藥敏試驗的質量控制培訓課件

藥敏試驗的質量控制復旦大學附屬華山醫(yī)院抗生素研究所葉信予deb_ye@126.com藥敏試驗質量控制的目的保證細菌的鑒定和藥敏結果在臨床診斷和治療中的準確性和可靠性滿足疾病診斷和治療的要求，實事求是地反映檢驗標本的客觀存在與國際資料具有可比性室間質控

（externalqualitycontrol）是由外部機構控制實驗室質量的客觀過程。內容：病原菌鑒定、藥物敏感試驗目的：比較差異、改進措施、確定培訓需求、客觀 證據、支持實驗室認可、增加實驗室信心、 監(jiān)督工具國內外權威機構：國內：衛(wèi)生部臨床檢驗中心、上海臨床檢驗中心 等國際：WHO/CDC─抗菌藥物敏感性試驗質控 英國─環(huán)球微生物學質控 美國─CAP質控室內質控

（internalqualitycontrol)保證檢驗質量的高水平實驗室工作人員的素質微生物檢驗的標準操作（細菌鑒定、藥敏試驗）標本取材、登記、采集檢測儀器的性能培養(yǎng)基、試劑質量、保質期標準菌株藥物敏感性試驗測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑制作用的方法世界衛(wèi)生組織推薦：常規(guī)的藥敏方法為紙片瓊脂擴散法（K-B紙片瓊脂擴散法）科研方面主要為稀釋法，包括液體稀釋法（試管法、微量法）和瓊脂稀釋法分子生物學方法、酶試驗K-B紙片瓊脂擴散法是一種定性試驗：S、I、R操作簡便，常規(guī)工作中最常應用影響因素多存在一定局限性稀釋法肉湯稀釋法常量（大量）肉湯稀釋法（試管法）微量肉湯稀釋法瓊脂稀釋法是一種定量方法，結果精確操作繁瑣，要求嚴格E-test法定量方法操作簡便，容易觀察價格昂貴分子生物學法測遺傳耐藥機制如PCR檢測葡萄球菌mecA基因等其他還有核酸雜交等方法酶試驗測生化耐藥機制。如碘量法、酸量法、Nitrocefin法等測β-內酰胺酶。ESBLs、AmpC酶檢測等。β-內酰胺酶試驗陽性：可快速預報嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉氏菌對青霉素、氨芐青和羥氨芐青霉素耐藥。葡萄球菌對青霉素及氨基、羧基和酰脲基青霉素類藥物的耐藥性。紙片片瓊瓊脂脂擴擴散散法法如果果僅僅僅僅基基于于抑抑菌菌環(huán)環(huán)的的有有無無，，而而不不考考慮慮抑抑菌菌環(huán)環(huán)的的大大小小，，則則無無法法檢檢測測抗抗菌菌藥藥物物的的敏敏感感性性。。只有有將將檢檢測測方方法法和和抑抑菌菌環(huán)環(huán)直直徑徑測測量量標標準準化化的的方方法法相相結結合合進進行行試試驗驗，，才才能能獲獲得得可可信信的的結結果果。。必須須采采用用CLSI推薦薦的的標標準準操操作作方方法法進進行行試試驗驗，，才才能能獲獲得得可可重重復復的的結結果果。。紙片片瓊瓊脂脂擴擴散散法法的的影影響響因因素素技術術人人員員的的操操作作培養(yǎng)養(yǎng)基基藥敏敏紙紙片片接種種物物制制備備試驗驗操操作作孵育育條條件件、、溫溫度度和和時時間間藥敏敏結結果果讀讀取取質控控菌菌株株技術術人人員員應經經過過訓訓練練能進進行行檢檢驗驗能熟熟練練使使用用儀儀器器有評評價價檢檢驗驗結結果果有有效效性性的的能能力力細心心、、用用心心、、責責任任心心培養(yǎng)養(yǎng)基基水解解酪酪蛋蛋白白瓊瓊脂脂（（M-H瓊脂脂））：：最最適適用用于于常常規(guī)規(guī)藥藥敏敏測測試試非非苛苛養(yǎng)養(yǎng)菌菌的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基。。