熒光光譜分析方法及原理課件

參考書(shū)趙南明,周海夢(mèng).生物物理學(xué),高等教育出版社,2000EmissionSpectroscopy,Chapter11,inK.E.vanHolde.W.C.JohnsonandP.S.HoedsPrinciplesofPhysicalBiochemistry,Prentice-Hall1998參考書(shū)1某些物質(zhì)被一定波長(zhǎng)的光照射時(shí),會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)發(fā)射出波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)的光,如果這個(gè)時(shí)間比較短,這種光就稱(chēng)為熒光。熒光由一種能發(fā)熒光的礦物——繭石fluospa)而得名。我們這里要介紹的熒光,是指物質(zhì)在吸收紫外光和可見(jiàn)光后發(fā)出的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紫外熒光或可見(jiàn)熒光除了紫外光和可見(jiàn)光可能激發(fā)熒光外,其它的光如紅外光、X射線(xiàn)也可能激發(fā)出熒光,因此除紫外熒光或可見(jiàn)熒光外,還有紅外熒光、X射線(xiàn)熒光等。某些物質(zhì)被一定波長(zhǎng)的光照射時(shí),會(huì)在一定時(shí)2IndiscussingabsorptionwehavebeenconcernedentirelywiththeexcitationofamoleculefromitsgroundstatetoahigherenergylevelandhavegivennoconsiderationtothesubsequentfateoftheexcitedmoleculeInmanycasesthesequelisnotveryinterestingtheenergyistransferredasheattothesurroundingsInsomecaseslightisemittedbythesampleeitherasfluorescenceorphosphorescenceWewilldiscussthegeneralcharacteristicsofemissionandignoretheexceptionsIndiscussingabsorptionweha3熒光光譜的特點(diǎn)熒光光譜的特點(diǎn)4FluorescenceisatechniquefordetectingbiologicalmaterialsBarakandWebbdemonstratedthatboundtolowdensitylipoproteinmoleculescanbedetectedoncellsurfacesbymicroscopyusingasensitivevideocamera.Withevenmoresophisticatedmethodsothershavemovedtowarddetectionofsinglefluorophoremoleculesinalaser-excitedflowstream.Becausethissensitivitycancombinewitheaseofuseandthepotentialformultiparameteranalysis,fluorescencehasbecomewidelyusedinbiologyandmedicineFluorescenceisa5熒光光譜靈敏度高的原因熒頭七輻射的波長(zhǎng)比激發(fā)光浪長(zhǎng)長(zhǎng),測(cè)量到的熒光頻率與入射光的頻率不同;熒光在各個(gè)方向上都有發(fā)射,因此可以在與入射光成直角的方向上檢測(cè)這樣,熒光不受來(lái)自激發(fā)光的本底的干擾,靈敏度大大高于紫外可見(jiàn)吸收光譜,測(cè)量用的樣品量很少,且測(cè)量方法簡(jiǎn)便。熒光光譜靈敏度高的原因6熒光光譜第二個(gè)特點(diǎn)是熒光光譜能提供較多的參數(shù),例如激發(fā)譜、發(fā)射譜、峰位、峰強(qiáng)度、熒光壽命、熒光偏振度等。熒光光譜還可以檢測(cè)一些紫外-可見(jiàn)吸收光譜檢測(cè)不到的時(shí)間過(guò)程過(guò)程。紫外和可見(jiàn)熒光涉及的是電子能級(jí)之間的躍遷,熒光產(chǎn)生包括兩個(gè)過(guò)程:吸收以及隨之而來(lái)的發(fā)射。每個(gè)過(guò)程發(fā)生的時(shí)間與躍遷頻率的倒數(shù)是同一時(shí)間量級(jí)(大約1015秒),但兩個(gè)過(guò)程中有一個(gè)時(shí)間延擱,大約為10秒,這段時(shí)間內(nèi)分子處于激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的壽命取決于輻射與非輻射之間的竟?fàn)?。