質(zhì)粒DNA的提取、定量與酶切鑒定

一、實驗?zāi)康?、掌握PCR基因擴(kuò)增的原理和操作方法；2、掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法；3、了解紫外吸收法檢測DNA濃度和純度的原理、方法；4、學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳操作。二、實驗原理.PCR：PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA為模板，特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，在體外復(fù)制DNA的過程。①延伸：溶液反應(yīng)溫度升至中溫72℃，在Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點，模板DNA的一條單鏈在解鏈和退火之后延伸為一條雙鏈；②變性：加熱使模板DNA在高溫下90℃-95變性，雙鏈解鏈；③退火：降低溶液溫度，使合成引物在低溫(35—70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右)，與模板DNA互補退火形成部分雙鏈。.質(zhì)粒DNA的提取與定量一一堿裂解法：A、基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異；B、高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性;

C、當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心形成沉沉淀去除。D、定量檢測原理：物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng)；而且物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的；各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜。.酶切鑒定：利用限制性內(nèi)切酶。4、瓊脂糖凝膠電泳：A、瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度；B、DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動；C、DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶（遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系）。三、材料與方法：（一）、材料1、樣品：菌液（大腸桿菌DH5a菌株）、引物、2*PremixTaq、滅菌離子水、含pMD19-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a2、試劑：LB培養(yǎng)基、AXYGEN試劑盒（溶液S1、S2、S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脫液EB）、電泳指示劑、Gelview、TBE、瓊脂糖、DNAMarker50（、無菌水、10*M酶切緩沖液BufR、HindIII（15U/ul）、EcoRI（12U/ul）3、儀器與器材：PCR儀、臺式離心機、微量加樣槍、滅菌的薄壁離心管、凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、臺式離心機、紫外分光光度計（二）、方法1、PCR:步驟 實際操作將裝有配好的反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管置于臺式離心機中離心取0.2mlPCR反應(yīng)管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑試劑 體積（口L）TOC\o"1-5"\h\z滅菌去離子水 5.52*PremixTaq 12.5引物1 1引物2 1菌液 5將PCR反應(yīng)管放入PCR儀中，約1小時30分鐘。2、質(zhì)粒DNA的提取與定量:

3、酶切鑒定:實際操作步驟實際操作在一個潔凈的L5ml的EP管中按順序依次加入以下以下試劑試劑 體積⑴1)TOC\o"1-5"\h\z無菌水 9.010*M酶切緩沖液BufR 2.0質(zhì)粒DNA 7.0HindIII(15U/u1) 1.0EcoRI(12U/u1) 1.0用移液槍輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡），37℃水浴1.5h4、瓊脂糖凝膠電泳:凝膠準(zhǔn)備一膠床準(zhǔn)備一鋪膠一靜置一膠床置于電泳槽中一加電泳緩沖液一拔梳子一上

樣一電泳一取出凝膠一拍照四、結(jié)果與討論：（一）、結(jié)果：1、質(zhì)粒樣本吸光度記錄：測定次數(shù)DNA濃度（ug/ml）A260/A28011091.6421111.6631111.70平均值1101.672、第四個電泳實驗本組選取的是質(zhì)粒以及PCR目的條帶。由上圖可見，本組的質(zhì)粒與PCR目的條帶的電泳結(jié)果均比較模糊。（二）、討論：1、結(jié)果1.6<A260/A280<1.8,說明樣品中仍含有蛋白質(zhì)或者酚,但結(jié)果仍在正常范圍之內(nèi)，說明該數(shù)值可用于接下來的計算。2、根據(jù)電泳結(jié)果顯示：質(zhì)粒呈3個條帶，PCR產(chǎn)物是1個條帶。條帶較其他結(jié)果較模糊，說明所提取的質(zhì)粒DNA濃度較低。根據(jù)DNAMarker泳道，可知所提取的質(zhì)粒DNA大小約為3000bp，是較為準(zhǔn)確的。思考題：1、堿法提質(zhì)粒中溶液1、11、111、的作用？答：溶液I的作用是溶菌。溶液中含有溶菌酶、EDTA,溶菌酶能溶解細(xì)菌的肽聚糖細(xì)胞壁，因而具有溶菌作用。EDTA可以螯合金屬離子，抑制脫氧核酸酶對DNA的降解作用，同時EDTA還可以加強溶菌酶的溶菌效果。溶液H的主要作用是：提高堿環(huán)境，使染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性；溶液中的SDS可以溶解細(xì)胞膜，解聚核蛋白并且結(jié)合蛋白質(zhì)形成復(fù)合物使蛋白質(zhì)沉淀下來。溶液HI起緩沖液的作用，調(diào)節(jié)Ph至中性使質(zhì)粒DNA復(fù)性；溶液還提供了高鹽環(huán)境，有