原因因：：藥敏敏試試驗驗顯顯示示了了可可接接受受的的批批間間重重復復性性。。其含含有有影影響響磺磺胺胺、、甲甲氧氧芐芐啶啶和和四四環(huán)環(huán)素素敏敏感感性性試試驗驗結結果果的的抑抑制制劑劑濃濃度度低低。。能使使絕絕大大多多數數非非苛苛養(yǎng)養(yǎng)菌菌生生長長良良好好。。已積積累累了了用用此此培培養(yǎng)養(yǎng)基基進進行行的的敏敏感感性性測測試試的的大大量量數數據據和和經經驗驗。。培養(yǎng)養(yǎng)基基苛養(yǎng)養(yǎng)菌菌：：需需加加入入營營養(yǎng)養(yǎng)添添加加劑劑5%脫纖纖維維羊羊血血MH瓊脂脂含SR158生長長因因子子的的HTM培養(yǎng)養(yǎng)基基GC瓊脂脂基基質質+1%規(guī)定定的的生生長長添添加加劑劑培養(yǎng)養(yǎng)基基pH值：：室室溫溫條條件件下下7.2-7.4之間間。。因因此此必必須須在在凝凝固固之之后后檢檢測測檢測測方方法法：：浸漬漬足足夠夠多多的的瓊瓊脂脂完完全全掩掩蓋蓋pH機電電極極的的尖尖端端少量量的的瓊瓊脂脂在在燒燒杯杯中中凝凝固固在在pH機電電極極的的尖尖端端的的周周圍圍使用用表表面面電電極極培養(yǎng)養(yǎng)基基pH值小小于于7.2，變變化化會會顯顯著著改改變變一一些些藥藥物物的的抑抑菌菌環(huán)環(huán)大大小小氨基基糖糖苷苷類類、、克克林林霉霉素素、、大大環(huán)環(huán)內內酯酯類類及及喹喹諾諾酮酮類類抑抑菌菌環(huán)環(huán)變變小小青霉霉素素、、四四環(huán)環(huán)素素抑抑菌菌環(huán)環(huán)變變大大pH值大大于于7.4，會會出出現現相相反反的的結結果果培養(yǎng)養(yǎng)基基胸苷苷或或胸胸腺腺嘧嘧啶啶：：過量量可可以以逆逆轉轉磺磺胺胺類類和和甲甲氧氧芐芐啶啶的的抑抑制制作作用用，，從從而而產產生生更更小小、、更更不不清清楚楚的的抑抑菌菌環(huán)環(huán)，，甚甚至至沒沒有有抑抑菌菌環(huán)環(huán)的的出出現現，，可可能能導導致致錯錯誤誤的的耐耐藥藥報報告告糞腸腸球球菌菌ATCC29212，用用復復方方新新諾諾明明紙紙片片測測試試，，滿滿意意結結果果為為清清晰晰、、鮮鮮明明的的抑抑菌菌環(huán)環(huán)，，直直徑徑≥≥20mm培養(yǎng)養(yǎng)基基二價價陽陽離離子子：：鈣和和鎂鎂離離子子：：影影響響氨氨基基糖糖苷苷類類和和四四環(huán)環(huán)素素對對銅銅綠綠假假單單胞胞菌菌的的藥藥敏敏結結果果。。