微生物實(shí)驗教案

精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)專心---專注---專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)《微生物學(xué)》實(shí)驗教學(xué)教案[實(shí)驗項目]實(shí)驗一微生物學(xué)試驗常用玻璃儀器洗滌及干熱滅菌[教學(xué)時數(shù)]3學(xué)時[實(shí)驗?zāi)康呐c要求]1．認(rèn)識微生物實(shí)驗所需要的各種器皿，了解常用工具和儀器的名稱、用途。2．掌握對玻璃器皿的清洗、包扎方法與干熱滅菌的操作過程。[實(shí)驗原理]微生物學(xué)實(shí)驗要求較高的無菌狀態(tài)，因此，實(shí)驗所用的器皿，大多數(shù)要進(jìn)行消毒、滅菌從而用以培養(yǎng)微生物，所以對其質(zhì)量、規(guī)格、洗滌和包扎方法均有一定要求。清潔的玻璃器皿是實(shí)驗得到正確結(jié)果的先決條件，包扎方法要能保證防止污染雜菌。干熱滅菌的原理，空的玻璃器皿一般用干熱滅菌。干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160～170℃），時間要長（1～2h），但干熱滅菌溫度不能超過180℃[實(shí)驗材料與設(shè)備]1．培養(yǎng)皿、大試管、三角瓶6只、燒杯（500ml）2只、燒杯（1000ml）1只、小試管6只、吸管（0.2ml2支，0.5ml2支，1ml2支，5ml2支）共8支。2．去污粉、肥皂、清洗劑、毛刷。3．棉花、扎繩、包扎紙。[實(shí)驗步驟]（一）學(xué)習(xí)下列常用儀器的種類、規(guī)格和應(yīng)用范圍1.培養(yǎng)皿由一底一蓋組成一套，常用的培養(yǎng)皿皿底直徑90mm，高15mm,皿底皿蓋均為玻璃制成。制成平板，可用于分離、純化、鑒定菌種、活菌計數(shù)以及測定抗生素、噬菌體的效價等。2.試管(1)大試管(約18mm×180mm):可裝倒平板用的培養(yǎng)基，可作制備斜面用（需要大量菌體時用），裝液體培養(yǎng)基用于微生物的振蕩培養(yǎng)。(2)中試管[(13～15)mm×(100～150)mm]:裝液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌或做斜面用，用于細(xì)菌、霉菌、病毒等的稀釋和血清學(xué)試驗。(3)小試管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖發(fā)酵或血清學(xué)試驗，和其它需要節(jié)省材料的試驗。三角瓶規(guī)格有100mL、250mL、500mL和1000mL用來裝無菌水、培養(yǎng)基和振蕩培養(yǎng)微生物等。燒杯規(guī)格有50mL、100mL、250mL、500mL和1000mL用來配制培養(yǎng)基與各種溶液等。5.吸管規(guī)格有0.1mL、1mL、2mL、5mL、10mL用來量取轉(zhuǎn)移各種溶液等。6.量筒規(guī)格有50mL、100mL、250mL、500mL。學(xué)習(xí)玻璃器皿的洗滌方法1.新玻璃器皿的洗滌在2%的鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時，用自來水沖洗干凈。2.舊玻璃器皿的洗滌（1）試管、培養(yǎng)皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自來水沖洗A裝有固體培養(yǎng)基：刮掉，洗滌B帶菌的器皿：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時或煮沸0.5小時，然后洗滌C帶病原菌培養(yǎng)物的器皿：先高壓蒸汽滅菌，倒去培養(yǎng)物（2）玻璃吸管：吸管尖端與裝在水龍頭上的橡皮管連接，反復(fù)沖洗A吸過血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自來水的容器中浸泡，實(shí)驗后集中沖洗。B塞有棉花的吸管：用水將棉花沖出，然后沖洗C吸過含有微生物培養(yǎng)物的吸管：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時然后洗D吸管內(nèi)壁有油垢：洗滌液中浸泡數(shù)小時，再沖洗(三)學(xué)習(xí)各種器皿的包扎1.培養(yǎng)皿的包扎：牛皮紙或舊報紙包緊，一般以5～8套培養(yǎng)皿包成1包2.吸管的包扎：在上端約0.5cm處，塞入一小段1.5cm長的棉花（勿用脫脂棉），目的是避免將外界或嘴中雜菌吹入管內(nèi)，或不慎將菌液吸出管外。用4～5cm寬的長紙條卷起來3.試管和三角瓶等的包扎：用橡皮塞和牛皮紙。(四)干熱滅菌1．裝入待滅菌物品將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、吸管等）放入電烘箱內(nèi)，關(guān)好箱門。物品不要擺太擠，以免妨礙空氣流通；不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。2．升溫接通電源，撥動開關(guān)，打開電烘箱排氣孔，讓溫度逐漸上升。當(dāng)溫度升至100℃3．