由于熒光有一定的壽?因此可以檢測(cè)一些時(shí)間過(guò)程與其壽命相當(dāng)?shù)倪^(guò)程。例如,生色團(tuán)及其環(huán)境的變化過(guò)程在紫外可見(jiàn)吸收的10秒的過(guò)程中基本上是靜止不變的,因此無(wú)法用紫外可見(jiàn)吸收光譜檢測(cè),但可以用熒光光譜檢測(cè)熒光光譜第二個(gè)特點(diǎn)是7基本原理基本原理8fluorescence系間交連三線(xiàn)態(tài)(10°-1)102s-)電子能級(jí)基態(tài)Fluorescenceisemissionfromasingletstatewheretheelectronspinsinthemoleculearepairedfluorescence9fuorescenceexcitationbyabsorptionofenergylosesenergyasheatbyinternalconversionthemoleculehesitatesatthelowestvibrationallevelofthefirstsinglet,becausearelativelylargeamountofenergymustbelosttogotothegroundstateduringthishesitationoneofthreethingsmayhappenithemoleculemayfluoresceitmayconverttothetriplet(intersystemcrossingitmaygotothegroundstatewithoutemittingaphoton(anonradiativetransitionfuorescence10熒光光譜分析方法及原理課件11熒光光譜分析方法及原理課件12熒光光譜分析方法及原理課件13熒光光譜分析方法及原理課件14熒光光譜分析方法及原理課件15熒光光譜分析方法及原理課件16熒光光譜分析方法及原理課件17熒光光譜分析方法及原理課件18熒光光譜分析方法及原理課件19熒光光譜分析方法及原理課件20熒光光譜分析方法及原理課件21熒光光譜分析方法及原理課件22熒光光譜分析方法及原理課件23熒光光譜分析方法及原理課件24熒光光譜分析方法及原理課件25熒光光譜分析方法及原理課件26熒光光譜分析方法及原理課件27熒光光譜分析方法及原理課件28熒光光譜分析方法及原理課件29熒光光譜分析方法及原理課件30熒光光譜分析方法及原理課件31熒光光譜分析方法及原理課件32熒光光譜分析方法及原理課件33熒光光譜分析方法及原理課件34熒光光譜分析方法及原理課件35熒光光譜分析方法及原理課件36熒光光譜分析方法及原理課件37熒光光譜分析方法及原理課件38熒光光譜分析方法及原理課件39熒光光譜分析方法及原理課件40熒光光譜分析方法及原理課件41熒光光譜分析方法及原理課件42熒光光譜分析方法及原理課件43熒光光譜分析方法及原理課件44熒光光譜分析方法及原理課件45熒光光譜分析方法及原理課件46熒光光譜分析方法及原理課件47熒光光譜分析方法及原理課件48熒光光譜分析方法及原理課件49熒光光譜分析方法及原理課件50熒光光譜分析方法及原理課件51熒光光譜分析方法及原理課件52熒光光譜分析方法及原理課件53熒光光譜分析方法及原理課件54熒光光譜分析方法及原理課件55熒光光譜分析方法及原理課件56熒光光譜分析方法及原理課件57熒光光譜分析方法及原理課件58熒光光譜分析方法及原理課件59熒光光譜分析方法及原理課件60熒光光譜分析方法及原理課件61熒光光譜分析方法及原理課件62熒光光譜分析方法及原理課件63熒光光譜分析方法及原理課件64熒光光譜分析方法及原理課件65熒光光譜分析方法及原理課件66熒光光譜分析方法及原理課件67熒光光譜分析方法及原理課件68熒光光譜分析方法及原理課件69熒光光譜分析方法及原理課件70熒光光譜分析方法及原理課件71熒光光譜分析方法及原理課件72熒光光譜分析方法及原理課件73熒光光譜分析方法及原理課件74熒光光譜分析方法及原理課件75熒光光譜分析方法及原理課件76熒光光譜分析方法及原理課件77熒光光譜分析方法及原理課件78熒光光譜分析方法及原理課件79熒光光譜分析方法及原理課件80熒光光譜分析方法及原理課件81熒光光譜分析方法及原理課件82熒光光譜分析方法及原理課件83熒光光譜分析方法及原理課件84熒光光譜分析方法及原理課件85熒光光譜分析方法及原理課件86熒光光譜分析方法及原理課件87熒光光譜分析方法及原理課件88熒光光譜分析方法及原理課件89熒光光譜分析方法及原理課件90熒光光譜分析方法及原理課件91熒光光譜分析方法及原理課件92熒光光譜分析方法及原理課件93熒光光譜分析方法及原理課件94熒光光譜分析方法及原理