2基因工程-工具酶匯總課件

第二章工具酶第二章工具酶限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）：識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。[單位定義]在指明pH與37℃，在0.05mL反應(yīng)混合物中，1小時消化1μg的λDNA的酶量為1單位。命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。第1個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，大寫第2，3二個字母取自它來源細(xì)菌的種名的頭2個字母，小寫第4個字母代表株，小寫最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionend根據(jù)限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)以及所需要的輔助因子，可將目前已鑒定出的限制性內(nèi)切酶一般將限制酶分為3種不同類型。I型：切割位點(diǎn)不確定，不適用于基因工程。Ⅱ型：基因工程的工具酶。Ⅲ型：切割位點(diǎn)不在識別位點(diǎn)。限制性內(nèi)切酶的屬性【酶活單位】、【最適溫度】、【識別位點(diǎn)】、【切割位點(diǎn)】、【星活性】、【酶切切口】限制與修飾系統(tǒng)的種類根據(jù)限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)以及所需要的輔助因子，可識別雙鏈DNA未甲基化修飾的特異序列，與該序列相互作用，然后延DNA分子移動，在距離特異性識別位點(diǎn)約1000-1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈，造成大約75個核苷酸的切口。EcoB識別序列：EcoK識別序列：I型限制性內(nèi)切酶識別雙鏈DNA未甲基化修飾的特異序列，與該序列相互作用，然后識別雙鏈DNA上未甲基化修飾的一小段明確的序列（多數(shù)是回文序列），然后在識別位點(diǎn)之內(nèi)的特定位置切割。EcoRIHaeIII識別序列：識別序列：HindIIIEcoRV識別序列：識別序列：II型限制性內(nèi)切酶識別雙鏈DNA上未甲基化修飾的一小段明確的序列（多數(shù)是回文序齊平末端(Bluntend)：在識別序列內(nèi)的對稱軸上切割，其切割產(chǎn)物具平頭末端（不易重新連接）。粘性末端(Stickyend)：在識別序列2條鏈對應(yīng)位上錯位切割，有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。粘性末端的意義：粘性末端突出的單鏈部分可以與相同的酶或同尾酶切割得到的粘性末端的單鏈部分互補(bǔ)配對。酶切切口

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識別序列和酶切切口（平端）5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’齊平末端(Bluntend)：在識別序列內(nèi)的對稱軸上切割2基因工程-工具酶匯總課件同裂酶：識別位點(diǎn)序列相同的限制性內(nèi)切酶。完全同裂酶不完全同裂酶同尾酶：識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

Ⅱ同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識別。同裂酶：識別位點(diǎn)序列相同的限制性內(nèi)切酶。完全同裂酶不完全同裂能完全肯定的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)，但切割位點(diǎn)也是在識別位點(diǎn)的一側(cè)的一定距離，通常距特異性位點(diǎn)24bp-26bp。AarI識別序列：BsmBI識別序列：III型限制性內(nèi)切酶能完全肯定的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)，但切割位點(diǎn)也是在識別位點(diǎn)的一限制酶識別序列的長度一般為4-8個堿基，最常見的為6個堿基。當(dāng)識別序列為4個和6個堿基時，它們可識別的序列在完全隨機(jī)的情況下，平均每256(4^4=256)個和4096(4^6=4096)個堿基中會出現(xiàn)一個識別位點(diǎn)。4個堿基識別位點(diǎn)：Sau3AⅠ↓GATC5個堿基識別位點(diǎn)：EcoRⅡ↓CCWGG6個堿基識別位點(diǎn)：EcoRⅠG↓AATTC7個堿基識別位點(diǎn)：BbvCⅠCC↓TCAGC8個堿基識別位點(diǎn)：NotⅠ

GC↓GGCCGC以上序列中部分字母代表的堿基如下：R=A或G；Y=C或T；M=A或C；K=G或T；S=C或G；W=A或TH=A或C或T；B=C或G或T；V=A或C或G；D=A或G或T；N=A或C或G或T限制酶識別序列的長度限制酶識別序列的長度一般為4-8個堿基，最常見的為6核酸限制性內(nèi)切酶不同類型比較特性I類內(nèi)切酶II類內(nèi)切酶III類內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷蛋氨酸)Mg2+

ATP、Mg2+和SAM宿主特異性識別EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列AarI：CACCTGC(N)4BsmBI：CGTCTC(N)1切割位點(diǎn)在距離識別位點(diǎn)至少1000bp處隨機(jī)切開一條單鏈。位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近距寄主特異性位點(diǎn)3‘端24-26bp處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)識別未甲基化的序列進(jìn)行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用常規(guī)使用用途特殊核酸限制性內(nèi)切酶不同類型比較特性I類內(nèi)切酶II類內(nèi)切酶III1.DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。

