核酸檢測實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化管理

關(guān)于核酸檢測實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化管理第一頁，共二十頁，2022年，8月28日一、規(guī)范化設(shè)置及管理第二頁，共二十頁，2022年，8月28日

(一)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則

1．臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)分隔開的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。（如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并）

2．各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。

3．進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

4．不同工作區(qū)域使用不同的工作服(例如不同的顏色)。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。第三頁，共二十頁，2022年，8月28日（二）工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)

1．試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

2-8℃和-15℃冰箱；混勻器；微量加樣器(覆蓋1--1000μl)；移動(dòng)紫外燈(近工作臺面)；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品。

2．標(biāo)本制備區(qū)

1-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱；高速臺式冷凍離心機(jī)；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器(覆蓋1--1000μl)；可移動(dòng)紫外燈(近工作臺面)；超凈工作臺；消耗品;

一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品；如需處理大分子DNA，應(yīng)備有超聲波水浴儀。第四頁，共二十頁，2022年，8月28日3.擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

核酸擴(kuò)增儀；微量加樣器(覆蓋1--1000μl)；可移動(dòng)紫外燈(近工作臺面)；消耗品（一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品.4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)基本儀器設(shè)備如下：微量加樣器(覆蓋1--1000μl)；可移動(dòng)紫外燈；消耗品；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品。

第五頁，共二十頁，2022年，8月28日（三）各區(qū)操作注意事項(xiàng)下述操作在該區(qū)進(jìn)行：儲存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。在本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過程中，必須戴手套并經(jīng)常更換。操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。1.試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)第六頁，共二十頁，2022年，8月28日2.標(biāo)本制備區(qū)

下述操作在該區(qū)進(jìn)行：標(biāo)本保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時(shí)cDNA的合成。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。樣本處理對核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法。第七頁，共二十頁，2022年，8月28日3.擴(kuò)增區(qū)下述操作在該區(qū)進(jìn)行：DNA或RNA擴(kuò)增。在巢式PCR測定中，通常第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增由較高的危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。不能從本區(qū)再進(jìn)入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在本區(qū)的走動(dòng)。第八頁，共二十頁，2022年，8月28日4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測定。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。本區(qū)如采用負(fù)壓或減壓情況下可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性第九頁，共二十頁，2022年，8月28日二、質(zhì)量保證臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)所有階段，即測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中的核酸提取，擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報(bào)告等。（一）標(biāo)本的采集（二）標(biāo)本的穩(wěn)定化處理（三）標(biāo)本的運(yùn)送（四）標(biāo)本的貯存（五）標(biāo)本的處理(核酸提取)（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄CFIT)和擴(kuò)增（七）污染（八）擴(kuò)增產(chǎn)物的分析（九）質(zhì)量控制

第十頁，共二十頁，2022年，8月28日（一）標(biāo)本的采集

常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括EDTA或構(gòu)櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時(shí)必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理。臨床用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。第十一頁，共二十頁，2022年，8月28日（二）標(biāo)本的穩(wěn)定化處理

用于DNA擴(kuò)增檢測的標(biāo)本，應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。用于RNA測定的標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定化處理，異硫氰酸胍鹽(Guanidinethiocyanate，CITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1：4的比例加至含有5mol／LGITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。第十二頁，共二十頁，2022年，8月28日（三）標(biāo)本的運(yùn)送

標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下郵寄運(yùn)送。用于RNA檢測的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。第十三頁，共二十頁，2022年，8月28日（四）標(biāo)本的貯存

臨床體液標(biāo)本如血清／血漿等可于-70℃下長時(shí)間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol／LTris—1mmol／LEDTA緩沖液(pH7.5—8.0)中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天。第十四頁，共二十頁，2022年，8月28日（五）標(biāo)本的處理(核酸提取)

標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對其進(jìn)行充分評價(jià)以驗(yàn)證其提取的有效性。當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定失敗的常見原因是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。故建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。第十五頁，共二十頁，2022年，8月28日（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴(kuò)增

1．靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等；(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。2．核酸的擴(kuò)增有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg2+濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。第十六頁，共二十頁，2022年，8月28日（七）污染

在實(shí)際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴(kuò)增片段的污染（產(chǎn)物污染）、天然基因組DNA的污染、試劑污染（儲存液或工作液）以及標(biāo)本間交叉污染（如氣溶膠從一個(gè)陽性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本）。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的最主要來源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。

1．測定分析前的污染源

2．測定分析階段的污染源

3．污染的避免

工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的即是為了預(yù)防污染。為避免以前測定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP，持續(xù)的長波紫外燈照射，不能用其來替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴(kuò)增的天然DNA的污染。

4．去除污染的措施:次氯酸鈉、紫外線照射、高壓消毒第十七頁，共二十頁，2022年，8月28日（八）擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

擴(kuò)增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗(yàn)項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。

雜交檢測時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序盒雜交條件。第十八頁，共二十頁，2022年，8月28日（九）質(zhì)量控制

必須對DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由于核酸擴(kuò)增測定的高敏感性，所以標(biāo)本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施。目前的商品試劑盒大部分沒采用內(nèi)標(biāo)方法質(zhì)控。因此，在測定血清/血漿病原體核酸如HBVDNA、HCVRNA等時(shí)，應(yīng)使用已知的弱陽性血清