課件95熒光光譜分析方法及原理課件96熒光光譜分析方法及原理課件97熒光光譜分析方法及原理課件98熒光光譜分析方法及原理課件99熒光光譜分析方法及原理課件100熒光光譜分析方法及原理課件101熒光光譜分析方法及原理課件102熒光光譜分析方法及原理課件103熒光光譜分析方法及原理課件104熒光光譜分析方法及原理課件105熒光光譜分析方法及原理課件106熒光光譜分析方法及原理課件107熒光光譜分析方法及原理課件108熒光光譜分析方法及原理課件109熒光光譜分析方法及原理課件110熒光光譜分析方法及原理課件111熒光光譜分析方法及原理課件112熒光光譜分析方法及原理課件113熒光光譜分析方法及原理課件114熒光光譜分析方法及原理課件115熒光光譜分析方法及原理課件116熒光光譜分析方法及原理課件117熒光光譜分析方法及原理課件118熒光光譜分析方法及原理課件119熒光光譜分析方法及原理課件120熒光光譜分析方法及原理課件121熒光光譜分析方法及原理課件122熒光光譜分析方法及原理課件123熒光光譜分析方法及原理課件124熒光光譜分析方法及原理課件125熒光光譜分析方法及原理課件126熒光光譜分析方法及原理課件127熒光光譜分析方法及原理課件128熒光光譜分析方法及原理課件129熒光光譜分析方法及原理課件130熒光光譜分析方法及原理課件131熒光光譜分析方法及原理課件132熒光光譜分析方法及原理課件133熒光光譜分析方法及原理課件134熒光光譜分析方法及原理課件135熒光光譜分析方法及原理課件136熒光光譜分析方法及原理課件137熒光光譜分析方法及原理課件138熒光光譜分析方法及原理課件139熒光光譜分析方法及原理課件140熒光光譜分析方法及原理課件141熒光光譜分析方法及原理課件142熒光光譜分析方法及原理課件143熒光光譜分析方法及原理課件144熒光光譜分析方法及原理課件145熒光光譜分析方法及原理課件146熒光光譜分析方法及原理課件147熒光光譜分析方法及原理課件148熒光光譜分析方法及原理課件149熒光光譜分析方法及原理課件150熒光光譜分析方法及原理課件151熒光光譜分析方法及原理課件152熒光光譜分析方法及原理課件153熒光光譜分析方法及原理課件154熒光光譜分析方法及原理課件155熒光光譜分析方法及原理課件156熒光光譜分析方法及原理課件157熒光光譜分析方法及原理課件158熒光光譜分析方法及原理課件159熒光光譜分析方法及原理課件160熒光光譜分析方法及原理課件161熒光光譜分析方法及原理課件162熒光光譜分析方法及原理課件163熒光光譜分析方法及原理課件164熒光光譜分析方法及原理課件165熒光光譜分析方法及原理課件166熒光光譜分析方法及原理課件167熒光光譜分析方法及原理課件168熒光光譜分析方法及原理課件169熒光光譜分析方法及原理課件170熒光光譜分析方法及原理課件171熒光光譜分析方法及原理課件172熒光光譜分析方法及原理課件173熒光光譜分析方法及原理課件174熒光光譜分析方法及原理課件175熒光光譜分析方法及原理課件176熒光光譜分析方法及原理課件177熒光光譜分析方法及原理課件178熒光光譜分析方法及原理課件179熒光光譜分析方法及原理課件180熒光光譜分析方法及原理課件181熒光光譜分析方法及原理課件182熒光光譜分析方法及原理課件183熒光光譜分析方法及原理課件184熒光光譜分析方法及原理課件185熒光光譜分析方法及原理課件186熒光光譜分析方法及原理課件187熒光光譜分析方法及原理課件188熒光光譜分析方法及原理課件189熒光光譜分析方法及原理課件190熒光光譜分析方法及原理課件191參考書(shū)趙南明,周海夢(mèng).生物物理學(xué),高等教育出版社,2000EmissionSpectroscopy,Chapter11,inK.E.vanHolde.W.C.JohnsonandP.S.HoedsPrinciplesofPhysicalBiochemistry,Prentice-Hall1998參考書(shū)192某些物質(zhì)被一定波長(zhǎng)的光照射時(shí),會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)發(fā)射出波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)的光,如果這個(gè)時(shí)間比較短,這種光就稱(chēng)為熒光。熒光由一種能發(fā)熒光的礦物——繭石fluospa)而得名。我們這里要介紹的熒光,是指物質(zhì)在吸收紫外光和可見(jiàn)光后發(fā)出的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紫外熒光或可見(jiàn)熒光除了紫外光和可見(jiàn)光可能激發(fā)熒光外,其它的光如紅外光、X射線(xiàn)也可能激發(fā)出熒光,因此除紫外熒光或可見(jiàn)熒光外,還有紅外熒光、X射線(xiàn)熒光等。