2.DNA的甲基化程度：基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：3.溫度：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。4.DNA的分子結(jié)構(gòu)：DNA分子的不同構(gòu)型對限制性內(nèi)切酶的活性也有很大的影響。某些限制性核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA所需要的酶量要比消化線性的DNA量高出很多倍。5.緩沖液：影響限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液?；瘜W(xué)組成中MgCl2、NaCl/KCl提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等有助于酶的穩(wěn)定。影響限制性內(nèi)切酶活性的因素dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG中的C）。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCHindIIISmaI3725ApyIBstEII3060BanIBsmBI50551.DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、如改變反應(yīng)條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號活性。限制性內(nèi)切酶的星活性EcoRI：正常狀態(tài)在低鹽、高pH（>8）時G|AATTCCTTAA|GG|AATTACTTAA|TA|AATTCTTTAA|GG|AGTTCCTCAA|G如改變反應(yīng)條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號活性。限D(zhuǎn)NA連接酶DNA連接酶：一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。【單位定義】在最佳反應(yīng)條件下,15℃反應(yīng)1小時，完全連接1μgλ-DNA（HindIII片段）所需的酶量.DNA連接酶分為ATP依賴型和NAD+依賴型。常用的DNA連接酶T4DNA連接酶E.coliDNA連接酶TaqDNA連接酶E.ColiDNA連接酶T4DNA連接酶TaqDNA連接酶催化連接底物DNADNA、RNADNA反應(yīng)需輔因子NADATPNAD用途黏性末端的連接黏性末端平末端的連接及切口的連接黏性末端平末端的連接及切口的連接DNA連接酶DNA連接酶：一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助AT第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段；第二種方法是，用DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來；第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。DNA連接策略粘性末端平末端平末端第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的直接連接具平末端DNA片段之間的直接連接1、DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接2、黏性末端修飾成平末端后進(jìn)行連接3、DNA片段5’端脫磷酸化作用后連接4、DNA片段加連桿或銜接頭后連接DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接1、DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接DNA片段末端修飾后進(jìn)1、DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接特點(diǎn)：給平末端DNA片段3’-OH加上同聚物1、DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接特點(diǎn)：給平末端DNA片2、黏性末端修飾成平末端后進(jìn)行連接特點(diǎn)：先修飾成平末端，后連接。2、黏性末端修飾成平末端后進(jìn)行連接特點(diǎn)：先修飾成平末端，后連3、DNA片段5·端脫磷酸化作用后連接特點(diǎn)：先使一種DNA片段的5’端由磷酸基（-P）轉(zhuǎn)變?yōu)椋?OH）3、DNA片段5·端脫磷酸化作用后連接特點(diǎn)：先使一種DNA4、DNA片段加連桿或銜接頭后連接4、DNA片段加連桿或銜接頭后連接DNA聚合酶（DNApolymerase）是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點(diǎn)開始復(fù)制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。真核細(xì)胞有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶α（定位于胞核，參與復(fù)制引發(fā)，不具5'－3'外切酶活性），β（定位于核內(nèi)，參與修復(fù)，不具5'－3'外切酶活性），γ（定位于線粒體，參與線粒體復(fù)制，不具5'－3'，有3'－5'外切活性），δ（定位核，參與復(fù)制，具有3'－5'，不具5'－3'外切活性），ε（定位于核，參與損傷修復(fù)，具有3'－5'，不具5'－3'外切活性）。原核細(xì)胞已發(fā)現(xiàn)有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，都與DNA鏈的延長有關(guān)。