聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)課件

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)PolymeraseChainReaction李偉溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院1/4/20231聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)李偉12/29/20221聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)生物技術(shù)（即細(xì)胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)）之一。由于通過體外（試管內(nèi)）擴(kuò)增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達(dá)到極大地提高核酸分子檢測的靈敏度，理論上其檢測的靈敏度可以達(dá)到一個細(xì)胞、甚至一個分子的水平。

1/4/20232聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainre主要內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的常見問題及體系優(yōu)化第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的方法發(fā)展及相關(guān)技術(shù)第四節(jié)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)第五節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)方法的標(biāo)準(zhǔn)化1/4/20233主要內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理12/29/2022第一節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理1/4/20234第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理12/29/20224一、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的簡史Watson、Crick：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)Meselson、Stahl:半保留復(fù)制模型Khorana：最早提出體外擴(kuò)增核酸的設(shè)想Kary.B.Mullis：發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)Saiki：發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶1/4/20235一、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的簡史Watson、Crick：DNA雙二.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理PCR技術(shù)實(shí)際上是模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過程,在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng),由變性－退火－延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。1/4/20236二.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理12/29/20226模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸經(jīng)25-30次循環(huán)，目的DNA增加106-7圖6-1PCR原理示意圖1/4/20237模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍1/4/202381234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94℃1/4/20239PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件1234522557294時間PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)94℃55℃引物1引物2DNA引物1/4/202310PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件94℃55℃引物1引物2DNAPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)55℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶1/4/202311PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件55℃引物1引物2DNA引物7PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束94℃第2輪開始1/4/202312PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第1輪結(jié)束94℃第2輪開PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)94℃55℃72℃TaqTaqTaqTaq1/4/202313PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件94℃55℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束1/4/202314PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第2輪結(jié)束12/29/2PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增1/4/202315PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步,模板DNA數(shù)量翻一倍(假設(shè)擴(kuò)增效率為100%)。如此反復(fù)循環(huán)，便可使DNA以指數(shù)形式進(jìn)行擴(kuò)增。每完成一個循環(huán)需2-4min，2-3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期（plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。1/4/202316在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步,模nyny圖6-2-1圖6-2-2圖6-2PCR擴(kuò)增效率圖y=A(1+R)n

y=A2n

1/4/202317nyny圖6-2-1圖6-2-2圖6-2PCR擴(kuò)增反應(yīng)組成：（五要素）模板（template）引物(primer)預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異三、PCR反應(yīng)體系DNA

RNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA★1/4/202318反應(yīng)組成：（五要素）三、PCR反應(yīng)體系基因組DNA質(zhì)粒DN

DNA聚合酶(DNApolymerase)

-dNTP:包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP-PCRbuffer:一般組成：50mMKCl,10-50mMTris-Cl(室溫PH8.3)，1.5mMMgCl2

1/4/202319DNA聚合酶(DNApolymerase)12/（六）PCR一般方案1．50ulPCR反應(yīng)體系的組成1）組成：①樣品DNA0.1～1ug；②正鏈引物（25umol/L）1.0ul；③負(fù)鏈引物（25umol/L）1.0ul；④脫氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul；⑤10×PCR緩沖液5.0ul；⑥MgCl2（25mmol/L）3.0ul；⑦TaqDNA聚合酶1～2.5u；⑧蒸餾的去離子水補(bǔ)至50ul。加入30ul石蠟油，短暫離心混勻。2）對照：陽性對照、空白對照分別以陽性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。1/4/202320（六）PCR一般方案12/29/2022202．PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置94℃30～60sec，55℃30～60sec，72℃30～60sec，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。3．PCR產(chǎn)物的保存與檢測PCR產(chǎn)物于4℃保存，PCR產(chǎn)物檢測。1/4/2023212．PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置12/29/202221四.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）核酸探針雜交法PCR產(chǎn)物測序PCR-OLA（PCR-oligonucleotideligationassay)熒光PCR1/4/202322四.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法、(一)聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及用途特點(diǎn)：分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點(diǎn)。用途：PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。1/4/202323(一)聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及用途特點(diǎn)：12/29/2022(二)PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸內(nèi)切酶有具識別的特異DNA序列，所以用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對目的DNA分子進(jìn)行消化，得到的酶切片段其大小和數(shù)量可以在一定程度上反應(yīng)出目的DNA分子的序列信息用途：傳染病病原體基因分型人類基因的變異性研究。是診斷遺傳病和傳染病病原體基因分型的常用方法1/4/202324(二)PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（polymerasPCR-RFLP法：

