法醫(yī)物證學(xué)第十二章血痕檢驗(yàn)1

第十二章血痕檢驗(yàn)血痕檢驗(yàn)需要解決的問(wèn)題送檢檢材是否是血痕。如果是血痕，是人血還是動(dòng)物血。若是人血，則測(cè)定遺傳標(biāo)記進(jìn)行個(gè)人識(shí)別同時(shí)進(jìn)行其他諸如出血量、出血時(shí)間及出血部位推斷等問(wèn)題。第一節(jié)概述血液在人體外干燥后所形成的斑跡稱為血痕(bloodstains)。血痕檢驗(yàn)是法醫(yī)物證檢驗(yàn)中最常遇到和最重要的項(xiàng)目。凡在兇殺、斗毆、搶劫、盜竊、碎尸、災(zāi)害事故等現(xiàn)場(chǎng)，致傷物、受害人與嫌疑人的衣服上發(fā)現(xiàn)的可疑血液或血痕均要進(jìn)行檢驗(yàn)。一、血痕的特點(diǎn)血痕是最常見(jiàn)的物證檢材。多數(shù)情況下表示有人受傷。根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)血痕的分布、形狀等情況，可以推斷案件的性質(zhì)。可以分析罪犯和被害人之間的相互位置關(guān)系，有無(wú)搏斗過(guò)程等重要線索。犯罪嫌疑人身上、可疑兇器和其他物體上沾有被害人的血液，常為重要物證。在現(xiàn)場(chǎng)和被害人的身上可能遺留罪犯的血痕，對(duì)案件的偵破極為重要。案例－公安局長(zhǎng)殺妻案

李昌鈺曾在夏威夷遇到一個(gè)案子。丈夫是公安局分局長(zhǎng)，有一天報(bào)案說(shuō)誤殺了妻子。他說(shuō)，妻子大怒，從車窗跳了下去。他想穩(wěn)住車，可一倒車，發(fā)現(xiàn)軋了妻子。

李昌鈺到后先檢查肇事車，可車身、車輪子上什么都沒(méi)有，車底下反而有血跡，而且是旋轉(zhuǎn)型的，這證明出血物體曾在車下旋轉(zhuǎn)。死者臉上有一個(gè)五角形傷口，我在車底盤(pán)上找到了一個(gè)形狀相同的螺絲釘。分局長(zhǎng)先打死了妻子，制造了肇事現(xiàn)場(chǎng)。

血液的降解、污染和腐敗過(guò)程十分迅速。離開(kāi)機(jī)體的時(shí)間越長(zhǎng)，血液成分的改變?cè)酱?。尤其是大分子的抗原蛋白質(zhì)和DNA破壞會(huì)增加血痕個(gè)體識(shí)別的難度。血痕的檢驗(yàn)方法比臨床檢驗(yàn)復(fù)雜，比新鮮血液檢驗(yàn)更加困難。血痕越陳舊，檢驗(yàn)的陽(yáng)性率越低。二、痕檢驗(yàn)的目的和要求血痕檢驗(yàn)需要解決以下問(wèn)題：①提取和送檢的可疑斑痕是否是血痕。②血痕是人血還是動(dòng)物血。③確定人血后，檢測(cè)血液的遺傳標(biāo)記，進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。④其他檢驗(yàn)，如血痕的性別、出血量、出血時(shí)間及出血部位推斷等。血痕檢驗(yàn)程序肉眼檢查預(yù)試驗(yàn)確證試驗(yàn)種屬試驗(yàn)遺傳標(biāo)記測(cè)定其他檢驗(yàn)第二節(jié)肉眼檢查部位1.室外

2.室內(nèi)