DNA聚合酶I是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA的延長；DNA聚合酶II則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān)；DNA聚合酶III在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長的主要酶。DNA聚合酶DNA聚合酶（DNApolymerase）是細(xì)胞復(fù)制DNA[1]聚合作用：在引物-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸從5‘→3’的順序加上去。[2]3‘→5’外切酶活性（校對作用）：從3‘→5’方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。[3]5‘→3’外切酶活性（切除修復(fù)作用）：從5‘→3’方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5‘-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部分（雙鏈）磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5’→3‘。[4]焦磷酸Ppi水解作用：催化3‘末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機(jī)焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。[5]焦磷酸交換作用：催化dNTP末端的Ppi同無機(jī)焦磷酸的交換反應(yīng)?！?】和【5】都要求有較高濃度的PPi，體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。DNA聚合酶的功能[1]聚合作用：在引物-OH末端，以dNTP為底物，按模板D大腸桿菌DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ（DNApolⅡ）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ（DNApolⅢ）Klenow片段T4-DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶TaqDNA聚合酶pfuDNA聚合酶原核DNA聚合酶的種類大腸桿菌DNA聚合酶原核DNA聚合酶的種類1、5`3`聚合酶活性：以DNA為模版，在dNTP和鎂離子的存在下，催化單核苷酸結(jié)合到引物分子的3`-OH末端，沿5`3`方向合成DNA。2、5`3`外切酶活性：可以從5`端降解雙鏈DNA，使之成為單核苷酸，也可降解DNA:RNA雜交體中的RNA成份，即擁有RNA酶H活性。需要5`端游離的磷酸基團(tuán)3、3`5`外切酶活性：從3`-OH末端降解單鏈或雙鏈DNA分子，降解產(chǎn)物為單核苷酸，當(dāng)有dNTP存在時，5`3`聚合酶活性抑制3`5`外切酶活性。DNApolI具有3種酶活性，在基因工程中常用作制備探針。大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）1、5`3`聚合酶活性：以DNA為模版，在dNTP和鎂離子用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大腸桿菌DNA聚合酶I為兩個蛋白質(zhì)片段，其中較小的片段具有5`3`外切酶活性，較大的片段具有5`3`聚合酶和3`5`外切酶活性，稱為Klenow片段。Klenow片段的功能：1、補(bǔ)平粘性末端2、標(biāo)記末端3、合成cDNA第二鏈4、用于Sanger雙脫氧末端終止法的DNA序列分析5、合成雜交探針Klenow片段常用功能用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大腸桿菌DNA聚合酶I為兩個蛋2基因工程-工具酶匯總課件DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApolⅠ不是DNA復(fù)制的主要聚合酶。1970年發(fā)現(xiàn)了DNApolⅡ。此酶MW為120KD，每個細(xì)胞內(nèi)約有100個酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。DNApolⅡ的功能：⑴聚合作用：該酶催化DNA的聚合，但是對模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙（gap）的單鏈DNA部分，而且該單鏈空隙部分不長于100個核苷酸。⑵該酶也具有3'→5'外切酶活性，但無5'→3'外切酶活性。⑶該酶對作用底物的選擇性較強(qiáng)，一般只能將2-脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。⑷該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，可能在DNA的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。大腸桿菌DNA聚合酶II（DNApolII）DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApolⅠ不是DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3'→5'外切酶活性的最適底物是單鏈?zhǔn)荄NA，只產(chǎn)生5'-單核苷酸，不會產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從3'端開始切除一個核苷酸。5'→3'外切酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用于雙鏈區(qū)。DNApolⅢ是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度（nonpermissivetemperature）內(nèi)是不能生長的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶Ⅲ則可以恢復(fù)其合成DNA的能力。