制藥用水微生物檢查方法的驗(yàn)證課件

介紹內(nèi)容

一、微生物的基礎(chǔ)知識(shí)二、微生物檢查方法驗(yàn)證

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微生物基礎(chǔ)知識(shí)

微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不見的微小生物的總稱。微生物（microorganism）包括細(xì)菌、支原體、螺旋體、衣原體、立克次體、病毒及真菌霉菌、酵母菌和放線菌）等。微生物基礎(chǔ)知識(shí)微生物（2

微生物的特點(diǎn)

種類多分布廣

迄今為止，我們知道的微生物約有10萬種，只占地球上實(shí)際存在的微生物總數(shù)的20%。微生物的特點(diǎn)種類3

微生物的特點(diǎn)

各體小，表面積大物體的表面積和體積之比稱為表面積，大腸埃希菌的表面積是人的30萬倍。

微生物的特點(diǎn)各4

微生物的特點(diǎn)

吸收多轉(zhuǎn)化快如大腸埃希菌在合適條件下，每小時(shí)可以消耗相當(dāng)于自身重量2000倍的數(shù)量，而人體則需要40年之久。

微生物的特點(diǎn)吸5

微生物的特點(diǎn)

適應(yīng)強(qiáng)易變異多數(shù)細(xì)菌能耐0～－196℃的低溫；硫細(xì)菌可在250～300℃的高溫條件下正常生長；一些嗜鹽細(xì)菌甚至能在飽和鹽水中正常生活；產(chǎn)芽孢細(xì)菌和真菌孢子在干燥條件下能保藏幾十年、幾百年。微生物的特點(diǎn)適6

微生物的類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)

微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等分為三大類：原核細(xì)胞型：細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次氏體、螺旋體等真核細(xì)胞型：真菌非細(xì)胞型：病毒噬菌體

微生物的類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)7

細(xì)菌的繁殖

細(xì)菌（bacterium）屬于原核細(xì)胞型微生物，其特點(diǎn)是具有細(xì)胞壁、原始的核質(zhì)，以二分裂方式繁殖。了解細(xì)菌的基本特性、細(xì)菌的鑒別，對(duì)新藥的研發(fā)和防止藥品污染，保證藥品質(zhì)量具有重要的意義。細(xì)菌的8

細(xì)菌的形態(tài)

-細(xì)菌體積微小，是無色半透明的，用肉眼直接觀察難以看到，其結(jié)構(gòu)和形狀須經(jīng)過顯微鏡放大數(shù)百倍至上千倍才能觀察。-一般以微米（μm）作為測量單位。-在細(xì)菌學(xué)中，按其形態(tài)可分為球菌、桿菌、弧菌和螺桿菌。經(jīng)革蘭染色法（Gramstain）可將細(xì)菌分成兩大類：革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）。

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細(xì)菌的形態(tài)

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細(xì)菌的形態(tài)

真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和細(xì)胞壁的生物。種類很多，已報(bào)道的種超過10萬個(gè)。大多是由纖細(xì)管狀菌絲構(gòu)成的菌絲體。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體。菌絲體在基質(zhì)上生長的形態(tài)稱為菌落。細(xì)菌的形態(tài)11

細(xì)菌的形態(tài)

真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光學(xué)顯微鏡放大數(shù)倍乃至千倍方可觀察到。其形態(tài)分單細(xì)胞、多細(xì)胞，單細(xì)胞呈圓形或卵圓形，如酵母菌（yeast）。多細(xì)胞由菌絲和孢子組成，并交織成團(tuán)。細(xì)菌的12

藥品污染常見的真菌

毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬

-毛霉屬（MucorMicheliexFries）

毛霉屬在自然界分布很廣，常用于發(fā)酵工業(yè)。并引起水分高的糧食及食品的霉?fàn)€變質(zhì)。毛霉屬的分枝類型：1.單生（不分枝）2.總狀分枝3.假軸狀分枝⑵毛霉的孢子囊：1.孢子2.膜3.囊軸4.孢子囊柄藥品污染常見的真菌毛霉屬、根霉13

根霉屬（RhizopusEhrenberg）

根霉屬廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，在潮濕的糧食及食品上能迅速蔓延生長，引起糧食及食品的腐爛。