含量量過過高高，，抑抑菌菌環(huán)環(huán)變變小小含量量過過低低，，抑抑菌菌環(huán)環(huán)變變大大鈣離離子子含含量量的的變變化化也也會會影影響響達達托托霉霉素素的的藥藥敏敏結結果果含量量過過低低，，抑抑菌菌環(huán)環(huán)變變小小含量過高，抑抑菌環(huán)變大過量的鋅離子子可使碳青霉霉烯類抑菌環(huán)環(huán)變小培養(yǎng)基平板厚度一定定要標準，，達到4mm厚度9cm平板傾注瓊脂脂量25-30ml；15cm平板需60ml左右同一平板內的的瓊脂要均一一厚度濕度：使用時，瓊脂脂的表面應是是潮濕的，但但不能有液滴滴出現在培養(yǎng)養(yǎng)基的表面或或平板蓋子上上有效期：7天儲存溫度：2-8℃藥敏紙片可靠的供應商商：OXOID、BD紙片應當同時時至少有一個個分析說明的的紙片批號和和濃度的證書書，并能提供供用推薦的質質控細菌進行行質控的數據據藥物含量必須須符合CLSI規(guī)定的濃度藥敏紙片紙片的儲存：：藥敏紙片的外外包裝可以確確保適當的無無水條件紙片應冷凍在在-20℃或以下的冰冰箱內，密封封保存。除了了因工作需要要而少量冷藏藏外（最多冷冷藏一個星期期），尤其是是含β-內酰胺類藥物物、不穩(wěn)定藥藥物（如亞胺胺培南、頭孢孢克洛、克拉拉維酸復合劑劑）一旦藥敏紙片片從密封的包包裝中取出，，必須放置在在一個完全密密封干燥的容容器中儲存藥敏紙片藥敏紙片的使使用使用前從冰箱箱內取出并除除去密封包裝裝，平衡至室室溫。這樣可可以最大限度度地減少熱空空氣接觸冷的的紙片時產生生冷凝水只使用沒有超超過制造商表表明的有效期期的紙片，丟丟棄過期的紙紙片藥敏紙片接種物制備濁度標準：0.5麥氏濃度標準準，相當(1-2)××108個菌落形成單單位(CFU)/ml。接種物濃度過過高，會導致致某些β-內酰胺類藥物物耐藥校準方法肉眼觀察比濁濁：應在足夠夠的光線下貼貼靠著有白色色背景和對比比黑線的比色色卡比較接種種管和0.5麥氏濃度標準準管BaSO4濁度標準管：：625nm處的吸光度值值為0.08-0.10，每次使用需需要充分震蕩蕩，每個月更更換商品化的乳膠膠懸浮液：每每次使用之前前上下顛倒混混勻，有效期期內使用光學濁度儀接種物制備細菌生長曲線線遲緩期：菌體體增大，代謝謝活躍，為細細菌的分裂增增值合成、儲儲備足夠的酶酶、能量及中中間代謝產物物，1-4h對數期：此期期細菌形態(tài)、、染色、生物物活性都很典典型，對外界界環(huán)境因素的的作用敏感，，抗菌素作用用對該時期的的細菌效果最最佳,8-18h穩(wěn)定期：此期期細菌形態(tài)、、染色、生物物活性可出現現改變，并產產生相應的代代謝產物衰亡期：生理理代謝活動趨趨于停滯接種物制備制備方法直接菌落懸浮浮法：最方便便的方法。可可用于大多數數細菌。從16-18h培養(yǎng)的瓊脂平平板（應選用用非選擇性培培養(yǎng)基，如血血平板）上挑挑取數個單個個菌落直接接種到肉肉湯或生理鹽鹽水制成菌懸懸液，調整菌菌懸液至0.5麥氏。接種物制備制備方法生長法：無法法用上述方法法制備菌懸液液的情況下選選用。從瓊脂平板上上選擇3-5個形態(tài)相同的的單個菌落，，用接種環(huán)或或無菌拭子將將菌落轉移至至含有4-5ml合適的肉湯培培養(yǎng)基的試管管中，如胰蛋蛋白酶大豆肉肉湯。在35℃孵育培養(yǎng)，，直到達到或或超過0.5麥氏濃度（通通常2-6h）濁度。用無菌生理鹽鹽水或肉湯調調整新鮮生長長的肉湯懸液液的濁度到0.5麥氏濃度。