限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突變限制性內(nèi)切酶1/4/202325PCR-RFLP法：限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌(三)核酸探針雜交法1．點(diǎn)雜交（dotblot）2．反向點(diǎn)雜交（reversedotblot）3．微孔板雜交（microplatehybridization）4．PCR-EIA：（RNAprobehybridizationenzymeimmunoassay,RPEIA）5．Southern印跡雜交（Southernblot）1/4/202326(三)核酸探針雜交法12/29/202226點(diǎn)雜交（dotblot）原理：將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后直接點(diǎn)在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的寡核苷酸探針與之雜交。探針：放射性同位素標(biāo)記探針檢測的敏感、特異，具有不穩(wěn)定性和放射性危害。非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛、熒光素等）標(biāo)記的探針穩(wěn)定性高、使用安全、檢測速度快用途：主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。1/4/202327點(diǎn)雜交（dotblot）原理：將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后直接點(diǎn)在尼龍反向點(diǎn)雜交(reversedotblot)原理：使用帶有標(biāo)記物的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性。將不同的寡核酸探針固定在尼龍膜上，用變性的PCR產(chǎn)物與之雜交。探針：嚴(yán)格設(shè)計(jì)，具有相同的雜交反應(yīng)條件。用途：反向點(diǎn)雜交特別適用于遺傳性疾病多個位點(diǎn)的點(diǎn)突變分析。結(jié)果分析：正常純合子突變純合子雜合子1/4/202328反向點(diǎn)雜交(reversedotblot)原理：使用帶有Southern印跡雜交(Southernblot)1/4/202329Southern印跡雜交(Southernblot)12/(四)PCR-ELISA引物采用雙標(biāo)記，即一個引物5’端標(biāo)記便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團(tuán)（如生物素），另一個引物5’端標(biāo)記便于PCR產(chǎn)物檢測的基團(tuán)（如地高辛、熒光素等）。本法避免了電泳和雜交的步驟，適用于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測1/4/202330(四)PCR-ELISA引物采用雙標(biāo)記，即一個引物5’(五)單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，簡稱PCR-SSCP）本法就是將PCR產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。1/4/202331(五)單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SingleStraPCR-SSCP過程

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

↓

變性↓

單鏈DNA↓中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者3.為雜合子

.

解鏈構(gòu)像DAN原理過程1/4/202332PCR-SSCP過程---------(六)PCR-OLA法(七)PCR產(chǎn)物測序常用的方法:雙脫氧核苷酸鏈末端終止法化學(xué)裂解法。用途：科研1/4/202333(六)PCR-OLA法12/29/202233第二節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的常見問題及體系優(yōu)化1/4/202334第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的常見問題及體系優(yōu)化12/29/20一.常見問題及其分析1．假陽性①PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。②含有靶DNA序列的質(zhì)粒的污染。③陽性對照的污染。④標(biāo)本之間的交叉污染。⑤在采集標(biāo)本時，其他污染源帶來的污染。⑥Taq聚合酶中帶有細(xì)菌DNA，當(dāng)PCR擴(kuò)增片段為保守的rRNA序列時，易造成假陽性。1/4/202335一.常見問題及其分析1．假陽性12/29/2022352．假陰性假陰性是PCR反應(yīng)中另一個易出現(xiàn)的問題。造成的原因也比較多。可以歸納以下幾方面原因。(1)標(biāo)本處理的原因。①處理標(biāo)本時，靶DNA丟失。②處理標(biāo)本時，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。③標(biāo)本放置不當(dāng)，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。1/4/2023362．假陰性12/29/202236(2)PCR試劑問題。①TaqDNA聚合酶失活。②Mg2+濃度過低或是沒有加。(3)PCR擴(kuò)增過程中的問題①PCR擴(kuò)增儀故障。②PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒有加液體石蠟油。(4)PCR產(chǎn)物鑒定中的問題①電泳時沒有加溴化乙錠。②電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。③凝膠濃度過低，使擴(kuò)增帶跑散。1/4/202337(2)PCR試劑問題。12/29/2022373．引物二聚體形成引物二聚體的原因有：⑴兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3′端有互補(bǔ)區(qū)。⑵引物模板比例太高，可增加模板用量。⑶退火溫度過低。⑷熱循環(huán)次數(shù)過多。1/4/2023383．引物二聚體12/29/2022384．非特異性PCR產(chǎn)物1)造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因及其預(yù)防措施2）提高PCR反應(yīng)特異性的辦法5．PCR污染及預(yù)防措施6．RT-PCR中避免RNA酶（RNase）的污染（1）去除外源RNase污染（2）抑制內(nèi)源性RNase的活性1/4/2023394．非特異性PCR產(chǎn)物12/29/202239二.PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化1．模板核酸2．引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是由特異引物限定的，因此引物的設(shè)計(jì)與合成對PCR的成功與否有著決定性的意義。引物設(shè)計(jì)要求：(1)引物長度;(2)分布的均衡性;(3)引物二聚體及二級結(jié)構(gòu);(4)引物3’端、5’端的特異性(5)引物的內(nèi)部穩(wěn)定性;(6)引物的特異性(7)擴(kuò)增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)★1/4/202340二.PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化1．模板核酸引物設(shè)計(jì)要求：★12⑴長度15～30bp，過短特異性降低，過長則成本增加，產(chǎn)量也下降。⑵引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45～55%左右⑶引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)，兩個引物之間尤其在3’末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不然會形成引物二聚體。⑷引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性(<70%)或少于連續(xù)8個的互補(bǔ)堿基。要求在引物設(shè)計(jì)時采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析?！?/4/202341⑴長度15～30bp，過短特異性降低，過長則成本增加，產(chǎn)量⑸引物的5′末端堿基：并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠，其5′末端堿基可以不與模板DNA匹配呈游離狀態(tài)。最多可游離10個堿基并不影響PCR反應(yīng)進(jìn)行。⑹引物的3′末端堿基：原則上要求引物的3′末端與模板DNA一定要配對，另外3′末端的末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。引物3′末端堿基在錯誤配對時不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異，最好選T、G、C，而不選A.1/4/202342⑸引物的5′末端堿基：并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DN3．緩沖液4．Mg2+Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，也影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，則酶催化非特異的擴(kuò)增。1/4/2023433．緩沖液12/29/2022435．三磷酸脫氧核苷酸過高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗(yàn)成本。過低：反應(yīng)速度下降，可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。6．耐熱DNA聚合酶酶的需要量可根據(jù)不同的模板分子或引物而變化。偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增偏低：產(chǎn)物量降低7．溫度循環(huán)參數(shù):（1）變性溫度與時間（2）復(fù)性溫度與時間（3）延伸溫度與時間（4）循環(huán)數(shù)和擴(kuò)增效率1/4/2023445．三磷酸脫氧核苷酸12/29/202244（5）其它因素1）梯度PCR（TDPCRTouch-downPCR）根據(jù)引物Tm值，選定一個退火溫度范圍（跨越10~20℃的溫度范圍，引物Tm值在這個范圍之內(nèi)）。在設(shè)置循環(huán)參數(shù)時，讓退火溫度從選定范圍的最高溫度開始，逐步降低退火溫度（每次降低1~5℃），最后結(jié)束在選定范圍的最低溫度。在每一個退火溫度上循環(huán)2~5次。2）熱啟動PCR（hotstartPCR）由于TaqDNA聚合酶在低溫時仍有一定的聚合酶活性，第一輪PCR反應(yīng)前的升溫過程中會出現(xiàn)非特異產(chǎn)物，而降低了PCR反應(yīng)的特異性。可以通過所謂的“熱啟動”方式克服這一問題。1/4/202345（5）其它因素12/29/202245第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的方法發(fā)展及相關(guān)技術(shù)1/4/202346第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的方法發(fā)展及相關(guān)技術(shù)12/29/202一.PCR技術(shù)的發(fā)展巢式PCR（nestedPCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplexPCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不對稱PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）擴(kuò)增長片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(insituPCR)差示PCR（DD-PCR）定量PCR★1/4/202347一.PCR技術(shù)的發(fā)展巢式PCR（nestedPCR）圖6-3巢式PCR原理示意圖外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2第一次PCR第二次PCR（一）巢式PCR（nestedPCR）