大腸桿菌DNA聚合酶III（DNApolIII）DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ相似，也是一條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，它至少含有15個半胱氨酸殘基。T4DNA聚合酶的作用與大腸桿菌DNApolI不同[1]它無5'→3'外切酶活性[2]它需要一條有引物的單鏈DNA作模板[3]它利用單鏈DNA為模板，也可同時利用它作為引物，3'端的未雜交部分即被T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性切去，然后在其作用下從3'-OH端開始聚合，合成該模板DNA的互補(bǔ)鏈，再以互補(bǔ)鏈為模板合成原來的單鏈DNA。T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ相似，也是一條多肽分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶具有5‘→3'外切酶活性，不存在3’→5’外切酶活性。TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3'加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3'突出的單A核苷酸尾；在僅有dTTP存在時，它可將平端的質(zhì)粒的3'端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3'端突出的單T核苷酸尾。應(yīng)用這一特性，可實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法。耐熱DNA聚合酶---TaqDNA聚合酶從高溫嗜熱菌（Pyrococcusfuriosis）中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可校正PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的錯誤，使產(chǎn)物的堿基錯配率極低。PCR產(chǎn)物為平端，無3'端突出的單A核苷酸。耐熱DNA聚合酶---pfuDNA聚合酶分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，核糖核酸酶(Ribonuclease,Rnase)是一類催化RNA降解為小片段的核酸酶。在所有已研究的有機(jī)體中都含有大量不同類型的核糖核酸酶，表明RNA降解是一個非常原始而且重要的過程。除了幫助清除細(xì)胞內(nèi)不再需要的RNA，RNase同時也參與了所有RNA分子的成熟過程，其中既包含了攜帶遺傳物質(zhì)用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的信使RNA，也包含了細(xì)胞內(nèi)功能多樣的各種非編碼RNA。核糖核酸酶可劃分為核糖核酸內(nèi)切酶（endoribonucleases）和核糖核酸外切酶（exoribonucleases）。在生物科研的日常應(yīng)用中，RNaseA和RNaseH是兩類最常見的核糖核酸酶，兩者同屬于核糖核酸內(nèi)切酶亞類。核糖核酸酶核糖核酸酶(Ribonuclease,Rnase)是一類催RNaseH：是核糖核酸內(nèi)切酶，它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。RNaseA：對RNA有水解作用，但對DNA則不起作用。RNaseA在C端和U端殘基處專一地催化RNA的核糖部分3'-與5'-磷酸二酯鍵的裂開，形成具有2',3'-環(huán)磷酸衍生物寡聚核苷酸。如pG-pG-pC-pA-pG被切割產(chǎn)生pG-pG-pCp和A-pG?？梢杂脕砣コ鼶NA制品中的污染RNA。RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后又迅速復(fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時，必須戴手套。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達(dá)到要求。玻璃制品則一般是在140度烘箱烘烤3個小時。RNaseH：是核糖核酸內(nèi)切酶，它能夠特異性地水解雜交到DS1核酸酶來源于稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)，是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，在最適的酶催反應(yīng)條件下，降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5`-磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。對雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA-RNA雜交體相對不敏感。特異性降解單鏈DNA和RNA，在最適條件下,降解單鏈的速度比雙鏈快75000倍。這種酶需要低水平的zn2+的激活，最適pH范圍為4.0～4.3。一些螯合劑(如EDTA和檸檬酸等)能強(qiáng)烈地抑制s1核酸酶活性，此外磷酸緩沖液和0.6％左右的SDS溶液也可以抑制它的活性，但它對尿素以及甲酰胺等試劑則是穩(wěn)定的。S1核酸酶S1核酸酶來源于稻谷曲霉(AspergillusoryzaeS1核酸酶S1核酸酶S1核酸酶S1核酸酶逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶---AMV反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶---M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒（ＡＭＶ）的反轉(zhuǎn)錄酶具有兩類活性：ＤＮＡ聚合酶的活性和ＲＮａｓｅＨ的降解活性。