試驗操作接種平板：調整好濁度的的菌懸液最好好在15min內將無菌棉簽簽浸取，同時時在管壁上出出去棉簽上多多余的液體用拭子劃線整整個瓊脂表面面，接種于表表面干燥的MHA平板上，每次次旋轉平板約約60°，以確保每次次接種均勻分分布，最后在在瓊脂平板的的邊緣涂抹一一圈蓋子可半開3-5min，但不可超過過15min，以便放置藥藥敏紙片前，，使瓊脂吸收收表面多余的的水分試驗操操作放置紙紙片：：將預先先設定定好并并已經經平衡衡至溫溫度的的藥敏敏紙片片分置置在已已接種種細菌菌的瓊瓊脂表表面每個紙紙片必必須壓壓下以以確保保與瓊瓊脂表表面完完全接接觸。。無論論是單單獨放放置或或使用用紙片片分配配設備備，紙紙片必必須分分布均均勻，，兩紙紙片圓圓心的的距離離不少少于24mm最好在在預期期的產產生小小的抑抑菌環(huán)環(huán)的紙紙片旁旁邊放放置產產生大大的抑抑菌環(huán)環(huán)的紙紙片，，以避避免重重疊區(qū)區(qū)紙片距距離瓊瓊脂邊邊緣的的距離離同樣樣重要要，如如果太太靠近近邊緣緣，抑抑菌環(huán)環(huán)可能能不完完整，，建議議距離離平板板邊緣緣15mm。藥敏紙紙片一一旦與與瓊脂脂表面面接觸觸，就就不可可再移移動放置紙紙片后后15min內倒置置平板板進行行培養(yǎng)養(yǎng)試驗操操作孵育溫溫度：：（35±2）℃孵育條條件：：除嗜嗜血桿桿菌、、淋病病奈瑟瑟菌、、腦膜膜炎奈奈瑟菌菌和鏈鏈球菌菌外，，孵育育不需需要CO2CO2濃度變變化會會顯著著改變變一些些藥物物的抑抑菌環(huán)環(huán)大小小孵育時時間：：16-18h測試苯苯唑唑西林林或萬萬古霉霉素對對葡萄萄球菌菌屬，，或萬萬古霉霉素對對腸球球菌屬屬的敏敏感性性，孵孵育時時間必必須達達到24h細菌接種物準備方法接種培養(yǎng)基紙片數量培養(yǎng)溫度(℃)5%CO2培養(yǎng)時間（小時）100mm150mm一般需氧菌直接菌落懸浮法，生長法MHA51235±2不需要16-18肺炎鏈球菌和其他鏈球菌直接菌落懸浮法5%羊血MHA4935±2，不超過37需要20-24流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌直接菌落懸浮法含SR158因子的HTM4935±2需要16-18腦膜炎奈瑟菌直接菌落懸浮法5%羊血MHA2535±2，不超過37需要20-24淋病奈瑟菌直接菌落懸浮法GC瓊脂基質+1%規(guī)定的生長添加物4936±1，不超過37需要16-18平板結結果判判讀培養(yǎng)后后的平平板觀觀察細菌的的涂布布是否否滿意意接種是是否正正確產生的的抑菌菌環(huán)是是否均均勻為為圓形形菌苔是是否融融合生生長如果可可見單單個菌菌落，，說明明接種種量過過稀，，必須須重復復試驗驗平板結結果判判讀測量方方法：：用肉眼眼判讀讀，測測量完完全抑抑制區(qū)區(qū)的直直徑，，包括括紙片片的直直徑采用游游標卡卡或尺尺子在在培養(yǎng)養(yǎng)基的的背面面測量量將培養(yǎng)養(yǎng)基放放在一一個黑黑色不不反光光的背背景上上，并并用反反射光光觀察察如使用用血平平板，，應除除去蓋蓋子并并用反反射光光照射射，在在瓊脂脂的上上方測測量抑抑菌環(huán)環(huán)抑菌圈圈直徑徑閱讀讀—游標卡卡尺抑菌圈圈直徑徑閱讀讀—直尺平板結結果判判讀測量直直徑沒有肉肉眼可可見的的明顯顯的生生長區(qū)區(qū)即可可認為為抑菌菌圈邊邊緣。。只能能在放放大鏡鏡下觀觀察到到的細細小菌菌落忽忽略不不計。。在一個明顯顯抑菌環(huán)內內有分散的的菌落生長長時，應該該從原始菌菌落移種后后重新測試試。