3.嫌疑人身體

4.嫌疑人衣服

5.可疑兇器:斧錘類縫隙處剪刀類折疊式刀類

顏色鮮紅色暗紅色紅褐色褐色綠褐色灰褐色腐?。旱G褐色、污綠色區(qū)別：醬油、油漆、色素、顏料、染料形狀：1.滴狀：因高度及方向而異；同等量血液落下時(shí)，落差越高，形成的斑點(diǎn)越大，周緣的小突起也越多。鋸齒狀突起指示行走方向，突起大小多少---行走速度2.流柱狀：血液從身體高位流向低位時(shí)形成，一般由靜脈出血引起----體位3.噴濺狀：似感嘆號(hào)，尖端是噴射方向---受傷時(shí)位置4.擦拭狀：染有血液的物體或出血部位與其他物體接觸磨擦后形成----死后移尸5.血印痕：染有血液的部位直接與某物體接觸形成。血指紋、血掌紋、血鞋印、血足印、兇器印痕6.血泊：原始現(xiàn)場(chǎng)不同高度滴狀血痕血滴方向流注狀血痕范圍：取決于出血量。出血量常與死亡原因及受傷后存活時(shí)間等有關(guān)。雨淋日曬洗滌影響因素細(xì)菌深色衣物有色物質(zhì)---油漆、顏料、醬料、泥土動(dòng)物血痕第三節(jié)血痕預(yù)試驗(yàn)?zāi)康模阂獜拇罅靠梢裳壑泻Y除不是血痕的檢材。原理：血痕中的血紅蛋白或正鐵血紅素具有過(guò)氧化物酶活性，能使過(guò)氧化氫分解成水和新生態(tài)氧，后者使加入的化學(xué)物質(zhì)氧化成有色物質(zhì)。方法：聯(lián)苯胺試驗(yàn)、酚酞試驗(yàn)、鄰聯(lián)甲苯胺試驗(yàn)、魯米諾試驗(yàn)、孔雀綠試驗(yàn)、氨基比林試驗(yàn)、愈創(chuàng)木酯試驗(yàn)。性質(zhì)：篩選試驗(yàn)。優(yōu)缺點(diǎn)：靈敏度高、特異性差、假陽(yáng)性率高、直接破壞檢材。一、聯(lián)苯胺試驗(yàn)Benzidinetest原理:H2O2

Hb/hematinPoH2O+

無(wú)色[O]藍(lán)色聯(lián)苯胺聯(lián)苯胺藍(lán)方法：剪取或刮取微量檢材置于白瓷反應(yīng)板上，或用濾紙輕擦斑痕。依次滴加冰醋酸、聯(lián)苯胺無(wú)水乙醇飽和液各1滴。1~2min后無(wú)藍(lán)色反應(yīng)，再加3%過(guò)氧化氫1滴，立即出現(xiàn)藍(lán)色為陽(yáng)性反應(yīng)。若不出現(xiàn)藍(lán)色，為陰性反應(yīng)。特點(diǎn)：靈敏度極高，血液稀釋50萬(wàn)倍，極微量血痕即可出現(xiàn)陽(yáng)性（+）。陰性（-）可否定血痕/血痕已被完全破壞。兩類干撓物質(zhì)：氧化劑：鐵銹、高錳酸鉀…生物源物質(zhì)：植物、蔬菜、水果、膿液、鼻涕、組織浸液…二、其他預(yù)試驗(yàn)（一）酚酞試驗(yàn)Hb

H2O2H2O+O還原酚酞氧化酚酞在堿性溶液中（紅色）（無(wú)色）（無(wú)色）（二）無(wú)色孔雀綠試驗(yàn)原理：新生態(tài)氧將無(wú)色孔雀綠氧化成孔雀綠。第四節(jié)確證試驗(yàn)確證試驗(yàn)(conclusivetest)的目的是要確證檢材是否為血，主要依據(jù)是檢測(cè)檢材中是否含有血紅蛋白或其衍生物。陽(yáng)性結(jié)果可確證檢材為血痕。