1/4/202348圖6-3巢式PCR原理示意圖外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引（二）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增1/4/202349（二）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptioone-stepRT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA

為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，稱為一步法RT-PCR。RT-PCR時避免擴(kuò)增基因組DNA常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為42℃）和MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為37℃），常用的逆轉(zhuǎn)錄引物有三種：①隨機(jī)引物；②Oligo（dT），只適合于3′端帶有poly(A)尾的mRNA；③特異性引物，只適合于逆轉(zhuǎn)錄目的RNA序列。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，再做PCR。1/4/202350one-stepRT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆（三）多重PCR（multiplexPCR）

PCR一般由一對引物擴(kuò)增產(chǎn)生一個核酸片段，以此手段診斷疾病的效率太低。為提高效率，常采用多重PCR技術(shù)。該技術(shù)是在一個反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段，由于每對引物擴(kuò)增的片段長度不同，可用電泳加以鑒別。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時檢測或病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定。1/4/202351（三）多重PCR（multiplexPCR）12/29/用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物1/4/202352用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物12/29/202引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，變性和復(fù)性延伸異源部分雙鏈DNA形成5'5'5'5’5'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'5'5'5'5'5'5'PCR引物a引物d再次PCR5'5'3'3'圖6-4重組PCR原理示意圖（四）重組PCR（recombinantPCR）1/4/202353引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，變性和復(fù)性（五）錨定PCR（anchoredPCR，APCR）1/4/202354（五）錨定PCR（anchoredPCR，APCR）12/（六）不對稱PCR（asymmetricPCR）其基本原理是：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物（高濃度引物）與限制性引物（低濃度引物），二者之比為50～100:1。在PCR最初10-15個循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）；第15個循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ssDNA）。盡管此時單鏈DNA僅以線性速率遞增，但其濃度已能滿足雙脫氧鏈終止法測定DNA序列的要求。1/4/202355（六）不對稱PCR（asymmetricPCR）12/29已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切點(diǎn)（X）限制酶切點(diǎn)（X）限制酶X酶切連接未知序列（七）反向PCR（inversePCR）1/4/202356已知序列PCR用途：限制酶切點(diǎn)（X）限制酶切點(diǎn)（X）限制酶連Ag＋Ab生物素化的DNAAg-Ab復(fù)合物DNA-連接分子復(fù)合物連接分子檢測PCR＋Ag-Ab-連接分子-DNA-復(fù)合物圖6-5免疫PCR原理示意圖（八）免疫PCR（immunolPCR）1/4/202357Ag＋Ab生物素化的DNAAg-Ab復(fù)合物DNA-連接分子復(fù)（九）原位PCR（insituPCR）原位PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，其基本過程是，先用合適的固定劑（通常為甲醛固定劑如中性甲醛）對組織或細(xì)胞進(jìn)行固定，然后用蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以確保PCR試劑進(jìn)入細(xì)胞并同靶序列接觸，最后于Eppendorf管中或載玻片對DNA和RNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)原位擴(kuò)增。然后進(jìn)行產(chǎn)物分析并用顯微鏡觀察結(jié)果。1/4/202358（九）原位PCR（insituPCR）12/29/202直接法原位PCR

特點(diǎn)：PCR擴(kuò)增時用標(biāo)記dNTP或引物,使擴(kuò)增產(chǎn)物直接標(biāo)記標(biāo)記物：常用同位素、生物素、地高辛操作程序：組織細(xì)胞制備：固定、預(yù)處理原位擴(kuò)增：引物,TaqDNA聚合酶,標(biāo)記dNTP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：放射自顯影，ICC1/4/202359直接法原位PCR組織細(xì)胞制備：固定、預(yù)處理原位擴(kuò)增：引物,