如分散散的菌落依依然在抑菌菌環(huán)內生長長，則應測測量無菌落落的抑菌環(huán)環(huán)內徑。變形桿菌屬屬細菌可遷遷徙生長到到某種抗菌菌藥物抑菌菌環(huán)內，忽忽略明顯的的抑菌環(huán)內內薄紗樣遷遷徙生長。。測量血平板板上的抑菌菌環(huán)時，測測量的是生生長抑菌圈圈，而不是是溶血抑制制圈。測量含甲氧氧芐啶和磺磺胺類藥物物的抑菌圈圈時，忽略略少量生長長，測量比比較明顯的的邊緣，以以確定抑菌菌環(huán)的直徑徑。細菌藥敏紙片孵育時間觀察結果金黃色葡萄球菌苯唑西林和萬古霉素24h用透射光（平板舉向光源）來檢查明顯抑菌環(huán)內有無耐藥菌落的少量生長，抑菌環(huán)內任何區(qū)域出現可辨別的生長都判為苯唑西林或萬古霉素耐藥頭孢西丁16-18h讀取時使用反射光葡萄球菌屬利奈唑胺16-18h讀取直徑是用透射光，抑菌環(huán)內任何區(qū)域出現可辨別的生長都判為耐藥腸球菌屬萬古霉素24h用透射光仔細檢查抑菌環(huán)內是否有菌落生長，出現任何菌落意味著耐藥結果解釋根據CLSI推薦的判斷斷標準，報報告細菌對對抗菌藥物物的敏感性性有判斷標準準：敏感、、中介、耐耐藥只有敏感的的折點：敏敏感同屬細菌不不同種判斷斷標準可能能不同不可能出現現的藥敏現現象金葡菌：青青霉素S,苯唑西林R，萬古霉素素R腸桿菌科細細菌：第三三代頭孢菌菌素R，第一、第第二代頭孢孢菌素S嗜麥芽窄食食單胞菌：：出現碳青青霉烯類S藥敏質控目的藥敏試驗過過程的精密密度（可重重復性）和和準確度在試驗中所所作用的試試劑的性能能。進行實驗和和結果判定定操作者的的工作情況況。責任制造商：確確保制造出出合適的產產品實驗室：確確保試驗很很好地維護護和執(zhí)行方法標準菌株質控標準菌菌株使用精心挑挑選的質控控標準菌株株實驗在可接接受的標準準內操作進進行檢測結果可可靠每個質控菌菌應從認可可的來源處處獲得（美美國標準菌菌庫，ATCC）適用于抗菌菌藥物和標標準方法（（CLSI推薦）質控標準菌菌株分類：日常檢測質質控菌株：：確保檢測測系統(tǒng)正常常運行，并并且檢測結結果在制定定的范圍內內大腸埃希菌菌ATCC25922金黃色葡萄萄球菌ATCC25923等補充的質控控菌株：用用于評價某某一特定情情況下實驗驗或者檢測測系統(tǒng)的特特性，或稱稱為備用質質控菌株嗜血桿菌ATCC10211肺炎克雷伯伯菌ATCCBAA-1705等質控標準菌菌株檢測和儲存存使用和檢測測臨床分離離株相同的的材料和方方法，按照照標準紙片片瓊脂擴散散法，來檢檢測質控菌菌株合理儲存和和維護，確確保質控菌菌具有可接接受的性能能儲存菌株：：長期貯存存，可用Microbank,40%甘油肉湯、、脫纖維羊羊血或脫脂脂牛奶，于于-70℃℃低溫度保存存。半儲存菌株株：使用中中的質控菌菌應貯存在在胰大豆瓊瓊脂（非苛苛養(yǎng)菌）或或營養(yǎng)豐富富的巧克力力瓊脂斜面面（苛養(yǎng)菌菌），4-8℃℃保存，每周周傳代一次次。應用菌株：：每次使用用前應把半半儲存菌株株傳代到相相應的平皿皿上使其獲獲得單個菌菌落。