根霉A：1．營養(yǎng)菌絲B：2.匍匐菌絲3.假根4.孢囊柄C：孢囊放大圖1.囊壁2.囊軸3.囊托根霉屬（RhizopusEhrenberg）根霉14

曲霉屬（Aspergillus）

曲霉屬的菌絲無色、淡色或表面凝聚有色物質(zhì)，為有隔的多細(xì)胞。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有8個(gè)種，具有強(qiáng)烈的致癌性。

曲霉

1．雙層小梗分生孢子頭

2.單層小梗分生孢子頭

3.分生孢子?；孔慵?xì)胞

4.雙層小梗的細(xì)胞微結(jié)構(gòu)曲霉屬（Aspergillus）15

常見青霉分生孢子梗

青霉屬菌絲無色或有色，為有隔的多細(xì)胞。分生孢子梗從菌絲垂直生出，無足細(xì)胞，頂端不膨大，無頂囊，產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉，在最后一級(jí)分枝的小梗上，長出成串的分生孢子，形似掃帚狀，稱為帚狀枝。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有9個(gè)種，其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素，是一種神經(jīng)毒素，并具有致畸、致突變和致癌性；常見青霉分生孢子梗16

霉菌菌落形態(tài)霉菌菌落形態(tài)17

霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài)

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酵母菌顯微鏡下形態(tài)酵母菌顯微鏡下形態(tài)19

微生物檢查法

微生物限度檢查方法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。檢查方法多用平皿法、薄膜過濾法、涂抹法和MPN法，國家藥典規(guī)定應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)證合格的方法。

微生物檢查法微生20

檢查方法的驗(yàn)證

試驗(yàn)環(huán)境

無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。檢驗(yàn)依據(jù)單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。

-2010版藥典

檢查方法的驗(yàn)證21

隔離系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的目的-是保護(hù)產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，保證無菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，實(shí)現(xiàn)一次檢出的要求。-是保護(hù)操作人員免受實(shí)驗(yàn)過程中的有害物質(zhì)帶來的污染。隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗(yàn)還需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。隔離系統(tǒng)的應(yīng)用22

-為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，真實(shí)性，選擇正確的檢驗(yàn)方法是至關(guān)重要的。因此試驗(yàn)前必須對(duì)選擇的方法進(jìn)行驗(yàn)證。-證明所采用的方法是適宜的，確認(rèn)所采用的方法適宜于被檢供試品的微生物污染的檢驗(yàn)。

方法驗(yàn)證的必要性-為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，真實(shí)性，選擇正確的檢驗(yàn)方法23

檢驗(yàn)結(jié)果的影響因素供試品的組分抑菌劑、增溶劑、乳化劑及抗氧化劑，這些組分在一定濃度下對(duì)微生物起一定的抑制作用也可對(duì)污染菌造成損傷。環(huán)境影響不同類型的微生物及不同的存活狀態(tài)對(duì)環(huán)境的抗性是不同的。如培養(yǎng)基的質(zhì)量、檢驗(yàn)人員的操作誤差等。檢驗(yàn)結(jié)果的影響因素供試品的24

方法驗(yàn)證

試驗(yàn)全方面驗(yàn)證

如試驗(yàn)環(huán)境，培養(yǎng)基，供試液的制備，滅菌方法等全部進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求時(shí)，就可認(rèn)為在該試驗(yàn)條件下該供試品對(duì)微生物無抑菌作用或抑菌作用可忽略不計(jì)，供試品檢驗(yàn)結(jié)果可真實(shí)的體現(xiàn)。方法驗(yàn)證25

驗(yàn)證方法菌液制備50～100cfu/ml。驗(yàn)證方法試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組、釋劑對(duì)照組。結(jié)果判斷供試品組、對(duì)照組、稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均不低70%。驗(yàn)證方法菌液制備50～100cfu/ml。26

方法驗(yàn)證

驗(yàn)證方法

⒈按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。⒉對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。⒊驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。方法27

方法驗(yàn)證試驗(yàn)菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草桿菌。菌液制備

同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。

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方法驗(yàn)證

試驗(yàn)組

-平皿法

取最低稀釋級(jí)供試液1ml和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基(平行制備2個(gè)平皿)，按平皿法測定其菌數(shù)。