優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、流程短、省時

缺點(diǎn)：特異性差，假陽性率高（固定、包埋、制片等使標(biāo)本內(nèi)DNA受損，DNA修復(fù)時，標(biāo)記dNTP進(jìn)入非靶序列；引物與模板的錯配）擴(kuò)增效率低不適用于切片標(biāo)本（切片比細(xì)胞標(biāo)本DNA受損重）1/4/202360優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、流程短、省時12/29/202260間接法原位PCR

特點(diǎn)：PCR體系中dNTP和引物均不標(biāo)記PCR擴(kuò)增結(jié)束后用標(biāo)記探針行原位雜交標(biāo)記物：以生物素、地高辛較為常用操作程序：組織細(xì)胞制備：固定、預(yù)處理滲入和原位擴(kuò)增：dNTP，引物,TaqDNA聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：ICC原位雜交：用特異性標(biāo)記探針1/4/202361間接法原位PCR組織細(xì)胞制備：固定、預(yù)處理滲入和原位擴(kuò)增：目前最常用

優(yōu)點(diǎn)：擴(kuò)增效率高特異性強(qiáng)（雜交探針特異性結(jié)合靶序列，不與擴(kuò)增產(chǎn)物中的非靶序列結(jié)合）可用于細(xì)胞制備和石蠟切片標(biāo)本

缺點(diǎn)：操作復(fù)雜1/4/202362目前最常用12/29/202262（十）定量PCR（QuantitivePolymeraseChainReaction，QPCR）1．PCR定量DNA一個或兩個拷貝的特定靶序列的細(xì)胞株即是標(biāo)準(zhǔn)的一個理想來源，也可使用含特定靶序列的質(zhì)粒DNA作為對照，將待檢樣品與一系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)對照一起擴(kuò)增，檢測PCR產(chǎn)物，即可推知靶序列的含量。2．PCR定量mRNA(1)mRNA相對定量(2)競爭性PCR定量mRNA(3)cRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量mRNA1/4/202363（十）定量PCR12/29/202263二.PCR相關(guān)技術(shù)（一）核酸序列依賴性擴(kuò)增（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）核酸序列依賴性擴(kuò)增，又稱自主序列復(fù)制（self-sustainedsequencereplication，SSR），主要用于RNA的擴(kuò)增、檢測及測序。1/4/202364二.PCR相關(guān)技術(shù)（一）核酸序列依賴性擴(kuò)增（nucleic引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNAcDNA模板5'5'3'3'5'3'引物BRNAseHRTT7RNA聚合酶100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A3'5'5'RNAseHRNARNAcDNAcDNA圖6-6NASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補(bǔ)，引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補(bǔ)1/4/202365引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'5'3'5（二）連接酶鏈反應(yīng)（ligasechainreaction，LCR）

連接酶鏈反應(yīng)，又稱連接酶擴(kuò)增反應(yīng)（ligaseamplificationreaction,LAR），是一種新的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。1/4/20236612/29/2022663'5'5'3'5'3'53'5'3'5'3'引物A引物B引物A'引物B'連接產(chǎn)物5'5'3'3'3'5'圖6-7LCR示意圖1/4/2023673'5'5'3'5'3'53'5'3'5'3'引物A引物B引在分子生物學(xué)工作中，常用到PCR產(chǎn)物克隆技術(shù)，以便對PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步研究，如測序、轉(zhuǎn)錄分析、RNase保護(hù)測定等。PCR產(chǎn)物克隆常用的方法有：平端克隆法、粘端克隆法、無連接酶亞克隆法。三.PCR產(chǎn)物的克隆1/4/202368在分子生物學(xué)工作中，常用到PCR產(chǎn)物克隆技術(shù)，以便對PCR產(chǎn)（一）平端克隆法（二）粘端克隆法1.引物5′端引入限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)2.T4DNA聚合酶回切產(chǎn)生粘端如圖6-8所示3.T載體（T－vector）法（三）無連接酶亞克隆法（ligase-freesubcloning，LFS）該方法無需使用連接酶，直接用PCR將PCR產(chǎn)物構(gòu)建到載體上去，故稱無連接酶亞克隆法。如圖5-9所示1/4/202369（一）平端克隆法12/29/20226920bp引物25'CGATTTC……CCGGTGC……5'20bp引物1CGATTTC……GCACCGGGCTAAAG……CGTGGCC5'3'3'5'CGATTTC……GCATAAAG……CGTGGCC5'3'3'5'PCR及PCR產(chǎn)物純化在僅有dATP和dTTP存在時，T4DNA聚合酶切除產(chǎn)物3‘端的C和GXmaI粘性末端AccI粘性末端圖6-8T4DNA聚合酶回切產(chǎn)生粘端示意圖1/4/20237020bp引物25'CGATTTC……CCGGT3'5'3'5'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'3'5'3'5'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'引物a引物bPCR異源部分雙鏈DNA的形成A管B管PCR(循環(huán)1)引物a引物c引物d引物bPCR(循環(huán)2-15)混合AB兩管，變性和復(fù)性環(huán)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌圖6-9無連接酶亞克隆法示意圖1/4/2023713'5'3'5'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'5'第四節(jié)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)1/4/202372第四節(jié)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)12/29/202272熒光定量PCR（FluorescenceQuantitivePolymeraseChainReactionFQ-PCR）基于熒光能量傳遞技術(shù)（FluorescenceresonanceenergytransferFRET）,通過受體發(fā)色團(tuán)之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán),轉(zhuǎn)移效率與兩個發(fā)色團(tuán)之間距離的6次冪倒數(shù)成比例，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，檢測PCR過程的熒光訊號便可得知靶序列初始濃度。在PCR反應(yīng)體系中，F(xiàn)Q-PCR的熒光標(biāo)記物可分為兩種：熒光染料標(biāo)記和熒光探針標(biāo)記。1/4/202373熒光定量PCR（FluorescenceQuantitiv熒光染料法SYBRgreen:特異性結(jié)合雙鏈，釋放熒光信號熒光探針法1.Taqman技術(shù)2.molecularBeacon技術(shù)3.復(fù)合探針法1/4/202374熒光染料法12/29/202274SYBR熒光染料SYBR熒光染料能特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)出任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。1/4/202375SYBR熒光染料12/29/202275SYBR-GreenI5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission雙鏈熒光染料圖6-10SYBR-GreenI熒光染料原理示意圖1/4/202376SYBR-GreenI5’3’5’3’SGExcitatiSYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission1/4/202377SYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSG圖6-11TaqMan技術(shù)原理示意圖3’端的熒光Q分子吸收5’端熒光R分子的熒光信號