其ＤＮＡ聚合酶活性表現(xiàn)為既能利用ＲＮＡ也能利用ＤＮＡ作為模板，指導(dǎo)與模板互補(bǔ)的ＤＮＡ的合成。這兩種活性可能共用一個活性位點(diǎn)，在以ＲＮＡ為模板時稱為ＲＮＡ指導(dǎo)的ＤＮＡ聚合酶活性，而以ＤＮＡ為模板時則叫做ＤＮＡ指導(dǎo)的ＤＮＡ聚合酶活性。從莫洛尼氏鼠白血病病毒分離出來，可用于合成第一鏈cDNA、制作cDNA探針、RNA轉(zhuǎn)錄、測序和RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本酶是通過點(diǎn)突變使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同，同時其延伸能力也有顯著提高。逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶---AMV反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶---M-MRNA聚合酶（RNApolymerase）：以一條DNA鏈或RNA為模板催化合成RNA的酶。因?yàn)樵诩?xì)胞內(nèi)與基因DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)錄有關(guān)，所以也稱轉(zhuǎn)錄酶。真核細(xì)胞含有3類不同的RNA聚合酶，根據(jù)其對α-鵝膏蕈堿的敏感性不同，分為RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ、RNA聚合酶Ⅲ。RNA聚合酶酶的種類存在功能對抑制物的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁合成rRNA前體不敏感RNA聚合酶Ⅱ核質(zhì)合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA低濃度敏感RNA聚合酶Ⅲ核質(zhì)合成5SrRNA前體、tRNA前體及其他的核和胞質(zhì)小RNA前體高濃度敏感RNA聚合酶（RNApolymerase）：以一條DNA鏈用連接酶將Sau3A(↓GATC)切割的DNA與經(jīng)BamHI(G↓GATCC)切割的DNA連接起來后，能夠被BamHI切割的幾率有多少？如何使下列的限制酶識別位點(diǎn)由一種序列變?yōu)榈诙N,或由第一種變?yōu)榈谌NGATCGATATCGATCGATCSau3AIEcoRVClaI

AAGCTTAAGCGCTTHindIIIThaI，HaeII一DNA分子中有一個SmaI識別位點(diǎn)(CCCGGG)，想要將這識別位點(diǎn)順序完全除去，現(xiàn)已知該位點(diǎn)及兩側(cè)的序列為ACCCGGGT，應(yīng)該如何設(shè)計實(shí)驗(yàn)?

作業(yè)用連接酶將Sau3A(↓GATC)切割的DNA與經(jīng)BamHI第二章工具酶第二章工具酶限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）：識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。[單位定義]在指明pH與37℃，在0.05mL反應(yīng)混合物中，1小時消化1μg的λDNA的酶量為1單位。命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。第1個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，大寫第2，3二個字母取自它來源細(xì)菌的種名的頭2個字母，小寫第4個字母代表株，小寫最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionend根據(jù)限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)以及所需要的輔助因子，可將目前已鑒定出的限制性內(nèi)切酶一般將限制酶分為3種不同類型。I型：切割位點(diǎn)不確定，不適用于基因工程。Ⅱ型：基因工程的工具酶。Ⅲ型：切割位點(diǎn)不在識別位點(diǎn)。限制性內(nèi)切酶的屬性【酶活單位】、【最適溫度】、【識別位點(diǎn)】、【切割位點(diǎn)】、【星活性】、【酶切切口】限制與修飾系統(tǒng)的種類根據(jù)限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)以及所需要的輔助因子，可識別雙鏈DNA未甲基化修飾的特異序列，與該序列相互作用，然后延DNA分子移動，在距離特異性識別位點(diǎn)約1000-1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈，造成大約75個核苷酸的切口。EcoB識別序列：EcoK識別序列：I型限制性內(nèi)切酶識別雙鏈DNA未甲基化修飾的特異序列，與該序列相互作用，然后識別雙鏈DNA上未甲基化修飾的一小段明確的序列（多數(shù)是回文序列），然后在識別位點(diǎn)之內(nèi)的特定位置切割。EcoRIHaeIII識別序列：識別序列：HindIIIEcoRV識別序列：識別序列：II型限制性內(nèi)切酶識別雙鏈DNA上未甲基化修飾的一小段明確的序列（多數(shù)是回文序齊平末端(Bluntend)：在識別序列內(nèi)的對稱軸上切割，其切割產(chǎn)物具平頭末端（不易重新連接）。粘性末端(Stickyend)：在識別序列2條鏈對應(yīng)位上錯位切割，有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。粘性末端的意義：粘性末端突出的單鏈部分可以與相同的酶或同尾酶切割得到的粘性末端的單鏈部分互補(bǔ)配對。酶切切口

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識別序列和酶切切口（平端）5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’齊平末端(Bluntend)：在識別序列內(nèi)的對稱軸上切割2基因工程-工具酶匯總課件同裂酶：識別位點(diǎn)序列相同的限制性內(nèi)切酶。完全同裂酶不完全同裂酶同尾酶：識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