特異性強(qiáng)，靈敏度不高陰性不能否定血痕，只能說(shuō)未發(fā)現(xiàn)血痕。血色原結(jié)晶試驗(yàn)方法：氯化血紅素結(jié)晶試驗(yàn)光譜分析一、血色原結(jié)晶試驗(yàn)原理：血色原結(jié)晶試驗(yàn)又稱高山結(jié)晶試驗(yàn)(Takayamacrystaltest)。血紅蛋白在堿性溶液中分解為正鐵血紅素和變性珠蛋白。在還原劑作用下，正鐵血紅素還原為血紅素，同變性珠蛋白和其他含氮化合物(如吡啶、氨基酸等)結(jié)合形成血色原結(jié)晶。血色原結(jié)晶試驗(yàn)的試劑又稱高山試劑，由10%氫氧化鈉3ml，30％葡萄糖10ml，吡啶3ml混合組成。方法：剪取或刮取少量檢材，置載玻片上，用針?lè)蛛x成細(xì)纖維，蓋上蓋玻片，加1～2滴高山試劑，室溫下靜置10min后鏡檢。出現(xiàn)櫻桃紅色星狀、菊花狀或針狀結(jié)晶，即為陽(yáng)性。不出現(xiàn)結(jié)晶，為陰性反應(yīng)。血色原結(jié)晶試驗(yàn)最大的特點(diǎn)是特異性好，目前未發(fā)現(xiàn)任何其他物質(zhì)，經(jīng)過(guò)同樣處理，能形成該櫻桃紅色結(jié)晶。凡試驗(yàn)陽(yáng)性可以肯定是血痕。試驗(yàn)的缺陷是靈敏度低，血液經(jīng)過(guò)稀釋200倍就難以得到典型的血色原結(jié)晶，陰性結(jié)果沒(méi)有意義。經(jīng)過(guò)水洗、雨淋或變性、腐敗、陳舊的血痕陽(yáng)性檢出率低。高山試劑久置易失效，每次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)強(qiáng)調(diào)作已知血痕的陽(yáng)性對(duì)照。二、氯化血紅素結(jié)晶試驗(yàn)原理：氯化血紅素結(jié)晶試驗(yàn)(Teichmanncrystaltest)。血紅蛋白受酸性作用，分解產(chǎn)生正鐵血紅素，其與氯離子反應(yīng)成氯化血紅素結(jié)晶。方法：取檢材少許置玻片上，分離成纖維狀。加氯化鈉少許，用玻棒壓碎并與檢材混合，蓋上蓋玻片，滴加冰醋酸1～2滴，在酒精燈上微加熱，至出現(xiàn)一二個(gè)小氣泡時(shí)即移開(kāi)，待冷卻后鏡檢。有褐色菱形或針狀結(jié)晶為陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性可確證為血痕。試驗(yàn)的特異性好，但靈敏度低。三、吸收光譜檢查有色物質(zhì)能吸收一定波長(zhǎng)的光線，日光經(jīng)過(guò)被檢測(cè)物質(zhì)，其中某些特定波長(zhǎng)的光線被吸收，光譜上便出現(xiàn)黑色吸收線條。血液中主要成分血紅蛋白及其衍生物均為有色物質(zhì)，對(duì)光線具有很強(qiáng)的選擇性吸收能力。根據(jù)這種特性在分光鏡下檢查有無(wú)特定的吸收線，可確證檢材是否是血痕。第五節(jié)種屬試驗(yàn)?zāi)康模捍_定血痕是否為人血。原理：通過(guò)檢測(cè)人的種屬特異性指標(biāo)確證檢材為人血。方法：免疫學(xué)方法（沉淀反應(yīng)、ELISA），生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法（血紅蛋白聚丙烯凝膠電泳、人類基因組中種屬特異的DNA序列的PCR檢測(cè)）。注意：現(xiàn)場(chǎng)提取的檢材中非人類的生物性斑痕的干擾。明確血痕是人血還是動(dòng)物血，必要時(shí)還需確定是哪種動(dòng)物血。血痕的種屬試驗(yàn)是血痕鑒定的一個(gè)關(guān)鍵，因?yàn)閯?dòng)物血中含有某些與人血液遺傳標(biāo)記類似的物質(zhì)，如A及B抗原，若不進(jìn)行種屬鑒定，直接測(cè)定血痕的ABO血型，可誤將動(dòng)物血判斷為人血，造成錯(cuò)案。即使采用DNA分析作個(gè)人識(shí)別，仍必須確定血痕是人血后才能做DNA分型檢測(cè)。五、種屬檢驗(yàn)沉淀環(huán)試驗(yàn)抗原抗體反應(yīng)瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電滲電泳酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)----ELISA法