恒溫當(dāng)溫度升達(dá)到160～170℃干熱火菌過程。嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動控制失靈而造成安全事故。4．降溫切斷電源、自然降溫。5．開箱取物待電烘箱內(nèi)溫度降到70℃[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]1.通過本次實(shí)驗?zāi)阏J(rèn)識了微生物學(xué)實(shí)驗常用的哪些器皿？2.簡述玻璃器皿洗滌的基本要求。3.簡述干熱滅菌的操作步驟。[實(shí)驗項目]實(shí)驗二培養(yǎng)基的制備與滅菌[教學(xué)時數(shù)]4學(xué)時[實(shí)驗?zāi)康呐c要求]1．了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2．了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。[實(shí)驗原理]培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因素和水。根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。從培養(yǎng)基的組成成分可分為:1.合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。2.半合成培養(yǎng)基：一部分純化學(xué)物質(zhì)和一部分天然物質(zhì)配制而成。3.天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機(jī)物配制而成。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為:1.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。2.固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。3.半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2—0.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。察氏一號培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的霉菌培養(yǎng)基。高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。當(dāng)蒸汽壓達(dá)到1.055kg/cm2時，鍋內(nèi)溫度可達(dá)到121℃[實(shí)驗材料與設(shè)備]1.器材試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。2.試劑牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂[實(shí)驗步驟]1.稱量→溶化→調(diào)pH→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查2.干熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恒溫→降溫→開箱取物3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查4.過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌關(guān)鍵步驟及注意事項1.要嚴(yán)格按配方配制。2.調(diào)pH不要過頭。3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70oC以下放物、取物。4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當(dāng)，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的?2.在配制培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?3.培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件?為什么?4.培養(yǎng)基的配制原則是什么?[實(shí)驗項目]實(shí)驗三環(huán)境和人體微生物的檢測及無菌操作技術(shù)[教學(xué)時數(shù)]3學(xué)時[實(shí)驗?zāi)康呐c要求]1.通過檢測環(huán)境和人體中微生物的存在，體會微生物分布的廣泛性。2.學(xué)習(xí)無菌操作的技術(shù)，掌握利用稀釋涂布平板法從土壤中分離微生物的方法。[實(shí)驗原理]自然環(huán)境中和人及動物的體表、體內(nèi)都存在大量的微生物，它們一遇到適合的條件就會大量繁殖。當(dāng)把取自不同來源的含菌樣品接種于含有生長發(fā)育需要的各種營養(yǎng)成分的固體培養(yǎng)基時，就會形成肉眼可見的微生物集體群落-菌落。