Ⅱ同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識別。同裂酶：識別位點(diǎn)序列相同的限制性內(nèi)切酶。完全同裂酶不完全同裂能完全肯定的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)，但切割位點(diǎn)也是在識別位點(diǎn)的一側(cè)的一定距離，通常距特異性位點(diǎn)24bp-26bp。AarI識別序列：BsmBI識別序列：III型限制性內(nèi)切酶能完全肯定的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)，但切割位點(diǎn)也是在識別位點(diǎn)的一限制酶識別序列的長度一般為4-8個堿基，最常見的為6個堿基。當(dāng)識別序列為4個和6個堿基時，它們可識別的序列在完全隨機(jī)的情況下，平均每256(4^4=256)個和4096(4^6=4096)個堿基中會出現(xiàn)一個識別位點(diǎn)。4個堿基識別位點(diǎn)：Sau3AⅠ↓GATC5個堿基識別位點(diǎn)：EcoRⅡ↓CCWGG6個堿基識別位點(diǎn)：EcoRⅠG↓AATTC7個堿基識別位點(diǎn)：BbvCⅠCC↓TCAGC8個堿基識別位點(diǎn)：NotⅠ

GC↓GGCCGC以上序列中部分字母代表的堿基如下：R=A或G；Y=C或T；M=A或C；K=G或T；S=C或G；W=A或TH=A或C或T；B=C或G或T；V=A或C或G；D=A或G或T；N=A或C或G或T限制酶識別序列的長度限制酶識別序列的長度一般為4-8個堿基，最常見的為6核酸限制性內(nèi)切酶不同類型比較特性I類內(nèi)切酶II類內(nèi)切酶III類內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷蛋氨酸)Mg2+

ATP、Mg2+和SAM宿主特異性識別EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列AarI：CACCTGC(N)4BsmBI：CGTCTC(N)1切割位點(diǎn)在距離識別位點(diǎn)至少1000bp處隨機(jī)切開一條單鏈。位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近距寄主特異性位點(diǎn)3‘端24-26bp處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)識別未甲基化的序列進(jìn)行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用常規(guī)使用用途特殊核酸限制性內(nèi)切酶不同類型比較特性I類內(nèi)切酶II類內(nèi)切酶III1.DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。

2.DNA的甲基化程度：基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：3.溫度：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。4.DNA的分子結(jié)構(gòu)：DNA分子的不同構(gòu)型對限制性內(nèi)切酶的活性也有很大的影響。某些限制性核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA所需要的酶量要比消化線性的DNA量高出很多倍。5.緩沖液：影響限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液?；瘜W(xué)組成中MgCl2、NaCl/KCl提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等有助于酶的穩(wěn)定。影響限制性內(nèi)切酶活性的因素dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG中的C）。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCHindIIISmaI3725ApyIBstEII3060BanIBsmBI50551.DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、如改變反應(yīng)條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號活性。限制性內(nèi)切酶的星活性EcoRI：正常狀態(tài)在低鹽、高pH（>8）時G|AATTCCTTAA|GG|AATTACTTAA|TA|AATTCTTTAA|GG|AGTTCCTCAA|G如改變反應(yīng)條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號活性。限D(zhuǎn)NA連接酶DNA連接酶：一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵?！締挝欢x】在最佳反應(yīng)條件下,15℃反應(yīng)1小時，完全連接1μgλ-DNA（HindIII片段）所需的酶量.DNA連接酶分為ATP依賴型和NAD+依賴型。常用的DNA連接酶T4DNA連接酶E.coliDNA連接酶TaqDNA連接酶E.ColiDNA連接酶T4DNA連接酶TaqDNA連接酶催化連接底物DNADNA、RNADNA反應(yīng)需輔因子NADATPNAD用途黏性末端的連接黏性末端平末端的連接及切口的連接黏性末端平末端的連接及切口的連接DNA連接酶DNA連接酶：一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助AT第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段；第二種方法是，用DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來；第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。