探針5’端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來

熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例5’3’5’3’QRQ5’3’R5’3’激發(fā)5’3’5’3’激發(fā)RQ引物Taq酶二.熒光探針法1/4/202378圖6-11TaqMan技術(shù)原理示意圖3’端的熒光Q分子吸圖6-12雙探針技術(shù)原理示意圖熒光淬滅的程度與起始模板數(shù)的量成正比RQXQ淬滅探針R發(fā)光探針Taqman技術(shù)的延伸1/4/202379圖6-12雙探針技術(shù)原理示意圖熒光淬滅的程度與起始模板2．Molecularbeacon技術(shù)(分子燈塔法)RQX激發(fā)RQQR激發(fā)發(fā)射分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),使熒光劑和淬滅劑緊密接觸,導(dǎo)致熒光淬滅單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補(bǔ)而與之雜交探針5’和3’端分離,淬滅劑對熒光劑的淬滅作用消失,產(chǎn)生熒光工作原理發(fā)夾形的寡聚核苷酸探針

內(nèi)部淬滅的熒光團(tuán)1/4/2023802．Molecularbeacon技術(shù)(分子燈塔法)RQX激3．復(fù)合探針法（complexprobes）該法的基本原理是首先合成兩個探針，一是熒光探針（25bp），5′端接一熒光分子，另一為淬滅探針（15bp），3′端接一淬滅分子，淬滅探針能與熒光探針5′端雜交。Q淬滅

XQ淬滅探針R發(fā)光探針RR1/4/2023813．復(fù)合探針法（complexprobes）Q淬滅三.FQ-PCR的應(yīng)用前景及展望FQ-PCR的出現(xiàn)，簡化了mRNA的可重復(fù)定量和檢測過程，并可精確定量。FQ-PCR反應(yīng)迅速、信號重復(fù)性好、靈敏度和特異性高，結(jié)果準(zhǔn)確，且不必使用對人體有害的染色劑，與傳統(tǒng)PCR相比有明顯的優(yōu)勢。因此，F(xiàn)Q-PCR的出現(xiàn)，不僅克服了傳統(tǒng)PCR技術(shù)普遍存在的假陽性及不能定量等問題，使得PCR技術(shù)更廣泛地應(yīng)用于臨床，在監(jiān)測患者病情、預(yù)后、指導(dǎo)用藥等方面有著廣闊的應(yīng)用前景，而且在核酸的檢測應(yīng)用中，在臨床診斷或大規(guī)模的人群分子流行病學(xué)調(diào)查中，在腫瘤、遺傳病研究，尤其是基因表達(dá)方面的研究，都有廣闊的應(yīng)用前景。1/4/202382三.FQ-PCR的應(yīng)用前景及展望FQ-PCR的出現(xiàn)，簡化了第五節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)方法的標(biāo)準(zhǔn)化1/4/202383第五節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)方法的標(biāo)準(zhǔn)化12/29/202283PCR技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是具有極高的敏感性。然而正因如此和由于PCR反應(yīng)過程中所受的人為因素的影響，與以往其他任何一種檢驗(yàn)診斷技術(shù)相比，其結(jié)果都較易受到各種自身和外部因素的影響。所以，制定一套適應(yīng)當(dāng)前基因診斷實(shí)驗(yàn)的基本要求并使PCR技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序已迫在眉睫。1/4/202384PCR技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是具有極高的敏感性。然而正因如此和由于P一.PCR實(shí)驗(yàn)診斷的基本原則二.PCR操作程序標(biāo)準(zhǔn)化（一）上崗人員培訓(xùn)制度（二）標(biāo)準(zhǔn)化PCR診斷實(shí)驗(yàn)室（三）PCR標(biāo)準(zhǔn)化操作程序1．試劑配制、分裝及保存2．標(biāo)本的采集與處理3．基因擴(kuò)增及其實(shí)驗(yàn)條件的選擇4．?dāng)U增產(chǎn)物檢測5．PCR結(jié)果的判讀（四）污染的預(yù)防及污染源的標(biāo)準(zhǔn)化處理1/4/202385一.PCR實(shí)驗(yàn)診斷的基本原則12/29/202285隨著以基因的體外擴(kuò)增（PCR）技術(shù)為核心的疾病基因診斷的發(fā)展，臨床PCR基因診斷的標(biāo)準(zhǔn)化已受到越來越多的重視。但由于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可用于臨床基因檢測的技術(shù)非常之多，因而在短時間內(nèi)對以PCR技為主的臨床基因診斷（或檢測），難以很快形成一個較為完善的和完整的標(biāo)準(zhǔn)化體系或系統(tǒng)。因此聚合酶鏈反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化過程任重道遠(yuǎn)，需要我們分子檢驗(yàn)工作者共同不懈的努力。