某些物質(zhì)被一定波長(zhǎng)的光照射時(shí),會(huì)在一定時(shí)193IndiscussingabsorptionwehavebeenconcernedentirelywiththeexcitationofamoleculefromitsgroundstatetoahigherenergylevelandhavegivennoconsiderationtothesubsequentfateoftheexcitedmoleculeInmanycasesthesequelisnotveryinterestingtheenergyistransferredasheattothesurroundingsInsomecaseslightisemittedbythesampleeitherasfluorescenceorphosphorescenceWewilldiscussthegeneralcharacteristicsofemissionandignoretheexceptionsIndiscussingabsorptionweha194熒光光譜的特點(diǎn)熒光光譜的特點(diǎn)195FluorescenceisatechniquefordetectingbiologicalmaterialsBarakandWebbdemonstratedthatboundtolowdensitylipoproteinmoleculescanbedetectedoncellsurfacesbymicroscopyusingasensitivevideocamera.Withevenmoresophisticatedmethodsothershavemovedtowarddetectionofsinglefluorophoremoleculesinalaser-excitedflowstream.Becausethissensitivitycancombinewitheaseofuseandthepotentialformultiparameteranalysis,fluorescencehasbecomewidelyusedinbiologyandmedicineFluorescenceisa196熒光光譜靈敏度高的原因熒頭七輻射的波長(zhǎng)比激發(fā)光浪長(zhǎng)長(zhǎng),測(cè)量到的熒光頻率與入射光的頻率不同;熒光在各個(gè)方向上都有發(fā)射,因此可以在與入射光成直角的方向上檢測(cè)這樣,熒光不受來(lái)自激發(fā)光的本底的干擾,靈敏度大大高于紫外可見(jiàn)吸收光譜,測(cè)量用的樣品量很少,且測(cè)量方法簡(jiǎn)便。熒光光譜靈敏度高的原因197熒光光譜第二個(gè)特點(diǎn)是熒光光譜能提供較多的參數(shù),例如激發(fā)譜、發(fā)射譜、峰位、峰強(qiáng)度、熒光壽命、熒光偏振度等。熒光光譜還可以檢測(cè)一些紫外-可見(jiàn)吸收光譜檢測(cè)不到的時(shí)間過(guò)程過(guò)程。紫外和可見(jiàn)熒光涉及的是電子能級(jí)之間的躍遷,熒光產(chǎn)生包括兩個(gè)過(guò)程:吸收以及隨之而來(lái)的發(fā)射。每個(gè)過(guò)程發(fā)生的時(shí)間與躍遷頻率的倒數(shù)是同一時(shí)間量級(jí)(大約1015秒),但兩個(gè)過(guò)程中有一個(gè)時(shí)間延擱,大約為10秒,這段時(shí)間內(nèi)分子處于激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的壽命取決于輻射與非輻射之間的竟?fàn)?。由于熒光有一定的壽?因此可以檢測(cè)一些時(shí)間過(guò)程與其壽命相當(dāng)?shù)倪^(guò)程。例如,生色團(tuán)及其環(huán)境的變化過(guò)程在紫外可見(jiàn)吸收的10秒的過(guò)程中基本上是靜止不變的,因此無(wú)法用紫外可見(jiàn)吸收光譜檢測(cè),但可以用熒光光譜檢測(cè)熒光光譜第二個(gè)特點(diǎn)是198基本原理基本原理199fluorescence系間交連三線(xiàn)態(tài)(10°-1)102s-)電子能級(jí)基態(tài)Fluorescenceisemissionfromasingletstatewheretheelectronspinsinthemoleculearepairedfluorescence200fuorescenceexcitationbyabsorptionofenergylosesenergyasheatbyinternalconversionthemoleculehesitatesatthelowestvibrationallevelofthefirstsinglet,becausearelativelylargeamountofenergymustbelosttogotothegroundstateduringthishesitationoneofthreethingsmayhappenithemoleculemayfluoresceitmayconverttothetriplet(intersystemcrossingitmaygotothegroundstatewithoutemittingaphoton(anonradiativetransitionfuorescence201熒光光譜分析方法及原理課件202熒光光譜分析方法及原理課件203熒光光譜分析方法及原理課件204熒光光譜分析方法及原理課件205熒光光譜分析方法及原理課件206熒光光譜分析方法及原理課件207熒光光譜分析方法及原理課件208熒光光譜分析方法及原理課件209熒光光譜分析方法及原理課件210熒光光譜分析方法及原理課件211熒光光譜分析方法及原理課件212熒光光譜分析方法及原理課件213熒光光譜分析方法及原理課件214熒光光譜分析方法及原理課件215熒光光譜分析方法及原理課件216熒光光譜分析方法及原理課件217熒光光譜分析方法及原理課件218熒光光譜分析方法及原理課件219熒光光譜分析方法及原理課件220熒光光譜分析方法及原理課件221熒光光譜分析方法及原理課件222熒光光譜分析方法及原理課件223熒光光譜分析方法及原理課件224熒光光譜分析方法及原理課件225熒光光譜分析方法及原理課件226熒光光譜分析方法及原理課件227熒光光譜分析方法及原理課件228熒光光譜分析方法及原理課件229熒光光譜分析方法及原理課件230熒光光譜分析方法及原理課件231熒光光譜分析方法及原理課件232熒光光譜分析方法及原理課件233熒光光譜分析方法及原理課件234熒光光譜分析方法及原理課件235熒光光譜分析方法及原理課件236熒光光譜分析方法及原理課件237熒光光譜分析方法及原理課件238熒光光譜分析方法及原理課件239熒光光譜分析方法及原理課件240熒光光譜分析方法及原理課件241熒光光譜分析方法及原理課件242熒光光譜分析方法及原理課件243熒光光譜分析方法及原理課件244熒光光譜分析方法及原理課件245熒光光譜分析方法及原理課件246熒光光譜分析方法及原理課件247熒光光譜分析方法及原理課件248熒光光譜分析方法及原理課件249熒光光譜分析方法及原理課件250熒光光譜分析方法及原理課件251熒光光譜分析方法及原理課件252熒光光譜分析方法及原理課件253熒光光譜分析方法及原理課件254熒光光譜分析方法及原理課件255熒光光譜分析方法及原理課件256熒光光譜分析方法及原理課件257熒光光譜分析方法及原理課件258熒光光譜分析方法及原理課件259熒光光譜分析方法及原理課件260熒光光譜分析方法及原理課件261熒光光譜分析方法及原理課件262熒光光譜分析方法及原理課件263熒光光譜分析方法及原理課件264熒光光譜分析方法及原理課件265熒光光譜分析方法及原理課件266熒光光譜分析方法及原理課件267熒光光譜分析方法及原理課件268熒光光譜分析方法及原理課件269熒光光譜分析方法及原理課件270熒光光譜分析方法及原理課件271熒光光譜分析方法及原理課件272熒光光譜分析方法及原理課件273熒光光譜分析方法及原理課件274熒光光譜分析方法及原理課件275熒光光譜分析方法及原理課件276熒光光譜分析方法及原理課件277熒光光譜分析方法及原理課件278熒光光譜分析方法及原理課件279熒光光譜分析方法及原理課件280熒光光譜分析方法及原理課件281熒光光譜分析方法及原理課件282熒光光譜分析方法及原理課件283熒光光譜分析方法及原理課件284熒光光譜分析方法及原理課件285熒光光譜分析方法及原理課件286熒光光譜分析方法及原理課件287熒光光譜分析方法及原理課件288熒光光譜分析方法及原理課件289熒光光譜分析方法及原理課件290熒光光譜分析方法及原理課件291熒光光譜分析方法及原理課件292熒光光譜分析方法及原理課件293熒光光譜分析方法及原理課件294熒光光譜分析方法及原理課件295熒光光譜分析方法及原理課件296熒光光譜分析方法及原理課件297熒光光譜分析方法及原理課件298熒光光譜分析方法及原理課件299熒光光譜分析方法及原理課件300熒光光譜分析方法及原理課件301熒光光譜分析方法及原理課件302熒光光譜分析方法及原理課件303熒光光譜分析方法及原理課件304熒光光譜分析方法及原理課件305熒光光譜分析方法及原理課件306熒光光譜分析方法及原理課件307熒光光譜分析方法及原理課件308熒光光譜分析方法及原理課件309熒光光譜分析方法及原理課件310熒光光譜分析方法及原理課件311熒光光譜分析方法及原理課件312熒光光譜分析方法及原理課件313熒光光譜分析方法及原理課件314熒光光譜分析方法及原理課件315熒光光譜分析方法及原理課件316熒光光譜分析方法及原理課件317熒