DNA連接策略粘性末端平末端平末端第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的直接連接具平末端DNA片段之間的直接連接1、DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接2、黏性末端修飾成平末端后進(jìn)行連接3、DNA片段5’端脫磷酸化作用后連接4、DNA片段加連桿或銜接頭后連接DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接1、DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接DNA片段末端修飾后進(jìn)1、DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接特點(diǎn)：給平末端DNA片段3’-OH加上同聚物1、DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接特點(diǎn)：給平末端DNA片2、黏性末端修飾成平末端后進(jìn)行連接特點(diǎn)：先修飾成平末端，后連接。2、黏性末端修飾成平末端后進(jìn)行連接特點(diǎn)：先修飾成平末端，后連3、DNA片段5·端脫磷酸化作用后連接特點(diǎn)：先使一種DNA片段的5’端由磷酸基（-P）轉(zhuǎn)變?yōu)椋?OH）3、DNA片段5·端脫磷酸化作用后連接特點(diǎn)：先使一種DNA4、DNA片段加連桿或銜接頭后連接4、DNA片段加連桿或銜接頭后連接DNA聚合酶（DNApolymerase）是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點(diǎn)開始復(fù)制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。真核細(xì)胞有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶α（定位于胞核，參與復(fù)制引發(fā)，不具5'－3'外切酶活性），β（定位于核內(nèi)，參與修復(fù)，不具5'－3'外切酶活性），γ（定位于線粒體，參與線粒體復(fù)制，不具5'－3'，有3'－5'外切活性），δ（定位核，參與復(fù)制，具有3'－5'，不具5'－3'外切活性），ε（定位于核，參與損傷修復(fù)，具有3'－5'，不具5'－3'外切活性）。原核細(xì)胞已發(fā)現(xiàn)有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，都與DNA鏈的延長有關(guān)。DNA聚合酶I是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA的延長；DNA聚合酶II則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān)；DNA聚合酶III在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長的主要酶。DNA聚合酶DNA聚合酶（DNApolymerase）是細(xì)胞復(fù)制DNA[1]聚合作用：在引物-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸從5‘→3’的順序加上去。[2]3‘→5’外切酶活性（校對作用）：從3‘→5’方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。[3]5‘→3’外切酶活性（切除修復(fù)作用）：從5‘→3’方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5‘-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部分（雙鏈）磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5’→3‘。[4]焦磷酸Ppi水解作用：催化3‘末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機(jī)焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。[5]焦磷酸交換作用：催化dNTP末端的Ppi同無機(jī)焦磷酸的交換反應(yīng)?！?】和【5】都要求有較高濃度的PPi，體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。DNA聚合酶的功能[1]聚合作用：在引物-OH末端，以dNTP為底物，按模板D大腸桿菌DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ（DNApolⅡ）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ（DNApolⅢ）Klenow片段T4-DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶TaqDNA聚合酶pfuDNA聚合酶原核DNA聚合酶的種類大腸桿菌DNA聚合酶原核DNA聚合酶的種類1、5`3`聚合酶活性：以DNA為模版，在dNTP和鎂離子的存在下，催化單核苷酸結(jié)合到引物分子的3`-OH末端，沿5`3`方向合成DNA。2、5`3`外切酶活性：可以從5`端降解雙鏈DNA，使之成為單核苷酸，也可降解DNA:RNA雜交體中的RNA成份，即擁有RNA酶H活性。需要5`端游離的磷酸基團(tuán)3、3`5`外切酶活性：從3`-OH末端降解單鏈或雙鏈DNA分子，降解產(chǎn)物為單核苷酸，當(dāng)有dNTP存在時，5`3`聚合酶活性抑制3`5`外切酶活性。DNApolI具有3種酶活性，在基因工程中常用作制備探針。