1/4/202386隨著以基因的體外擴(kuò)增（PCR）技術(shù)為核心的疾病基因診斷的發(fā)展聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)PolymeraseChainReaction李偉溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院1/4/202387聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)李偉12/29/20221聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)生物技術(shù)（即細(xì)胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)）之一。由于通過體外（試管內(nèi)）擴(kuò)增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達(dá)到極大地提高核酸分子檢測的靈敏度，理論上其檢測的靈敏度可以達(dá)到一個細(xì)胞、甚至一個分子的水平。

1/4/202388聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainre主要內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的常見問題及體系優(yōu)化第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的方法發(fā)展及相關(guān)技術(shù)第四節(jié)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)第五節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)方法的標(biāo)準(zhǔn)化1/4/202389主要內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理12/29/2022第一節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理1/4/202390第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理12/29/20224一、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的簡史Watson、Crick：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)Meselson、Stahl:半保留復(fù)制模型Khorana：最早提出體外擴(kuò)增核酸的設(shè)想Kary.B.Mullis：發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)Saiki：發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶1/4/202391一、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的簡史Watson、Crick：DNA雙二.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理PCR技術(shù)實(shí)際上是模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過程,在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng),由變性－退火－延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。1/4/202392二.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理12/29/20226模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸經(jīng)25-30次循環(huán)，目的DNA增加106-7圖6-1PCR原理示意圖1/4/202393模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍1/4/2023941234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94℃1/4/202395PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件1234522557294時間PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)94℃55℃引物1引物2DNA引物1/4/202396PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件94℃55℃引物1引物2DNAPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)55℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶1/4/202397PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件55℃引物1引物2DNA引物7PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束94℃第2輪開始1/4/202398PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第1輪結(jié)束94℃第2輪開PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)94℃55℃72℃TaqTaqTaqTaq1/4/202399PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件94℃55℃72℃TaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束1/4/2023100PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第2輪結(jié)束12/29/2PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增1/4/2023101PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步,模板DNA數(shù)量翻一倍(假設(shè)擴(kuò)增效率為100%)。如此反復(fù)循環(huán)，便可使DNA以指數(shù)形式進(jìn)行擴(kuò)增。每完成一個循環(huán)需2-4min，2-3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期（plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。1/4/2023102在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步,模nyny圖6-2-1圖6-2-2圖6-2PCR擴(kuò)增效率圖y=A(1+R)n

y=A2n

1/4/2023103nyny圖6-2-1圖6-2-2圖6-2PCR擴(kuò)增反應(yīng)組成：（五要素）模板（template）引物(primer)預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異三、PCR反應(yīng)體系DNA

RNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA★1/4/2023104反應(yīng)組成：（五要素）三、PCR反應(yīng)體系基因組DNA質(zhì)粒DN

DNA聚合酶(DNApolymerase)

-dNTP:包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP-PCRbuffer:一般組成：50mMKCl,10-50mMTris-Cl(室溫PH8.3)，1.5mMMgCl2

1/4/2023105DNA聚合酶(DNApolymerase)12/（六）PCR一般方案1．50ulPCR反應(yīng)體系的組成1）組成：①樣品DNA0.1～1ug；②正鏈引物（25umol/L）1.0ul；③負(fù)鏈引物（25umol/L）1.0ul；④脫氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul；⑤10×PCR緩沖液5.0ul；⑥MgCl2（25mmol/L）3.0ul；⑦TaqDNA聚合酶1～2.5u；⑧蒸餾的去離子水補(bǔ)至50ul。加入30ul石蠟油，短暫離心混勻。2）對照：陽性對照、空白對照分別以陽性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。1/4/2023106（六）PCR一般方案12/29/2022202．PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置94℃30～60sec，55℃30～60sec，72℃30～60sec，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。3．PCR產(chǎn)物的保存與檢測PCR產(chǎn)物于4℃保存，PCR產(chǎn)物檢測。1/4/20231072．PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置12/29/202221四.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）核酸探針雜交法PCR產(chǎn)物測序PCR-OLA（PCR-oligonucleotideligationassay)熒光PCR1/4/2023108四.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法、(一)聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及用途特點(diǎn)：分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點(diǎn)。用途：PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。1/4/2023109(一)聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及用途特點(diǎn)：12/29/2022(二)PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸內(nèi)切酶有具識別的特異DNA序列，所以用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對目的DNA分子進(jìn)行消化，得到的酶切片段其大小和數(shù)量可以在一定程度上反應(yīng)出目的DNA分子的序列信息用途：傳染病病原體基因分型人類基因的變異性研究。是診斷遺傳病和傳染病病原體基因分型的常用方法1/4/2023110(二)PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（polymerasPCR-RFLP法：