-

薄膜過濾法

取最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。方法驗(yàn)證29

方法驗(yàn)證-菌液組所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

-供試品對(duì)照組測定供試品本底菌數(shù)。

-稀釋劑對(duì)照組用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌按試驗(yàn)組測定其菌數(shù)?？疾旃┰囈褐苽溥^程中微生物受影響的程度。

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方法驗(yàn)證

試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)試驗(yàn)組的菌回收率(％)=———————————————————————X100%

菌液組的平均菌落數(shù)

稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)稀釋劑對(duì)照組的菌回收率(％)=————————————————————X100%

菌液組的平均菌落數(shù)

31謝謝謝謝32

介紹內(nèi)容

一、微生物的基礎(chǔ)知識(shí)二、微生物檢查方法驗(yàn)證

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微生物基礎(chǔ)知識(shí)

微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不見的微小生物的總稱。微生物（microorganism）包括細(xì)菌、支原體、螺旋體、衣原體、立克次體、病毒及真菌霉菌、酵母菌和放線菌）等。微生物基礎(chǔ)知識(shí)微生物（34

微生物的特點(diǎn)

種類多分布廣

迄今為止，我們知道的微生物約有10萬種，只占地球上實(shí)際存在的微生物總數(shù)的20%。微生物的特點(diǎn)種類35

微生物的特點(diǎn)

各體小，表面積大物體的表面積和體積之比稱為表面積，大腸埃希菌的表面積是人的30萬倍。

微生物的特點(diǎn)各36

微生物的特點(diǎn)

吸收多轉(zhuǎn)化快如大腸埃希菌在合適條件下，每小時(shí)可以消耗相當(dāng)于自身重量2000倍的數(shù)量，而人體則需要40年之久。

微生物的特點(diǎn)吸37

微生物的特點(diǎn)

適應(yīng)強(qiáng)易變異多數(shù)細(xì)菌能耐0～－196℃的低溫；硫細(xì)菌可在250～300℃的高溫條件下正常生長；一些嗜鹽細(xì)菌甚至能在飽和鹽水中正常生活；產(chǎn)芽孢細(xì)菌和真菌孢子在干燥條件下能保藏幾十年、幾百年。微生物的特點(diǎn)適38

微生物的類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)

微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等分為三大類：原核細(xì)胞型：細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次氏體、螺旋體等真核細(xì)胞型：真菌非細(xì)胞型：病毒噬菌體

微生物的類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)39

細(xì)菌的繁殖

細(xì)菌（bacterium）屬于原核細(xì)胞型微生物，其特點(diǎn)是具有細(xì)胞壁、原始的核質(zhì)，以二分裂方式繁殖。了解細(xì)菌的基本特性、細(xì)菌的鑒別，對(duì)新藥的研發(fā)和防止藥品污染，保證藥品質(zhì)量具有重要的意義。細(xì)菌的40

細(xì)菌的形態(tài)

-細(xì)菌體積微小，是無色半透明的，用肉眼直接觀察難以看到，其結(jié)構(gòu)和形狀須經(jīng)過顯微鏡放大數(shù)百倍至上千倍才能觀察。-一般以微米（μm）作為測量單位。-在細(xì)菌學(xué)中，按其形態(tài)可分為球菌、桿菌、弧菌和螺桿菌。經(jīng)革蘭染色法（Gramstain）可將細(xì)菌分成兩大類：革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）。

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細(xì)菌的形態(tài)

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細(xì)菌的形態(tài)

真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和細(xì)胞壁的生物。種類很多，已報(bào)道的種超過10萬個(gè)。大多是由纖細(xì)管狀菌絲構(gòu)成的菌絲體。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體。菌絲體在基質(zhì)上生長的形態(tài)稱為菌落。細(xì)菌的形態(tài)43

細(xì)菌的形態(tài)

真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光學(xué)顯微鏡放大數(shù)倍乃至千倍方可觀察到。其形態(tài)分單細(xì)胞、多細(xì)胞，單細(xì)胞呈圓形或卵圓形，如酵母菌（yeast）。多細(xì)胞由菌絲和孢子組成，并交織成團(tuán)。細(xì)菌的44