PAGIEF法膠體金標(biāo)記McAb-Hb試紙法

一、沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)(precipitationreaction)是一種經(jīng)典的免疫反應(yīng)?？扇苄钥乖c相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)抗原抗體比例適合時(shí)可形成肉眼可見(jiàn)的抗原抗體復(fù)合物沉淀?？乖贵w比例適當(dāng)是沉淀反應(yīng)的關(guān)鍵。如果抗原過(guò)剩，不利于抗原抗體復(fù)合物之間交聯(lián)，不易形成穩(wěn)定的不溶性抗原抗體復(fù)合物，不出現(xiàn)沉淀反應(yīng)。如果抗體過(guò)剩，游離抗原決定簇迅速被大量的單個(gè)抗體分子結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物之間也難交聯(lián)形成大的抗原抗體復(fù)合物，表現(xiàn)為弱沉淀反應(yīng)。(一)抗血清制備血痕的種屬鑒定常采用人的血紅蛋白和人的血清蛋白免疫動(dòng)物而獲得相應(yīng)的抗血清，即抗人血紅蛋白血清和抗人血清蛋白血清。1．種屬特異性指抗體只對(duì)某一物種的組織、細(xì)胞、血清、體液、或分泌液發(fā)生特異反應(yīng)的特性，而對(duì)其它種屬動(dòng)物的蛋白均不發(fā)生反應(yīng)。2．器官特異性指抗體只對(duì)某一器官成分發(fā)生特異反應(yīng)，與其他器官蛋白均不發(fā)生反應(yīng)的特性。3．交叉反應(yīng)抗體除與誘發(fā)其產(chǎn)生的相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)外，與其它的抗原也發(fā)生交叉反應(yīng)。產(chǎn)生的原因：