限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突變限制性內(nèi)切酶1/4/2023111PCR-RFLP法：限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌(三)核酸探針雜交法1．點(diǎn)雜交（dotblot）2．反向點(diǎn)雜交（reversedotblot）3．微孔板雜交（microplatehybridization）4．PCR-EIA：（RNAprobehybridizationenzymeimmunoassay,RPEIA）5．Southern印跡雜交（Southernblot）1/4/2023112(三)核酸探針雜交法12/29/202226點(diǎn)雜交（dotblot）原理：將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后直接點(diǎn)在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的寡核苷酸探針與之雜交。探針：放射性同位素標(biāo)記探針檢測的敏感、特異，具有不穩(wěn)定性和放射性危害。非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛、熒光素等）標(biāo)記的探針穩(wěn)定性高、使用安全、檢測速度快用途：主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。1/4/2023113點(diǎn)雜交（dotblot）原理：將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后直接點(diǎn)在尼龍反向點(diǎn)雜交(reversedotblot)原理：使用帶有標(biāo)記物的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性。將不同的寡核酸探針固定在尼龍膜上，用變性的PCR產(chǎn)物與之雜交。探針：嚴(yán)格設(shè)計(jì)，具有相同的雜交反應(yīng)條件。用途：反向點(diǎn)雜交特別適用于遺傳性疾病多個位點(diǎn)的點(diǎn)突變分析。結(jié)果分析：正常純合子突變純合子雜合子1/4/2023114反向點(diǎn)雜交(reversedotblot)原理：使用帶有Southern印跡雜交(Southernblot)1/4/2023115Southern印跡雜交(Southernblot)12/(四)PCR-ELISA引物采用雙標(biāo)記，即一個引物5’端標(biāo)記便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團(tuán)（如生物素），另一個引物5’端標(biāo)記便于PCR產(chǎn)物檢測的基團(tuán)（如地高辛、熒光素等）。本法避免了電泳和雜交的步驟，適用于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測1/4/2023116(四)PCR-ELISA引物采用雙標(biāo)記，即一個引物5’(五)單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，簡稱PCR-SSCP）本法就是將PCR產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。1/4/2023117(五)單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SingleStraPCR-SSCP過程

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

↓

變性↓

單鏈DNA↓中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者3.為雜合子

.

解鏈構(gòu)像DAN原理過程1/4/2023118PCR-SSCP過程---------(六)PCR-OLA法(七)PCR產(chǎn)物測序常用的方法:雙脫氧核苷酸鏈末端終止法化學(xué)裂解法。用途：科研1/4/2023119(六)PCR-OLA法12/29/202233第二節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的常見問題及體系優(yōu)化1/4/2023120第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的常見問題及體系優(yōu)化12/29/20一.常見問題及其分析1．假陽性①PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。②含有靶DNA序列的質(zhì)粒的污染。③陽性對照的污染。④標(biāo)本之間的交叉污染。⑤在采集標(biāo)本時，其他污染源帶來的污染。⑥Taq聚合酶中帶有細(xì)菌DNA，當(dāng)PCR擴(kuò)增片段為保守的rRNA序列時，易造成假陽性。1/4/2023121一.常見問題及其分析1．假陽性12/29/2022352．假陰性假陰性是PCR反應(yīng)中另一個易出現(xiàn)的問題。造成的原因也比較多?？梢詺w納以下幾方面原因。(1)標(biāo)本處理的原因。①處理標(biāo)本時，靶DNA丟失。②處理標(biāo)本時，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。③標(biāo)本放置不當(dāng)，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。1/4/20231222．假陰性12/29/202236(2)PCR試劑問題。①TaqDNA聚合酶失活。②Mg2+濃度過低或是沒有加。(3)PCR擴(kuò)增過程中的問題①PCR擴(kuò)增儀故障。②PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒有加液體石蠟油。(4)PCR產(chǎn)物鑒定中的問題①電泳時沒有加溴化乙錠。②電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。③凝膠濃度過低，使擴(kuò)增帶跑散。1/4/2023123(2)PCR試劑問題。12/29/2022373．引物二聚體形成引物二聚體的原因有：⑴兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3′端有互補(bǔ)區(qū)。⑵引物模板比例太高，可增加模板用量。⑶退火溫度過低。⑷熱循環(huán)次數(shù)過多。1/4/20231243．引物二聚體12/29/2022384．非特異性PCR產(chǎn)物1)造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因及其預(yù)防措施2）提高PCR反應(yīng)特異性的辦法5．PCR污染及預(yù)防措施6．RT-PCR中避免RNA酶（RNase）的污染（1）去除外源RNase污染（2）抑制內(nèi)源性RNase的活性1/4/20231254．非特異性PCR產(chǎn)物12/29/202239二.PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化1．模板核酸2．引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是由特異引物限定的，因此引物的設(shè)計(jì)與合成對PCR的成功與否有著決定性的意義。引物設(shè)計(jì)要求：(1)引物長度;(2)分布的均衡性;(3)引物二聚體及二級結(jié)構(gòu);(4)引物3’端、5’端的特異性(5)引物的內(nèi)部穩(wěn)定性;(6)引物的特異性(7)擴(kuò)增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)★1/4/2023126二.PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化1．模板核酸引物設(shè)計(jì)要求：★12⑴長度15～30bp，過短特異性降低，過長則成本增加，產(chǎn)量也下降。⑵引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45～55%左右⑶引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)，兩個引物之間尤其在3’末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不然會形成引物二聚體。⑷引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性(<70%)或少于連續(xù)8個的互補(bǔ)堿基。要求在引物設(shè)計(jì)時采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析?！?/4/2023127⑴長度15～30bp，過短特異性降低，過長則成本增加，產(chǎn)量⑸引物的5′末端堿基：并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠，其5′末端堿基可以不與模板DNA匹配呈游離狀態(tài)。最多可游離10個堿基并不影響PCR反應(yīng)進(jìn)行。⑹引物的3′末端堿基：原則上要求引物的3′末端與模板DNA一定要配對，另外3′末端的末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。引物3′末端堿基在錯誤配對時不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異，最好選T、G、C，而不選A.1/4/2023128⑸引物的5′末端堿基：并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DN3．緩沖液4．Mg2+Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，也影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，則酶催化非特異的擴(kuò)增。1/4/20231293．緩沖液12/29/2022435．三磷酸脫氧核苷酸過高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗(yàn)成本。過低：反應(yīng)速度下降，可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。6．耐熱DNA聚合酶酶的需要量可根據(jù)不同的模板分子或引物而變化。偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增偏低：產(chǎn)物量降低7．溫度循環(huán)參數(shù):（1）變性溫度與時間（2）復(fù)性溫度與時間（3）延伸溫度與時間（4）循環(huán)數(shù)和擴(kuò)增效率1/4/20231305．三磷酸脫氧核苷酸12/29/202244（5）其它因素1）梯度PCR（TDPCRTouch-downPCR）根據(jù)引物Tm值，選定一個退火溫度范圍（跨越10~20℃的溫度范圍，引物Tm值在這個范圍之內(nèi)）。在設(shè)置循環(huán)參數(shù)時，讓退火溫度從選定范圍的最高溫度開始，逐步降低退火溫度（每次降低1~5℃），最后結(jié)束在選定范圍的最低溫度。在每一個退火溫度上循環(huán)2~5次。2）熱啟動PCR（hotstartPCR）由于TaqDNA聚合酶在低溫時仍有一定的聚合酶活性，第一輪PCR反應(yīng)前的升溫過程中會出現(xiàn)非特異產(chǎn)物，而降低了PCR反應(yīng)的特異性。可以通過所謂的“熱啟動”方式克服這一問題。1/4/2023131（5）其它因素12/29/202245第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的方法發(fā)展及相關(guān)技術(shù)1/4/2023132第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的方法發(fā)展及相關(guān)技術(shù)12/29/202一.PCR技術(shù)的發(fā)展巢式PCR（nestedPCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplexPCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不對稱PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）擴(kuò)增長片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(insituPCR)差示PCR（DD-PCR）定量PCR★1/4/2023133一.PCR技術(shù)的發(fā)展巢式PCR（nestedPCR）圖6-3巢式PCR原理示意圖外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2第一次PCR第二次PCR（一）巢式PCR（nestedPCR）