每種微生物菌落都有其獨(dú)有的特點(diǎn)，如大小、顏色、表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑、邊緣整齊或不整齊等。因此，可以通過平板培養(yǎng)來檢測不同環(huán)境下微生物的數(shù)量、種類和特點(diǎn)。[實(shí)驗材料與設(shè)備]1.恒溫培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、移液槍2.培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、察氏一號培養(yǎng)基；地面以下5-10cm的土壤；3.酒精燈、無菌棉棒、無菌生理鹽水、涂布棒、記號筆、培養(yǎng)皿、吸管、試管、三角瓶[實(shí)驗步驟]1.無菌操作技術(shù)在酒精燈火焰旁操作，將融化并冷卻至不燙手的滅菌固體培養(yǎng)基倒入無菌的培養(yǎng)皿，倒量為容積的1/3~1/2或者覆蓋皿底5毫米左右，然后平放到桌面待其凝固即為無菌平板。2.土樣的稀釋分離制備土樣懸濁液：稱取土樣1g，迅速倒入盛有99ml無菌水和玻璃球的三角瓶中，置入磁力棒，攪拌10-15min，使土樣充分打散，即成10-2的土壤懸濁液。稀釋：用無菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL，放入4.5mL無菌水中即為10-3稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3～10-6的稀釋液。(注意：操作時每一個稀釋度換用一支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。)3.環(huán)境及人體各部位取菌樣4.標(biāo)記、培養(yǎng)標(biāo)記：A-Ⅰ-1-10-5姓名按培養(yǎng)基類別：細(xì)菌培養(yǎng)基--A，霉菌培養(yǎng)基--B按3個大組：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、按4個中組：1-4按樣品類別：10-5、10-6、口腔--a、鼻腔--b、頭發(fā)--c、空氣--d按個人標(biāo)記：姓名培養(yǎng)：將接種的平板分別放入細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。霉菌保持25-27℃，3-5天；細(xì)菌35-37[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]無菌倒平板時注意的事項有哪些？平板接種后為什么要倒置培養(yǎng)？通過本次試驗?zāi)銓W(xué)到了什么？有什么體會？[實(shí)驗項目]實(shí)驗六細(xì)菌的單染色與革蘭氏染色[教學(xué)時數(shù)]3學(xué)時[實(shí)驗?zāi)康呐c要求]1.學(xué)習(xí)對細(xì)菌的涂片、染色和無菌操作技術(shù)。2.了解染色原理、學(xué)習(xí)并掌握單染色和革蘭氏染色技術(shù)。。[實(shí)驗原理]細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識別，染色后，菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。微生物學(xué)中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。染色部位分芽孢、鞭毛、莢膜染色其機(jī)理主要是由于兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同。G+菌，肽聚糖多，脂質(zhì)少，酒精不易進(jìn)入；G-菌，肽聚糖少，脂質(zhì)多，酒精易進(jìn)入[實(shí)驗材料與設(shè)備]1.菌種：E.coli（大腸桿菌）、B.subtilis（枯草芽孢桿菌）、玉米細(xì)菌等2.試劑：石炭酸復(fù)紅染色液、革蘭氏染色液(草酸銨結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、沙黃染色液）3.其他：顯微鏡、載玻片、生理鹽水、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、擦鏡紙等[實(shí)驗步驟]一、單染色法：滴無菌水→涂片→自然干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢（高倍鏡、油鏡）二、革蘭氏（Gram）染色法1.涂片2.初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1-1.5分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4.脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約30秒，后立即用流水沖洗。5.復(fù)染：滴加番紅染色液，染1-1.5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6.鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]1.革蘭氏染色過程中大腸桿菌、枯草桿菌、玉米細(xì)菌、金黃葡萄球菌等分別被染成什么色，分別為革蘭氏反應(yīng)的什么菌？