大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）1、5`3`聚合酶活性：以DNA為模版，在dNTP和鎂離子用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大腸桿菌DNA聚合酶I為兩個蛋白質(zhì)片段，其中較小的片段具有5`3`外切酶活性，較大的片段具有5`3`聚合酶和3`5`外切酶活性，稱為Klenow片段。Klenow片段的功能：1、補(bǔ)平粘性末端2、標(biāo)記末端3、合成cDNA第二鏈4、用于Sanger雙脫氧末端終止法的DNA序列分析5、合成雜交探針Klenow片段常用功能用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大腸桿菌DNA聚合酶I為兩個蛋2基因工程-工具酶匯總課件DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApolⅠ不是DNA復(fù)制的主要聚合酶。1970年發(fā)現(xiàn)了DNApolⅡ。此酶MW為120KD，每個細(xì)胞內(nèi)約有100個酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。DNApolⅡ的功能：⑴聚合作用：該酶催化DNA的聚合，但是對模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙（gap）的單鏈DNA部分，而且該單鏈空隙部分不長于100個核苷酸。⑵該酶也具有3'→5'外切酶活性，但無5'→3'外切酶活性。⑶該酶對作用底物的選擇性較強(qiáng)，一般只能將2-脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。⑷該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，可能在DNA的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。大腸桿菌DNA聚合酶II（DNApolII）DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApolⅠ不是DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3'→5'外切酶活性的最適底物是單鏈?zhǔn)荄NA，只產(chǎn)生5'-單核苷酸，不會產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從3'端開始切除一個核苷酸。5'→3'外切酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用于雙鏈區(qū)。DNApolⅢ是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度（nonpermissivetemperature）內(nèi)是不能生長的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶Ⅲ則可以恢復(fù)其合成DNA的能力。大腸桿菌DNA聚合酶III（DNApolIII）DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ相似，也是一條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，它至少含有15個半胱氨酸殘基。T4DNA聚合酶的作用與大腸桿菌DNApolI不同[1]它無5'→3'外切酶活性[2]它需要一條有引物的單鏈DNA作模板[3]它利用單鏈DNA為模板，也可同時利用它作為引物，3'端的未雜交部分即被T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性切去，然后在其作用下從3'-OH端開始聚合，合成該模板DNA的互補(bǔ)鏈，再以互補(bǔ)鏈為模板合成原來的單鏈DNA。T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ相似，也是一條多肽分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶具有5‘→3'外切酶活性，不存在3’→5’外切酶活性。TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3'加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3'突出的單A核苷酸尾；在僅有dTTP存在時，它可將平端的質(zhì)粒的3'端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3'端突出的單T核苷酸尾。應(yīng)用這一特性，可實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法。耐熱DNA聚合酶---TaqDNA聚合酶從高溫嗜熱菌（Pyrococcusfuriosis）中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可校正PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的錯誤，使產(chǎn)物的堿基錯配率極低。PCR產(chǎn)物為平端，無3'端突出的單A核苷酸。耐熱DNA聚合酶---pfuDNA聚合酶分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，核糖核酸酶(Ribonuclease,Rnase)是一類催化RNA降解為小片段的核酸酶。在所有已研究的有機(jī)體中都含有大量不同類型的核糖核酸酶，表明RNA降解是一個非常原始而且重要的過程。除了幫助清除細(xì)胞內(nèi)不再需要的RNA，RNase同時也參與了所有RNA分子的成熟過程，其中既包含了攜帶遺傳物質(zhì)用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的信使RNA，也包含了細(xì)胞內(nèi)功能多樣的各種非編碼RNA。核糖核酸酶可劃分為核糖核酸內(nèi)切酶（endoribonucleases）和核糖核酸外切酶（exoribonucleases）