1/4/2023134圖6-3巢式PCR原理示意圖外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引（二）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增1/4/2023135（二）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptioone-stepRT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA

為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，稱為一步法RT-PCR。RT-PCR時避免擴(kuò)增基因組DNA常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為42℃）和MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為37℃），常用的逆轉(zhuǎn)錄引物有三種：①隨機(jī)引物；②Oligo（dT），只適合于3′端帶有poly(A)尾的mRNA；③特異性引物，只適合于逆轉(zhuǎn)錄目的RNA序列。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，再做PCR。1/4/2023136one-stepRT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆（三）多重PCR（multiplexPCR）

PCR一般由一對引物擴(kuò)增產(chǎn)生一個核酸片段，以此手段診斷疾病的效率太低。為提高效率，常采用多重PCR技術(shù)。該技術(shù)是在一個反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段，由于每對引物擴(kuò)增的片段長度不同，可用電泳加以鑒別。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時檢測或病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定。1/4/2023137（三）多重PCR（multiplexPCR）12/29/用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物1/4/2023138用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物12/29/202引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，變性和復(fù)性延伸異源部分雙鏈DNA形成5'5'5'5’5'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'5'5'5'5'5'5'PCR引物a引物d再次PCR5'5'3'3'圖6-4重組PCR原理示意圖（四）重組PCR（recombinantPCR）1/4/2023139引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，變性和復(fù)性（五）錨定PCR（anchoredPCR，APCR）1/4/2023140（五）錨定PCR（anchoredPCR，APCR）12/（六）不對稱PCR（asymmetricPCR）其基本原理是：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物（高濃度引物）與限制性引物（低濃度引物），二者之比為50～100:1。在PCR最初10-15個循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）；第15個循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ssDNA）。盡管此時單鏈DNA僅以線性速率遞增，但其濃度已能滿足雙脫氧鏈終止法測定DNA序列的要求。1/4/2023141（六）不對稱PCR（asymmetricPCR）12/29已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切點(diǎn)（X）限制酶切點(diǎn)（X）限制酶X酶切連接未知序列（七）反向PCR（inversePCR）1/4/2023142已知序列PCR用途：限制酶切點(diǎn)（X）限制酶切點(diǎn)（X）限制酶連Ag＋Ab生物素化的DNAAg-Ab復(fù)合物DNA-連接分子復(fù)合物連接分子檢測PCR＋Ag-Ab-連接分子-DNA-復(fù)合物圖6-5免疫PCR原理示意圖（八）免疫PCR（immunolPCR）1/4/2023143Ag＋Ab生物素化的DNAAg-Ab復(fù)合物DNA-連接分子復(fù)（九）原位PCR（insituPCR）原位PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，其基本過程是，先用合適的固定劑（通常為甲醛固定劑如中性甲醛）對組織或細(xì)胞進(jìn)行固定，然后用蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以確保PCR試劑進(jìn)入細(xì)胞并同靶序列接觸，最后于Eppendorf管中或載玻片對DNA和RNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)原位擴(kuò)增。然后進(jìn)行產(chǎn)物分析并用顯微鏡觀察結(jié)果。1/4/2023144（九）