固體）低溫（4℃），避氧細菌，酵母菌約6～12月簡便液體石蠟封藏法低溫（4℃），阻氧各大類約1～2年簡便砂土干燥保藏法干燥，無營養(yǎng)產(chǎn)孢子的微生物約1～10年簡便有效甘油懸液保藏法低溫（－70℃），保護劑（15～50％甘油）細菌，酵母菌約10年較簡便冷凍干燥保藏法干燥、低溫、無氧，有保護劑各大類>5~15年繁而高效液氮保藏法超低溫（－196℃），有保護劑各大類>15年繁而高效7