(1)人與動(dòng)物血清蛋白有共同的抗原。

(2)人與有些動(dòng)物血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)差異小。如恒河猴的血紅蛋白與人的血紅蛋白只相差12個(gè)氨基酸，其中α鏈相差4個(gè)，β鏈相差8個(gè)。常見(jiàn)的交叉反應(yīng)包括近親反應(yīng)和類屬反應(yīng)。抗血清的交叉反應(yīng)可采取以下方法加以減弱或消除：①用吸收法除去交叉反應(yīng)性抗體。用不同動(dòng)物血清吸收粗制抗人血清后，抗血清的特異性不同程度地提高，但抗血清的效價(jià)會(huì)下降。②稀釋抗原。將抗原溶液稀釋500～l0000倍，可以消除非特異性交叉反應(yīng)。因?yàn)橐话惴翘禺愋钥乖?jīng)過(guò)稀釋50～200倍后，很難出現(xiàn)沉淀反應(yīng)。通常類屬反應(yīng)容易消除，近親反應(yīng)難以消除。(二)血痕浸出液的制備1．血痕浸出液的制備取血痕檢材0.5cm2，剪碎置試管內(nèi)，加0.5ml生理鹽水，浸泡血痕2～12h。血痕浸出液的基本要求是澄清，透亮，淡稻草黃色。離心沉淀，吸取上清作沉淀反應(yīng)。陳舊血痕的蛋白不易溶解，可適當(dāng)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。2.為避免抗原過(guò)剩，應(yīng)稀釋血痕浸出液，要求浸出液中的蛋白含量在0.1%以下。粗略測(cè)定：①觀察浸出液的顏色，淡稻草黃色相當(dāng)于0.1%；②猛烈震蕩試管內(nèi)的浸出液，若產(chǎn)生的氣泡能維持?jǐn)?shù)10秒，蛋白濃度約0.1%。（三）影響沉淀反應(yīng)的因素溫度、PH、離子強(qiáng)度、抗原抗體的濃度和比例等。（四）環(huán)狀沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體相遇且比例合適時(shí)，形成抗原抗體復(fù)合物，在抗原與抗血清的界面出現(xiàn)可見(jiàn)的白色沉淀清環(huán)。方法：反應(yīng)管中加入抗血清，將血痕浸出液用毛細(xì)吸管屈疊于抗血清上，保持兩液界面清晰，室溫靜置1小時(shí)內(nèi)觀察結(jié)果。若兩液界面出現(xiàn)白色沉淀環(huán)為陽(yáng)性反應(yīng)。兔>人HB血清兔血清人血痕檢材檢材對(duì)照動(dòng)物血痕二、抗人血紅蛋白膠體金試驗(yàn)原理：膠體金將抗體免疫球蛋白吸附在表現(xiàn)，形成一種標(biāo)記了該免疫球蛋白的“探針”，用此探針可以結(jié)合相對(duì)應(yīng)的抗原?？贵w標(biāo)記后的膠體金稱為免疫膠體金。膠體金顆粒呈紅色，當(dāng)免疫膠體金顆粒結(jié)合對(duì)應(yīng)的抗原后，再與抗原相應(yīng)的抗體結(jié)合，免疫膠體金顆粒便被滯留而富集，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅色，據(jù)此判斷陽(yáng)性或陰性反應(yīng)。方法：取少量血痕樣本用蒸餾水浸泡，使浸泡夜微帶黃色。取出試紙條，在加樣區(qū)(s)加3～5滴浸出液或?qū)⒃嚰垪l的加樣區(qū)(S)浸于待檢樣本的浸泡液中5～10s，靜置3～5min觀察結(jié)果：反應(yīng)區(qū)中的檢測(cè)線和質(zhì)控線出現(xiàn)兩條紅色區(qū)帶為陽(yáng)性結(jié)果。只有質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色區(qū)帶為陰性結(jié)果，無(wú)帶出現(xiàn)表明可能操作失誤或試紙條失效，應(yīng)重復(fù)測(cè)試三、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)是一種固相酶免疫分析法。原理：用血痕浸液包板，加兔抗人IgG作為第一抗體，再加酶標(biāo)羊抗兔抗體作為第二抗體，加底物顯色。若為人血痕，則人IgG與第一抗體結(jié)合后，再與第二抗體結(jié)合形成復(fù)合物，底物顯色呈陽(yáng)性反應(yīng)。若是動(dòng)物血痕，因第一抗體與酶標(biāo)的二抗都結(jié)合不上去，沒(méi)有免疫復(fù)合物形成，再加底物時(shí)，因沒(méi)有酶的作用而不顯色，為陰性反應(yīng)。方法：將血痕浸出液點(diǎn)于醋酸纖維素膜上包被，干燥。加3％H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用pH7.4，0.05mol／LPBS-Tween20洗滌，用2％人或牛血清蛋白封閉1h。洗滌后，加兔抗人IgG作為第一抗體反應(yīng)1h，洗去游離抗體，加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體(二抗)反應(yīng)1h。洗滌后，加含0.03%H2O2的0.05％DAB顯色液，37℃孵育30～60s，觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中以人的血痕浸液作陽(yáng)性對(duì)照，以檢材無(wú)血痕處浸液作為陰性對(duì)照，呈褐色反應(yīng)者為陽(yáng)性結(jié)果，顏色與陰性對(duì)照組相似者為陰性結(jié)果。四、DNA檢驗(yàn)

(一)根據(jù)Alu序列作種屬鑒定哺乳類動(dòng)物細(xì)胞DNA有一種中度重復(fù)序列，重復(fù)單位長(zhǎng)約300bp。其中在170bp附近有限制性內(nèi)切酶Alu切割的AGCT序列，命名為“Alu'’家族。Alu序列為人和靈長(zhǎng)類所特有，具有種屬特異性。對(duì)血痕檢材用PCR擴(kuò)增Alu家族進(jìn)行檢測(cè)，可作為種屬鑒定。引物序列：

Alu9.1

5'-GGCACTTTGGGAGGCCAAGG-3’

Alu9.2

5'-TACAAGCTTGTGCCACCATGC

CCAAC-3’擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳，可獲得DNA長(zhǎng)度為130bp的特異性條帶。牛、大鼠、蛙、鯽魚(yú)等的擴(kuò)增片段大于130bp，且擴(kuò)增產(chǎn)量非常少。除