質控標準菌菌株防止質控菌菌株的變異異保存菌株應應加保護液液（脫脂奶奶粉或甘油油）盡量減少轉轉種次數，，一般不要要超過6次孵育時間不不要超過對對數期避免菌種被被污染不要從藥敏敏試驗的瓊瓊脂平板上上取細菌使使用如果出現無無法解釋的的結果表明明細菌的天天然敏感性性已經改變變，需要制制備新的原原代培養(yǎng)物物質控菌株生物特性紙片瓊脂擴散法其他大腸埃希菌ATCC25922β-內酰胺酶陰性非苛養(yǎng)革蘭陰性菌腦膜炎奈瑟菌大腸埃希菌ATCC35218含質粒編碼的TEM-1β–內酰胺酶（非ESBL）β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑復合物流感嗜血桿菌ATCC49247β-內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株嗜血桿菌嗜血桿菌ATCC49766氨芐西林敏感嗜血桿菌（對某些β-內酰胺類更有代表性）肺炎克雷伯菌ATCC700603含SHV-18型ESBLESBL篩選和確證實驗銅綠假單胞菌ATCC27853含誘導的AmpC非苛養(yǎng)革蘭陰性菌評價每批MH培養(yǎng)基中陽離子含量適合性金黃色葡萄球菌ATCC25923β-內酰胺酶陰性mecA陰性非苛養(yǎng)革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC43300苯唑西林耐藥，mecA陰性頭孢西丁紙片肺炎鏈球菌ATCC49619青霉素結合蛋白改變導致青霉素中介肺炎鏈球菌其他鏈球菌腦膜炎奈瑟菌常用質控菌菌株Q：沙門菌屬細細菌在進行行紙片法藥藥敏試驗時時應該選擇擇哪種ATCC標準菌株？？A：1.銅綠假單胞胞菌ATCC278532.金黃色葡萄萄球菌ATCC259233.肺炎克雷伯伯菌ATCC7006034.大腸埃希菌菌ATCC352185.大腸埃希菌菌ATCC25922（√）Q：為什么大腸腸埃希菌ATCC35218會出現氨芐芐西林耐藥藥，氨芐西西林/舒巴坦敏感感？A：因為大腸埃埃希菌ATCC35218會產生β-內酰胺酶，，所以氨芐芐西林對其其沒有抗菌菌作用而表表現為耐藥藥，但舒巴巴坦為β-內酰胺酶的的酶抑制劑劑，可抑制制大腸埃希希菌ATCC35218產生的β-內酰胺酶，，因此又恢恢復抗菌活活性，因此此氨芐西林林/舒巴坦表現現為敏感。。質控菌株的的傳代及使使用新儲存物或或凍存物用合適的培培養(yǎng)基與適適宜的孵育育條件進行行傳代培養(yǎng)養(yǎng)（首次傳傳代）正確傳代培培養(yǎng)、孵育育和保存質質控菌株。。用分離的的單個菌落落作為第1天道第7天的試驗用用質控菌。。每天準備新新的傳代培培養(yǎng)物（從從第1天試驗用培培養(yǎng)物分離離）。相應應的菌株類類型保存在在適宜的溫溫度下。每每天測試工工作日使用用新鮮的試試驗用培養(yǎng)養(yǎng)物。重復試驗至至第3周和第4周。第4周后，丟棄棄傳代培養(yǎng)養(yǎng)物并重新新溶解新儲儲存物或凍凍存物中以以獲取質控控菌株。備注：1.冷凍或凍干干培養(yǎng)物傳傳代兩次后后使用。2.進行質控試試驗，選擇擇從試驗用用培養(yǎng)物中中分離的單單個菌落。。3.如果污染或或疑有問題題，準備新新的首次傳傳代物、測測試用培養(yǎng)養(yǎng)物，或者者獲取新的的凍存物。。4.某些菌株有有必要每兩兩周重新準準備新的傳傳代物（如如銅綠ATCC27853，肺鏈ATCC49619）藥敏質控頻率每日測試：：連續(xù)檢測每每種抗菌藥藥物/細菌組合所所獲得的30個結果中，，只要3個以下超出出C