2.涂片用的玻璃片為什么不得有油污？為什么涂片要求菌膜要均勻、薄？3.革蘭氏染色的原理4.染色注意事項有哪些？[實(shí)驗項目]實(shí)驗七微生物的顯微鏡計數(shù)、大小測量和酵母菌的死活鑒別[教學(xué)時數(shù)]5學(xué)時[實(shí)驗?zāi)康呐c要求]1.學(xué)習(xí)并掌握利用顯微鏡直接計數(shù)的基本方法。2.了解并掌握酵母菌的死活鑒別染色的原理和技術(shù)[實(shí)驗原理]1.兩種常用計數(shù)方法，即直接計數(shù)法（血球計數(shù)板計數(shù)法）和間接計數(shù)法（平板菌落計數(shù)法）。本實(shí)驗是利用血球計數(shù)板進(jìn)行直接計數(shù)。2.利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)，由于計數(shù)室的容積是一定的，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。3.美蘭（氧化型呈藍(lán)色，還原型呈無色），活的酵母菌具有將氧化型美蘭還原成還原型的能力，故染色后是透明的，而死的酵母菌則被染成了藍(lán)色。計數(shù)方法：計數(shù)時，通常數(shù)五個（或四個）中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。設(shè)被選作計數(shù)的中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個）如果是16個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/4×16×104×B=40000A·B（個）[實(shí)驗材料與設(shè)備]酵母菌懸液（市售的干酵母粉）血球計數(shù)板、蓋玻片、吸水紙顯微鏡、接種環(huán)、分類計數(shù)器0.1%的美藍(lán)染色液[實(shí)驗步驟]1制備菌懸液、染色用吸管吸取菌懸液（1滴）加入試管，用生理鹽水（8滴）進(jìn)行稀釋，滴加（1滴）美蘭染色液。2加菌懸液樣品將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用毛細(xì)滴管將搖勻的菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動進(jìn)入計數(shù)室，用吸水紙吸去多余水液（注意一定不要有溢出和產(chǎn)生氣泡）。3顯微鏡計數(shù)加樣后靜止1min，先用低倍鏡然后換成高倍鏡，計數(shù)時，對位于線上酵母菌，一般只數(shù)上方和左邊線上的，當(dāng)酵母菌芽體達(dá)到母細(xì)胞大小的二分之一時，可記作兩個細(xì)胞。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算樣品的含菌量。4清洗血球計數(shù)板計數(shù)完畢，將計數(shù)板在水龍頭下沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用電吹風(fēng)吹干。5.計算：利用相應(yīng)公式進(jìn)行計算（見前面公式或者課本公式），并將實(shí)驗結(jié)果填入作業(yè)中的表格內(nèi)。實(shí)驗注意事項1.要正確使用顯微鏡，光線亮度要調(diào)的合適。2.菌液制備要精準(zhǔn)，稀釋倍數(shù)要合適。如果濃度過大就再稀釋，如果過小再重做。3.計上不計下，計左不計右。出芽計一半4.濃度稀釋標(biāo)準(zhǔn)：以每小方格內(nèi)含有5-10個酵母細(xì)胞為宜，一般稀釋10倍即可。5.計數(shù)室內(nèi)一定不要有溢出和產(chǎn)生氣泡。6.其他微生物孢子技術(shù)與酵母菌類似，基本操作一樣。7.確保血球計數(shù)板清洗干凈。[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]1.使用血球計數(shù)板計數(shù)時，應(yīng)注意什么？2.將計數(shù)結(jié)果填入表格中。3.簡單說明酵母菌死活染色的原理。[實(shí)驗項目]實(shí)驗八微生物細(xì)胞大小的測定[教學(xué)時數(shù)]3學(xué)時[實(shí)驗?zāi)康呐c要求]1.了解測微尺的構(gòu)造和使用，學(xué)習(xí)并掌握測定微生物細(xì)胞大小的方法。[實(shí)驗原理]微生物細(xì)胞的大小的測量是在顯微鏡下用目鏡測微尺來進(jìn)行的，但由于測量的是放大后的圖像，故目鏡測微尺在不同放大倍率下每格實(shí)際代表的長度也隨之變化，因此，需用物鏡測微尺來校正在不同放大倍率下目鏡測微尺每格所代表的實(shí)際長度。物鏡測微尺是中央刻有精確刻度的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長0．01mm，即10um，它不直接用于測量細(xì)胞大小，而是用于校正目鏡測微尺的每格的相對長度。[實(shí)驗材料與設(shè)備]酵母菌懸液（市售的干酵母粉）或者制作的霉菌裝片目鏡測微尺，物鏡測微尺、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸水紙