藥品污染常見的真菌

毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬

-毛霉屬（MucorMicheliexFries）

毛霉屬在自然界分布很廣，常用于發(fā)酵工業(yè)。并引起水分高的糧食及食品的霉?fàn)€變質(zhì)。毛霉屬的分枝類型：1.單生（不分枝）2.總狀分枝3.假軸狀分枝⑵毛霉的孢子囊：1.孢子2.膜3.囊軸4.孢子囊柄藥品污染常見的真菌毛霉屬、根霉45

根霉屬（RhizopusEhrenberg）

根霉屬廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，在潮濕的糧食及食品上能迅速蔓延生長，引起糧食及食品的腐爛。

根霉A：1．營養(yǎng)菌絲B：2.匍匐菌絲3.假根4.孢囊柄C：孢囊放大圖1.囊壁2.囊軸3.囊托根霉屬（RhizopusEhrenberg）根霉46

曲霉屬（Aspergillus）

曲霉屬的菌絲無色、淡色或表面凝聚有色物質(zhì)，為有隔的多細(xì)胞。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有8個(gè)種，具有強(qiáng)烈的致癌性。

曲霉

1．雙層小梗分生孢子頭

2.單層小梗分生孢子頭

3.分生孢子?；孔慵?xì)胞

4.雙層小梗的細(xì)胞微結(jié)構(gòu)曲霉屬（Aspergillus）47

常見青霉分生孢子梗

青霉屬菌絲無色或有色，為有隔的多細(xì)胞。分生孢子梗從菌絲垂直生出，無足細(xì)胞，頂端不膨大，無頂囊，產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉，在最后一級(jí)分枝的小梗上，長出成串的分生孢子，形似掃帚狀，稱為帚狀枝。本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有9個(gè)種，其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素，是一種神經(jīng)毒素，并具有致畸、致突變和致癌性；常見青霉分生孢子梗48

霉菌菌落形態(tài)霉菌菌落形態(tài)49

霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài)

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酵母菌顯微鏡下形態(tài)酵母菌顯微鏡下形態(tài)51

微生物檢查法

微生物限度檢查方法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。檢查方法多用平皿法、薄膜過濾法、涂抹法和MPN法，國家藥典規(guī)定應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)證合格的方法。

微生物檢查法微生52

檢查方法的驗(yàn)證

試驗(yàn)環(huán)境

無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。檢驗(yàn)依據(jù)單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。

-2010版藥典

檢查方法的驗(yàn)證53

隔離系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的目的-是保護(hù)產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，保證無菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，實(shí)現(xiàn)一次檢出的要求。-是保護(hù)操作人員免受實(shí)驗(yàn)過程中的有害物質(zhì)帶來的污染。隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗(yàn)還需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。隔離系統(tǒng)的應(yīng)用54

-為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，真實(shí)性，選擇正確的檢驗(yàn)方法是至關(guān)重要的。因此試驗(yàn)前必須對(duì)選擇的方法進(jìn)行驗(yàn)證。-證明所采用的方法是適宜的，確認(rèn)所采用的方法適宜于被檢供試品的微生物污染的檢驗(yàn)。

方法驗(yàn)證的必要性-為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，真實(shí)性，選擇正確的檢驗(yàn)方法55

檢驗(yàn)結(jié)果的影響因素供試品的組分抑菌劑、增溶劑、乳化劑及抗氧化劑，這些組分在一定濃度下對(duì)微生物起一定的抑制作用也可對(duì)污染菌造成損傷。環(huán)境影響不同類型的微生物及不同的存活狀態(tài)對(duì)環(huán)境的抗性是不同的。如培養(yǎng)基的質(zhì)量、檢驗(yàn)人員的操作誤差等。檢驗(yàn)結(jié)果的影響因素供試品的56

方法驗(yàn)證

試驗(yàn)全方面驗(yàn)證

如試驗(yàn)環(huán)境，培養(yǎng)基，供試液的制備，滅菌方法等全部進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求時(shí)，就可認(rèn)為在該試驗(yàn)條件下該供試品對(duì)微生物無抑菌作用或抑菌作用可忽略不計(jì)，供試品檢驗(yàn)結(jié)果可真實(shí)的體現(xiàn)。方法驗(yàn)證57

驗(yàn)證方法菌液制備50～100cfu/ml。驗(yàn)證方法試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組、釋劑對(duì)照組。結(jié)果判斷供試品組、對(duì)照組、稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均不低70%。驗(yàn)證方法菌液制